Summary
식물은 현재의 표현 패러다임을보다 더 확장 가능한 비용 효율적이고 안전 상업적 규모에 제약 단백질의 생산을위한 새로운 시스템을 제공합니다. 본 연구에서는, 우리는 포함하는 대상 유전자를 소개하는 간단하고 편리하면서도 확장 가능한 접근 방법을보고
Abstract
포유류 세포 배양 인간 백신과 치료 단백질의 상업 생산을위한 주요 플랫폼입니다. 그러나, 제한된 확장 성 및 높은 비용으로 인해 의약품에 대한 증가하는 세계적 수요를 충족 할 수 없습니다. 식물은 강력하고, 확장 성, 저렴한 비용과 안전한 가장 유망한 대체 의약품 생산 플랫폼 중 하나가 될 것으로 나타났습니다. 바이러스 기반 벡터의 최근 발전은 식물에서 재조합 단백질의 신속하고 높은 수준의 일시적인 표현을 허용했다. 또한 과도 발현 시스템의 유틸리티를 최적화하기 위해, 우리는이 연구에서 식물 조직에 표적 유전자가 포함 아그로 박테 리움을 소개하는 간단하고 효율적이며 확장 가능한 방법을 보여줍니다. GFP와는 DsRed, 우리의 결과는 방법은 잎 두 형광 단백질의 강력한 생산에 아그로 박테 리움의 효율적인 도입에 성공 주사기, 진공 모두에 해당 agroinfiltration을 나타냅니다. 또한,우리는 두 가지 방법으로 제공하는 독특한 장점을 보여줍니다. 주사기 침투가 간단하고 고가의 장비를 필요로하지 않습니다. 또한 유연성 하나 표적 유전자의 전체 휴가를 침투하거나 하나의 잎에 여러 대상의 유전자를 도입 할 수 있습니다. 따라서,이 재조합 단백질의 실험실 규모의 발현뿐만 아니라 수확량 또는 식 속도론에 대해 서로 다른 단백질이나 벡터를 비교하는 데 사용할 수 있습니다. 주사기 침투의 단순함은 생명 공학의 주제에 대한 고등학교와 대학 교육의 실용성을 제안한다. 반면, 진공 침투는 더 강력하고 제약 단백질의 상업적 제조를위한 스케일 업 할 수 있습니다. 그것은 또한 양상추와 애기 장대와 같은 주사기 침투에 대한 의무가없는 식물 종을 agroinfiltrate 할 수 있다는 장점을 제공합니다. 전반적으로, 주사기 및 진공 agroinfiltration의 조합은 연구자와 교육자를 제공하는, 간단하고 효율적이며 강력한과도 단백질 발현을위한 방법론. 그것은 크게 제약 단백질의 개발을 촉진하고 과학 교육을 추진합니다.
Introduction
1970 년대 이후, 식물 재조합 단백질 및 단백질 치료제 1의 상업 생산을위한, 포유 동물 곤충 및 세균 세포 배양에 대한 대안으로 모색되고있다. 바이오 의약품의 표현을위한 식물 기반 시스템은 임상 시험에서 성공을 보여, 고셔병의 질병 2, 조류 H5N1 독감 3과 같은 질병에 대한 몇 가지 새로운 치료법으로 최근 몇 년 동안 약속을 보여 주었다. 이러한 초기 실험 이후 수십 년 동안 공장에서 재조합 단백질 발현 능력 메커니즘의 개발은 세 가지 주요 이유로 단백질 생산의 현재 패러다임을 변경하는 식물 기반 시스템의 가능성을 만들었습니다. 첫째, 포유류 곤충, 및 세균 바이오 리액터 상당한 초기 비용, 비싼 성장 매체와 하류 정화 4 복잡한 과정을 필요로 비용 주목할만한 감소가있다. 안정적인 형질 전환 식물의 생성라인은 또한 단백질 발현 식물이 재배 농업 규모 5에 수확 할 수로 다른 표현 시스템의 확장 성을 능가 할 수 있습니다. 둘째, 식물 기반의 발현 시스템은 크게 공공 안전 6 우수성을 보여주는, 인간 단백질 발현 호스트에서 사람 또는 동물 병원체 전송의 위험을 줄일 수 있습니다. 마지막으로, 식물은 당화와 여러 소단위 단백질 7의 조립을 포함한 단백질의 적절한 번역 후 수정을 허용하는, 포유 동물 세포와 유사한 진핵 endomembrane 시스템을 사용합니다. 이 기능은 더 복잡한 구조를 가지고 광범위한 전사 후 수정 또는 어셈블리 8가 필요 단클론 항체 (드을) 등의 제약 재조합 단백질의 넓은 수 있기 때문에, 박테리아와 같은 원핵 생물 시스템에 따라 그 앞두고 식물 기반 시스템을 넣습니다.
두 가지 주요 APPRO이 있습니다식물에서 재조합 단백질을 발현에 아파. 첫 번째는 대상 단백질 코딩 DNA가 발현 카세트에 복제 및 핵 또는 엽록체 게놈 중 하나에 도입 안정적으로 형질 전환 라인의 개발이다. 이 과정에서 외국의 DNA가 다음 세대를 통해 유전되고 지금까지 다른 발현 시스템 1을 넘어, 엄청난 확장 성이 향상 할 수 있습니다. 핵 게놈에 외래 DNA의 도입은 일반적으로 조직 9 microprojectile 폭격에 의해, 덜 자주, 식물 조직의 아그로 박테 리움 감염에 의해 달성되거나. 식물 호르몬은 그 차별화와 뿌리와 잎 같은 형질 전환 식물 조직의 성장을 유도하는 데 사용됩니다. 엽록체 게놈의 변환은 A. 달성 할 수 없다 DNA로 코팅 박테 리움하지만, 금 또는 텅스텐 입자에 전적으로 의존 식물 세포로 탄도 발사. 재조합을 표현하는 두 번째 방법은식물 NT 단백질은 과도 표현을 통해 10입니다. 이 시나리오에서, 관심의 유전자를 품고 바이러스 유래 벡터는 A. 통해 전달됩니다 과정을 통해 완전히 개발 식물 박테 리움은 agroinfiltration을했다. 대신에 식물의 게놈에 통합으로, 전달 된 유전자 구조는 짧은 잠복기 후 수확하고 분리 할 수 있습니다 원하는 단백질의 과도 생산을 지시하기 시작합니다. 식물 agroinfiltration 11 후 약 1-2 주를 수확 할 준비가 일시적인 유전자 발현은 큰 전체 단백질 축적뿐만 아니라 단백질의 생산 시간을 단축의 이점을 제공합니다. 이 1 년 몇 개월이 걸릴 수있는 안정적인 형질 전환 식물 라인의 생성, 선택 및 확인 프로세스보다 훨씬 빠릅니다. 이 유전자 안정적인 공장 리튬을 얻을하지 않으므로 그러나, 이것은 또한 일시적인 발현 시스템의 한계입니다대규모 상업 생산을위한 종자 은행을 생성 할 수 있습니다 NES. 그럼에도 불구하고, 접근 방식은 대규모의 일시적 발현을 개선하기 위해 개발되었습니다. 여기에서 우리는 A.에 의해 전달 해체 바이러스 벡터를 사용하여 과도 단백질 발현은 Nicotiana benthamiana 공장의 생성하는 한 가지 방법을 보여 박테 리움.
두 가지 주요 방법은 A.의 배달을 위해 개발되고있다 식물 조직에 박테 리움 : 진공 챔버를 통해 주사기와 대규모 침투를 통해 벤치 스케일 침투. 두 프로토콜은 N.를 사용하여 여기에 설명되어 있습니다 밀접 일반 담배 공장과 관련된 benthamiana, 두 형광 단백질의 과도 발현 기주 식물로 : 해파리 Aequorea 빅토리아 Discosoma 산호 (는 DsRed) 12,13에서 붉은 형광 단백질의 녹색 형광 단백질 (GFP). N. benthamiana에 대한 가장 일반적인 호스트 식물그것은 유전자 변형 의무가 있기 때문에 재조합 단백질은 빠르게 바이오 매스의 높은 금액을 산출하고, 스케일 업 생산 14 다작 종자 생산자 수 있습니다. N. 사용의 또 다른 이점 단백질 발현을위한 호스트로 benthamiana는 발현 벡터 2.5의 다양한 가용성이다. 본 연구에서는 두 해체 바이러스 성 벡터, 담배 모자이크 바이러스 (TMV) RNA의 replicon 시스템 (MagnICON 벡터)와 빈 노란색 난쟁이 바이러스 (BeYDV) DNA의 replicon 시스템 (geminiviral 벡터) 4,11에서 파생 된 다른 기준으로 한 15-18는 GFP와는 DsRed 유전자를 운반 N.에 그들을 제공하는 데 사용됩니다 A. 통해 benthamiana 세포 박테 리움. 세 DNA의 구조는 GFP 또는 MagnICON 벡터와는 DsRed 표현에 사용됩니다. 그들은 관심의 유전자를 포함하는 모듈 (PICH 5 '대상 유전자 3의 발현 운전 발기인 및 기타 유전 적 요소를 포함하는 모듈 (pICH15879)'을 포함- GFP 또는 PICH-는 DsRed) 및 integrase 모듈 (pICH14011)는 expression 8,15에 5 '와 3'모듈을 함께를 통합하는 효소를 코딩. 세 DNA의 구조는 geminiviral 벡터를 표현 필요합니다. 표적 유전자 (pBYGFP 또는 pBYDsRed)의의 replicon를 포함하는 벡터뿐만 아니라, 복제 단백질 (pREP110)에 대한 코딩 벡터는 대상의 replicon 11,14,16의 증폭이 필요합니다. 또한, 토마토 덤불 스턴트 바이러스에서 침묵 억압 P19 인코딩 벡터의 포함은 높은 수준의 목표 유전자의 발현 11,16 위해 원하는.
식물의 성장, A. 등 agroinfiltration에 의해 식물 세포에 재조합 단백질의 유전자의 도입을위한 세 가지 주요 단계는 일반적으로있다 박테 리움 문화 준비 및 침투. 각 단계마다이 절차의 궁극적 인 성공에 중요한이기 때문에, 따라서 자세한 설명이 제공됩니다주사기 침투 아래 진공 침투 모두.
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Protocol
1. 식물 성장
- 전파 트레이에 위치 60 토탄 펠릿. 수돗물 4 L을 추가하고 토탄 펠릿 2 시간 동안 물을 흡수 할 수 있습니다.
- 2 N. 추가 파종기를 사용하여 각 토탄 펠릿에 benthamiana 씨앗, 투명한 플라스틱 돔 트레이를 커버하고, 그들이 8분의 16 시간 일 / 1 박 사이클 (그림 1A)와 25 ° C, 84 % 습도 환경에서 발아 할 수 있습니다.
- 2 주 파종 후 돔을 제거하고 트레이에서 물을 배수하고, 1.48 g / L (그림 1B)의 농도 잭의 비료 2 L을 추가합니다. 8분의 16 시간 일 / 밤주기 25 ° C, 습도 50 %의 환경에서 식물을 성장하는 것을 계속한다. 잭의 비료 2 L 트레이 당 2 일마다를 제공합니다.
- 그들은 나이가 6 주 (그림에 침투 할 준비가 될 때까지 4 주에서 추가 성장 (그림 1C)에 대한 충분한 공간을 제공하는 6 개 발전소를 호스팅하는 새로운 트레이에 이탄 알약과 식물을 전송1D).
2. A. 박테 리움 문화 준비
주사기 침투 2.1 준비
- 줄무늬 A. geminiviral 벡터 P19, pREP110, pBYGFP 및 카나마이신을 (100 ㎍ / ㎖)이 포함 된 LB 한천 플레이트에 pBYDsRed을 포함 박테 리움 균주 GV3101. 연속 한 판 당 변형 및 48 시간 동안 30 ° C에서 성장.
- 마찬가지로, 줄무늬와 LB 한천에 GV3101 5 MagnICON 벡터 숨겨 변종 '모듈 (pICH15879)를, 3'GFP 나는 DsRed (PICH-GFP 또는 PICH-는 DsRed)의 표적 유전자를 포함하는 모듈 및 Integrase (pCH14011)을 성장 carbenicillin을 (100 ㎍ / ㎖)이 포함 된 접시.
- LB 한천 플레이트에 하나의 식민지에서 YENB 미디어 3 ㎖ (0.75 % Bacto 효모 추출물, 0.8 % 영양소 국물, NaOH를 7.5로 산도를 조정)에 geminiviral 벡터를 품고 GV3101 균주를 접종 + 카나마이신 (100 ㎍ / ㎖)의 15 mL 둥근 바닥 문화 관, ° C에서 30 액체 문화를 성장300 RPM의 회전 속도와 하룻밤 셰이커.
- 마찬가지로, 접종 30시 흔드는 하룻밤에 YENB 미디어 + carbenicillin (100 ㎍ / ml)에 MagnICON 벡터를 품고 GV3101 긴장 ° C. 성장
- 분광 광도계 적절한 항생제로 YENB 미디어 10ml에 0.025의 시작 OD 600 새로운 문화에 대한 계대 배양 할 필요가 볼륨 (V 이하)를 계산하려면 아래 공식을 사용하여 각 액체 문화를 측정하고 기록한다 OD 600 값 .
V 이하 (ML) = (10 ㎖) × (0.025) / OD 600 - 에 하룻밤 문화의 양도 V 이하 (ML) (10 - V 이하) 각 변형에 대한 적절한 항생제 YENB 미디어 ML. 새로운 문화 30 하룻밤 250 RPM의 회전 속도와 셰이커 ° C OD 600 값이 1.7-2.0의 범위가 될 때까지. 성장
- 측정하고 기록 OD 각각의 액체 배양 600 값을 계산기에 아래 수식을 사용각 변형에 대해 0.12의 최종 OD 600을 제공하기 위해 침투 버퍼의 50 ML에 희석 할 필요 체적 (V INF)을 ulate.
V INF (ML) = (50 ML) × (0.12) / OD 600 - 전송 V microcentrifuge 관에 각 문화의 INF (ML)과 2 분 12,000 XG에서 원심 분리하여 세포를 스핀 뜨는 제거하고 (10 MM MES, 산도 5.5 10 ML 침투 버퍼에 세포를 resuspend을, 10 mM의 황산 마그네슘 4) 잠시 텍싱 있습니다.
- 혼합 pBYGFP + pREP110 + P19의 세포를 재 부유, 2 분 12,000 XG에서 세포를 스핀 다운, 그리고 침투 버퍼의 50 ML의 총에 resuspend을. 이 Agrobacteria 조합은 GFP의 geminiviral 표현입니다.
- 마찬가지로, Agrobacteria 세포의 다음과 같은 조합을 혼합 스핀 다운 및 침투 버퍼의 50 ML에서 그들을 resuspend을. 그들은 다음을 포함한다 (1) pBYDsRed + pREP110는 DsRed의 geminiviral 표현, (2) pBYGFP + pBYDsRed + pREP110에 대한 + P19GFP와는 DsRed, (3) pREp110 GFP의 MagnICON 식 (5)에 대한 geminiviral 식의 부정적인 컨트롤과 + P19, (4) PICH-GFP + pICH15879 + pCH14011 PICH -는 DsRed + pICH15879는 +의 공동 발현 geminiviral위한 + P19 MagnICON의는 DsRed의 표현, 그리고 MagnICON 식에 대한 대조군으로 (6) pICH15879 + pCH14011에 대한 pCH14011.
진공 침투 2.2 준비
- 접종과 문화 각 GV3101 50 ML 멸균 플라스크에 적절한 항생제로 YENB 미디어의 15 ML에 geminiviral 벡터 또는 MagnICON 벡터를 포함하는 변형과 성장은 하룻밤 위의 주사기 침투에 대해 설명했다.
- 분광 광도계 적절한 항생제로 YENB 미디어 250 ㎖에 0.025의 시작 OD 600 새로운 문화에 대한 계대 배양 할 필요가 볼륨 (V 이하)를 계산하려면 아래 공식을 사용하여 각 액체 문화를 측정하고 기록한다 OD 600 값 .
V 이하 600 - 전송 V의 하룻밤 문화의 하위 (ML) (250 - V 이하) 각 변형에 대한 적절한 항생제로 1 L 멸균 플라스크에 YENB 미디어의 ML과 하룻밤 위의 주사기 침투에 대해 설명 된 새로운 문화를 성장.
- 측정하고 기록 OD 각각의 액체 배양 600 값을 각 변형에 대해 0.12의 최종 OD 600을 제공하기 위해 침투 버퍼의 3 L에 희석 할 필요 체적 (V INF)를 계산하려면 아래 공식을 사용합니다.
V INF (ML) = (3000 ML) × (0.12) / OD 600 - 펠렛 및 주사기 침투에 대한 설명과 주사기 침투에 대해 설명 된 조합에 따라 재 부유 문화를 혼합으로 침투 버퍼에있는 각 문화를 Resuspend V INF (ML). Repellet 혼합 Agrobacteria 세포 침투 버퍼의 3 L에서 그들을 resuspend을.
3.1 주사기 침투
- 네 6 주 이전 N. 선택 5와 benthamiana 공장은 각각의 잎. 각 공장의 상단부터 시작하는 처음 세 개의 잎은 A.의 조합 중 하나에 완전히 침투 될 것입니다 침투 버퍼의 변종을 박테 리움. 네 번째 잎이 될 것입니다 스포트 침투 geminiviral 표현을위한 네 가지 변형 조합 또는 MagnICON 식에 대한 세 가지 조합. 각 공장의 마지막 잎 부정적인 컨트롤의 조합으로 침투 될 것입니다.
- 잎의 뒷면 (그림 2A)의 표피에 바늘로 작은 흠을 만듭니다. 주의 : 침투 혼합물 Agrobacteria 세포가 잎의 다른 측면에 구멍을 통과하므로, 양쪽을 통해 잎 관통하는만큼 열심히 긁히지 않도록해야합니다.
- 잎의 앞면의 확고한 보류를 가지고 부드러운 적용하는 동안한 손의 엄지 손가락 닉 반대 압력, 니들 (그림 2B)이없는 주사기 닉에 침투 버퍼에있는 아그로 박테 리움 혼합물을 주입. 참고 : 아그로 박테 리움 혼합물 잎의 세포 사이 공간을 입력으로 침투 영역 (그림 2C) 눈에 띄게 어두운 녹색으로 바뀔 것이다.
- 어두운 녹색 원이 확장 멈출 때까지 별명으로 아그로 박테 리움 혼합물을 주입하는 것을 계속한다. 전체 잎이 침투하고 전체 잎의 처음 세 잎 마지막 잎에는 짙은 녹색으로 점등 될 때까지 또 다른 별명 단계를 반복 3.1.2-3.1.4을 만듭니다.
- 각 공장의 네 번째 잎의 경우, 모든 4 개 (geminiviral 벡터) 또는 세 (MagnICON 벡터) 조합은 그것으로 침투 될 것입니다. 아그로 박테 리움 균주의 각 조합에 대해 하나의 별명을 만들고, 하나의 조합으로 각 닉에 침투.
- 침투 한 후, 성장 방 모니 식물을 다시 이동2-15일 포스트 침투 수 (dpi) 간의 토르 단백질 발현.
3.2 진공 침투
- 진공 건조기와 욕조에 아그로 박테 리움 균주를 포함하는 전송 3 L 침투 버퍼에 욕조를 배치합니다. Vacuubrand 다이아 프램 진공 펌프 (그림 3A)을 데시 케이 터에 연결합니다.
- 데시 케이 터 플레이트 (그림 3B)에 거꾸로 공장을 배치하고 전체 잎과 줄기 시스템은 욕조의 꼭대기 휴식 플레이트 침투 버퍼에 빠져들 때까지 식물로 판을 낮 춥니 다. 가장자리를 따라 데시 케이 O 링을 배치하고 챔버 (그림 3C)에 데시 케이 터의 뚜껑을 넣어.
- 진공 펌프를 켜고 진공 100 밀리바에 도달 할 때 타이밍을 시작합니다. 천천히 물속에 잠긴 식물 조직의 틈새 공간에 Agrobacteria의 입학을 허용하는 100 mbar에 1 분 후 데시 케이 터에서 방출 밸브를 엽니 다. 이 단계를 한 책상 외에도 반복좋은 침투을 보장하기 위해 각형 시간입니다.
- 침투 한 후, 데시 케이 터의 공장을 가지고 그 직립 위치에 다시 넣어. 2-15 dpi로 간 성장 방 모니터 단백질 발현에 식물을 다시 이동합니다.
4. 형광 단백질의 검출 및 사진
- 어두운 방에 dpi로, 이동 공장 2에서 시작하여 소형 UV 램프로 침투 잎의 뒷면에 UV 빛을.
- GFP 나는 DsRed의 붉은 형광 녹색 형광을 관찰한다. 는 DsRed는 단파 UV 빛의 밑에 강한 반면 GFP는 장파 자외선에 강한 신호를 제공합니다.
- 아니 플래시 일반 디지털 카메라로 형광 잎의 사진을 가져 가라.
- 관찰 또는 촬영 후 성장 방에 식물을 다시 이동합니다.
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Representative Results
1. 주사기 침투에 의한 형광 단백질의 발현
geminiviral 및 MagnICON - - N.의 두 가지 해체 식물 바이러스 벡터에 의해 - GFP와는 DsRed - 식물 조직에 아그로 박테 리움의 주사기 침투의 효과를 입증하기 위해, 우리는 두 개의 형광 단백질의 발현을 테스트 benthamiana. N.위한 전체 Agrobacteria 포함 geminiviral 벡터로 침투했다 benthamiana 잎, GFP 발현은 빠르면 2와 dpi로부터 UV 빛의 밑에 전체 리프 지역에 관찰 4 dpi로 (그림 4C) 피크 축적에 도달하였습니다. geminiviral 벡터하여이 초기 GFP 발현이 다른 재조합 단백질 14,16,18,19 이전 결과와 일치한다. 반면, MagnICON 벡터 포함 아그로 박테 리움 조합으로 만 5 dpi로 후 GFP 형광을 보여 도달 최대 accumulati에 침투 잎7 dpi로 (그림 4D)에서합니다. 아무 녹색 형광 pREP110의 대조군 아그로 박테 리움 혼합물에 침투 잎에서 관찰되었다 + P19 (그림 4B) 또는 pICH15879 형광의 배경 형광의 결과가 아니다 GFP 유전자에 특정한이었다되었음을 나타내는 + pCH14011 (데이터 미도시) 잎. 절정 축적에서 MagnICON 벡터 발현 GFP의 형광 이전에 다른 재조합 단백질 8,18에 대해 얻은 결과와 유사한 geminiviral 벡터 (그림 4C와 4D)보다 더 강렬하다. 시간적 표현 패턴과는 DsRed의 상대 형광 강도 GFP (데이터 표시되지 않음)의 그것과 비슷합니다. 더 중요한 괴사는 GFP의 구조 (그림 4A)에 침투 잎 관찰되지 않았다. 비슷한 결과는 어느 형광 단백질은 식물 세륨에 매우 독성을 나타내는는 DsRed 발현 식물 관찰되었다LLS. 그러나 닉 사이트에서 지역 괴사가 관찰 그들은 사진의 "구멍"(그림 4)로 등장 하였다. 두 형광 단백질 주사기 스팟 침투와 geminiviral 벡터를 통해 동일한 잎에 표현되었을 때, 그들은 그들이 침투 한 지점 (그림 5)에서 자신의 예상 형광 색상으로 발견되었다. 흥미롭게도, GFP의 공동 침투와 DsRed를 (그림 5) 황색 형광습니다. 는 DsRed 형광의 강도는 같은 잎에 GFP보다 약한 것으로 나타났다. 그러나,이는 DsRed의 약한 표현을 반영하지 않을 수 있지만, UV 빛에 의해 DsRed를의 최적에 미치지 여기에 오히려 때문이다. 전반적으로, 우리의 결과는 주사기 침투 효율적으로 재조합 유전자를 운반 식물의 잎에 Agrobacteria을 소개하고 우리의 표적 단백질의 강력한 표현으로 이어진 보여줍니다. 또한,이 방법은 유연성이에게 수 있다는 증명ITY는 하나의 표적 단백질의 최대 축적 전체 잎에 침투하거나 자신의 표현과 표현의 패턴을 비교하기위한 여러 벡터를 여러 단백질 표적을 탐지 - 침투 할 수 있습니다.
2. 진공 침투에 의한 형광 단백질의 발현
진공 침투는 공장 과도 발현 시스템에서 재조합 단백질의 대량 생산에 사용할 수있는 확장 성 agroinfiltration 방법을 개발하기 위해 조사 하였다. 우리의 결과는 시간적 표현 GFP의 패턴이나 geminiviral 및 MagnICON 벡터에 의해 DsRed를이 침투 방법의 변경에 의해 변경 및 주사기 침투와 비슷 유지되지 않았 음을 나타냅니다. 식물의 전체 촬영이 진공 침투시 침투 혼합물에 빠져들되기 때문에, 형광 침투 식물의 잎에 대한 GFP (그림 6)에서 관찰되었다. 주사기 침투와 비교해, 더 강력 할 수 있습니다 교류매우 짧은 시간 프레임 각 공장의 hieve 침투. 예를 들어, 주사기 침투 한 전체 6 주 이전 N.에 숙련 된 학생의 15 분 소요 benthamiana 공장. 반면, 같은 공장 완성하고 여러 식물을 동시에 침투 할 수있는 처음부터 진공 청소기를 이용하여 3 분에 침투 할 수 있습니다.
그림 1. N. 0 (A)에서 토탄 펠릿과 성장 쟁반 benthamiana 공장 성장. 야생형 식물, 2 (B), 파종 후 4 (C)와 6 (D) 주.
그림 2. N. 주사기 침투 benthamiana 잎아그로 박테 리움의와 함께. A.의 GV3101 스트레인 GFP - 표현 MagnICON 벡터를 품고 박테 리움이 침투 버퍼에 재 부유와 바늘없는 주사기에로드 된. 별명은 6 주 오래된 식물 잎 (A)의 뒷면에 바늘로 만들었습니다. 주사기의 개통은 닉 (B) 및 침투 버퍼 Agrobacteria가 닉 (C)를 통해 잎의 세포 사이 공간에 주입에 위치 하였다.
그림 3. N.의 진공 침투 benthamiana은 아그로 박테 리움을 남긴다. A.의 변형 GV3101 대상 단백질 발현 벡터를 포함 박테 리움은 infiltratio에 현탁 하였다n 개의 버퍼와 3 L 욕조에로드. 욕조는 다음 진공 펌프 (A)에 연결된 진공 건조기에 배치되었다. 6 주 오래 된 공장은 데시 케이 터 플레이트 (B)에 거꾸로 배치했다. 플레이트 챔버 (C) 위에 배치 된로 전체 잎과 줄기 시스템은 다음 욕조에 잠긴되었다. Agroinfiltration은 1 분 동안 두 번 100 밀리바에서 진공을 적용하고 출시하여 달성되었다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 4. 주사기에 GFP의 발현은 잎 agroinfiltrated. 전체 N. benthamiana 잎은 A.의 변형 GV3101에 침투했다 geminiviral (A와 C) 또는 MagnICON VECT에 GFP 유전자를 품고 박테 리움또는 (D). 음성 대조군 잎은 그 GFP 유전자 (B)를 포함하지 않는 Agrobacteria 균주로 침투 하였다. 잎은 4 dpi로 (AC) 또는 7 dpi로 (D)에서 백색광 (A) 또는 자외선 (BD)에서 촬영되었다.
그림 5. GFP의 표현과 주사기 DsRed를 스팟 agroinfiltrated 잎. N. benthamiana 잎 GV3101은 DsRed를 GFP, 또는 geminiviral 벡터에 GFP와는 DsRed 유전자 모두를 숨겨 가진 반점 - 침투했다. 음성 대조군 자리는 pREP110 + P19으로 침투했다. 잎은 4 dpi 해상도에서 UV 빛의 밑에 촬영 하였다.
그림 6. 진공 agroinfil에서 GFP의 발현했다 trated 잎. N. benthamiana 잎은 GV3101은 MagnICON 벡터에 GFP 유전자를 품고으로 침투 하였다. 잎은 7 dpi 해상도에서 UV 빛의 밑에 촬영 하였다.
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Discussion
단백질 기반의 의약품에 대한 증가하는 요구는 전 세계적으로 강력하고, 확장 성, 저렴한 비용과 안전한 새로운 생산 플랫폼을 필요로합니다. 식물은 제약 단백질 생산을위한 가장 유망한 대체 생산 시스템 중 하나가 될 것으로 나타났습니다. 최근 몇 년 동안, 해체 바이러스 기반 벡터의 개발은 크게 속도와 식물 발현 시스템 2,10의 수율을 향상 식물에서 단백질의 일시적인 표현을 사용하고있다. 또한 과도 발현 시스템의 유틸리티를 최적화하기 위해, 우리는 식물 조직에 표적 유전자가 포함 아그로 박테 리움을 소개하는 간단하면서도 효율적이고 확장 가능한 방법을 보여줍니다. 우리의 결과는 방법은 식물의 잎과 두 개의 형광 단백질 GFP와는 DsRed의 강력한 생산에 아그로 박테 리움의 효율적인 도입에 결과가 주사기 나 진공 하나에 해당 agroinfiltration을 나타냅니다.
efficie을 보장하기 위해NT를 agroinfiltration과 단백질 생산은 다음과 같은 중요한 매개 변수를 신중하게 제어해야합니다. 이러한 매개 변수의 편차가 낮은 agroinfiltration 효율 및 회전, 낮은 표적 단백질 발현 될 수 있습니다.
1. 식물 발달 단계 및 건강. 실험실 사이에이 방법에서 가장 가능성이 변수는 침투 용 식물 소재입니다. 식물은 표현형과 유사한 나타날 수 있지만, 자신의 발달 단계와 생리 상태는 크게 재조합 단백질을 표현하는 자신의 능력에 영향을 미친다. 식물의 성장과 단백질 발현 수준에 영향을 미칠 특정 매개 변수는 온도, 습도, 빛의 강도, 비료 공급, 식물의 접종 연령, 잎 침투 후 목적 단백질의 최대 축적에 필요한 시간을 포함. 식물은 지속적으로 매일 물과 비료의 동일한 금액을 받아야합니다. 식물 성장 조건의 사소한 변화는 크게 최종 SIZ를 변경할 수 있습니다식물과 재조합 단백질을 표현하는 능력의 전자. 우리의 이전 연구는 자연의 빛 아래에서 자란 식물보다 잎 바이오 매스를 굴복 나타냅니다 만, 단백질 수율은 인공 조명 4에서 재배보다 훨씬 적습니다. 따라서 인공 조명을 사용하면 식물의 성장에 대한 선택의 방법입니다. 우리의 결과는 보여 그 25 16 시간 빛 / 8 시간 어두운주기 ± 0.5 ° C는 N. 성장을 최적의 조건이다 같은 인공 조명 4 아래 benthamiana 공장. 우리는 바이오 매스 생산량이 적절한 동안 그들은 형광 단백질의 높은 수준을 생산하고 이러한 조건에서, 6 주 식물 GFP와는 DsRed 표현을위한 최적의 연령 있다는 것을 보여 주었다. 6 주 이전의 식물은 더 많은 바이오 매스를 생산하지만, 침투 실 (4)에 맞게 너무 높이입니다. 또한, 꽃 부정적인 재조합 단백질 발현 4에 영향을 미치는 성장을 6 주 후 개발을 시작합니다. 따라서, 6 주 식물은 최적의 L를 포함바이오 매스 수율, 단백질 축적 및 agroinfiltration의 용이성의 결합 필요성을 균형을 전기로 재료.
2. 성장과 아그로 박테 리움의 침투 농도. 이 방법의 또 다른 중요한 점은 성장과 A.의 침투 농도 컨트롤 로 OD 600에 의해 측정 박테 리움. A. 각각의 문화와 하위 문화 단계에서 균주 리움은로 성장해야하지만 지정된 OD 600. 우리는 A. 여러 농도를 검사하지 N.의 최종 침투에 대한 박테 리움 benthamiana 4 잎. 낮은 아그로 박테 리움의 농도가 낮은 단백질 발현에 이르는 식물에 표적 유전자의 부족 배달됩니다. 아그로 박테 리움의 침투 농도가 너무 높은 경우 반면에, 그것은 침투 조직에 과민 반응을 유발하고 괴사 20로 이어집니다. 우리의 연구esults는 OD 600 = 0.12 아그로 박테 리움 균주는 조직 괴사 및 세포의 죽음을 유발하지 않고 유전자 구조의 최대 전송의 필요성을 균형 것을 보여 주었다. 아그로 박테 리움의 원하는 OD 600 밀도는 일관된 배지, 온도, 배양 시간을 사용하여 얻을 수 있습니다.
3. 진공 침투의 경우, 지정된 진공 압력과 침투 시간을 따라하는 것이 중요합니다. 우리의 결과는 아그로 박테 리움 침투 혼합 한 3 L 욕조가 약 30 식물에 침투하는 데 사용할 수 있음을 나타냅니다. 30 개 이상의 식물이 침투해야하는 경우, 아그로 박테 리움 침투 혼합물의 새로운 배치가 공급되어야합니다.
4. 본 논문에서 제시하는 특정 매개 변수 N을 사용하여 단백질의 발현에 최적화되어 있습니다 특정 조건 하에서 재배 benthamiana 공장은 해체 바이러스 기반의 벡터 위에서 설명했다. 앞에서 언급했지만, t이 방법으로 제어하는 그는 가장 어려운 매개 변수는 식물 소재입니다. 우리는 식물과 우리가 여기에서 설명하는 모든 경우 4,8,14,18,21-23에서 우수한 결과를 얻을 침투 프로 시저를 사용하여 백신과 치료 단백질의 다양한 표현했다. 이러한 결과는 우리가 개발 한 조건이 단백질 발현을위한 최적 것을 보여 주었다. 그러나, 만약 다른 호스트 식물 종, 발현 벡터, 또는 다른 N. Benthamiana 성장 조건이 침투 사용 하였다,이 방법론의 각 매개 변수는 실험에 의해 다시 최적화 할 필요가있다.
전반적으로, 우리는 주사기 및 진공 agroinfiltration 재조합 단백질의 과도 발현 식물에 아그로 박테 리움을 들고 표적 유전자를 소개하는 간단하면서도 효율적인 방법임을 증명하고있다. 두 가지 방법 연구 및 생산의 목표에 따라 고유 한 장점이있다. 주사기 침투가 requir의 간단에스 아그로 박테 리움 문화 단지 소량 고가 펌프 및 진공 챔버를 필요로하지 않습니다. 이 보고서에서 알 수 있듯이, 그것은 하나의 대상 유전자와 전체 잎에 침투하거나 하나의 잎에 여러 대상의 유전자를 소개하는 자리 침투을 사용하려면 두 유연성을 가지고 있습니다. 전체 잎 침투 방법은 생화학 적 특성, 정화, 및 전임상 기능 연구 1 재조합 단백질의 작은 실험실 규모의 표현을 사용할 수 있습니다. 대조적으로, 현장 침투는 식물에 자신의 항복, 표현 동력학 및 독성을 비교 한 잎에 여러 단백질 표적을 표현하는 데 사용할 수 있습니다. 그것은 또한 GFP로 한 기자 단백질의 발현을 비교하는 데 사용하거나 동일한 잎에 다른 발현 벡터에 의해 구동 DsRed를 할 수 있습니다. 그 결과로, 단백질의 축적과 표현 속도론 운전에 다른 벡터의 능력을 특성화 할 수 있습니다. 주사기 침투의 단순함은 또한 수가능한 도구는 고등학교 생물 공학 및 유전 공학의 주제에 학부 학생들을 가르치고 교육 할 수 있습니다.
주사기 침투에 비해, 진공 침투 진공 펌프 및 챔버 아그로 박테 리움 문화의 큰 볼륨의 투자를 필요로합니다. 몇 가지 식물이 침투 할 필요가있을 때 따라서 선택의 방법은 아닙니다. 그러나 주사기 침투에 의해 일치 할 수없는 확장 성을 제공합니다. 그것은 더 강력하고 시간의 짧은 기간에 식물의 큰 숫자를 침투 할 수 있습니다. 본 보고서에 제시된 규모로, 우리는 단계 I 인간적인 임상 시험 4에 충분한 제약 단백질을 정제 그램 수준을 생성 할 수 있습니다. 또한,이 과정은 식물에서 의약품 단백질의 상업 생산에 대한 스케일 업 할 수 있습니다. 예를 들어, 프로세스는 N. 세 가지 톤의 침투 진공 청소기로 청소하도록 설계되고있다 시간당 benthamiana 공장스케일 업 작업 이십사인치 진공 침투의 또 다른 장점은 주사기 침투에 대한 의무가없는 식물 종을 agroinfiltrate하는 데 사용될 수 있다는 것입니다.
요약하면, 주사기 및 진공 침투의 조합은 연구원, 생물 공학자와 교육자 식물에서 재조합 단백질의 과도 표현을위한 간단하고 효율적 강력하고 확장 가능한 방법을 제공합니다. 그것은 크게 제약 단백질의 개발 및 생산을 촉진하고 과학 교육을 추진합니다.
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Disclosures
저자는 아무런 재정적 이익을 경쟁 없다.
Acknowledgments
우리는 R. 태양과 기여에 대한 첸의 연구실의 학생들은 물질 생성을 심어 주셔서 감사합니다. 우리는 또한 기술과 혁신 (CTI)의 대학 학부 연구의 그의 지원을 위해 박사 D. 녹색 감사합니다. 이 연구는 Q. 첸에 NIH 보조금 U01 AI075549 및 1R21AI101329, 그리고 Q. 첸 애리조나 주립 대학의 CTI에서 SSE 교부금에 의해 부분적으로 지원되었다. K. Leuzinger, M. 덴트, J. Hurtado, 그리고 J. Stahnke는 SSE 지원에 의하여 학부생입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| GFP | Invitrogen | V353-20 | www.invitrogen.com See reference: Lico and Chen, et al 2008 |
| DsRed | Clontech | 632152 | www.clontech.com See reference: Baird and Zacharias, et al 2000 |
| MagnICON Vector | Icon Genetics | n/a | www.icongenetics.com See reference: giritch and Marillonnet, et al 2006 |
| Geminiviral Vector | Author’s Lab | n/a | See reference: Chen and He, et al 2011 |
| N. benthamiana | Author’s Lab | n/a | herbalistics.com.au |
| Agrobacterium tumefaciens strain gv3101 | Author’s Lab | n/a | See reference: Lai and Chen 2012 |
| LB Agar Carbenicillin-100, plates | Sigma | L0418 | www.sigmaaldrich.com |
| LB Agar Kanamycin-50, plates | Sigma | L0543 | www.sigmaaldrich.com |
| Magnesium sulfate hepa hydrate | Sigma | M2773-500 g | www.sigmaaldrich.com |
| Bacto-Tryptone | Fisher | 73049-73-7 | www.fishersci.com |
| Bacto Yeast Extract | Becton, Dickinson CO. | REF 212750 | www.bd.com |
| Difco Nutrient Broth | Becton, Dickinson CO. | REF 234000 | www.bd.com |
| MES hydrate Buffer | Sigma | M8250-1kg | www.sigmaaldrich.com |
| Carbenicillin | Sigma | C1613-1ML | www.sigmaaldrich.com |
| Kanamycin | Sigma | 70560-51-9 | www.sigmaaldrich.com |
| Sodium Hydroxide | Sigma | 221465 | www.sigmaaldrich.com |
| Jack’s Fertilizer | Hummert International | Jul-25 | www.hummert.com |
| Equipment | |||
| Vacuubrand MD4 Vacuum Pump | Fisher | 13-878-113 | www.fishersci.com |
| Vacuum Air Regulator Valve | Fisher | NC9386590 | www.fishersci.com |
| Desiccator 12 1/8" with O ring | Fisher | 08-594-15C | www.fishersci.com |
| 3 L Tub | Rubber-Maid | n/a | Rubbermaid Servn’ Saver Bowl, 10-cup will work |
| plate/shelf 230ML | Fisher | NC9489269 | www.fishersci.com |
| Peat Pellet | Hummert International | 14-2370-1 | www.hummert.com |
| Propagation Tray Dome | hydrofarm | 132052 | www.hydroponics.net |
| Propagaiton Tray | hydrofarm | 138758 | www.hydroponics.net |
| Virbo Hand Seeder | Gro-Mor INC | n/a | www.gro-morent.com |
| Flora Cart 4 shelf | Hummert International | 65-6924-1 | www.hummert.com |
| 15 ml Round Bottom Culture Tubes | Sigma | CLS430172-500EA | http://www.sigmaaldrich.com |
| Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | www.bio-rad.com |
| Spectrophotometer Cuvettes | Bio-Rad | 223-9950 | www.bio-rad.com |
| Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1415-2500 | www.usascientific.com |
| Benchtop Centrifuge | Bio-Rad | 166-0602EDU | www.bio-rad.com |
| Incubator/Shaker | Eppendorf | Excella E25 | www.eppendorf.com |
| Ultraviolet Light Model#: UVGL-25 | UVP | 95-0021-12 | www.uvp.com |
References
- Chen, Q. Transgenic Horticultural Crops: Challenges and Opportunities - Essays by Experts. Mou, B., Scorza, R. , Taylor & Francis. 86-126 (2011).
- Chen, Q., Lai, H. Plant-derived virus-like particles as vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9, 26-49 (2013).
- Landry, N., et al. Preclinical and clinical development of plant-made virus-like particle vaccine against avian H5N1 influenza. PLoS One. 5, e15559 (2010).
- Lai, H., Chen, Q. Bioprocessing of plant-derived virus-like particles of Norwalk virus capsid protein under current Good Manufacture Practice regulations. Plant Cell Reports. 31, 573-584 (2012).
- Chen, Q. Expression and Purification of Pharmaceutical Proteins in Plants. Biological Engineering. 1, 291-321 (2008).
- Chen, Q. Turning a new leaf. European Biopharm. Rev. 2, 64-68 (2011).
- Chen, Q., et al. New Generation Vaccines. Levine, M. M. , Informa Healthcare USA, Inc. 306-315 (2009).
- Lai, H., et al. Monoclonal antibody produced in plants efficiently treats West Nile virus infection in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 2419-2424 (2010).
- Buswell, S., Medina-Bolivar, F., Chen, Q., Van Cott, K., Zhang, C. Expression of porcine prorelaxin in transgenic tobacco. Annals of the New York Academy of Sciences. 1041, 77-81 (2005).
- Lico, C., Chen, Q., Santi, L. Viral vectors for production of recombinant proteins in plants. J. Cell. Physiol. 216, 366-377 (2008).
- Chen, Q., He, J., Phoolcharoen, W., Mason, H. S. Geminiviral vectors based on bean yellow dwarf virus for production of vaccine antigens and monoclonal antibodies in plants. Hum. Vaccin. 7, 331-338 (2011).
- Tsien, R. Y. The Green Fluorescent Protein. Annual Review of Biochemistry. 67, 509-544 (1998).
- Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97, 11984-11989 (2000).
- Lai, H., He, J., Engle, M., Diamond, M. S., Chen, Q. Robust production of virus-like particles and monoclonal antibodies with geminiviral replicon vectors in lettuce. Plant Biotechnology Journal. 10, 95-104 (2012).
- Giritch, A., et al. Rapid high-yield expression of full-size IgG antibodies in plants coinfected with noncompeting viral vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 14701-14706 (2006).
- Huang, Z., Chen, Q., Hjelm, B., Arntzen, C., Mason, H. A DNA replicon system for rapid high-level production of virus-like particles in plants. Biotechnol. Bioeng. 103, 706-714 (2009).
- Santi, L., et al. An efficient plant viral expression system generating orally immunogenic Norwalk virus-like particles. Vaccine. 26, 1846-1854 (2008).
- He, J., Lai, H., Brock, C., Chen, Q. A Novel System for Rapid and Cost-Effective Production of Detection and Diagnostic Reagents of West Nile Virus in Plants. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 1-10 (2012).
- Huang, Z., et al. High-level rapid production of full-size monoclonal antibodies in plants by a single-vector DNA replicon system. Biotechnol. Bioeng. 106, 9-17 (2010).
- Kuta, D., Tripathi, L. Agrobacterium-induced hypersensitive necrotic reaction in plant cells: a resistance response against Agrobacterium-mediated DNA transfer. African Journal of Biotechnology. 4, 752-757 (2005).
- Phoolcharoen, W., et al. Expression of an immunogenic Ebola immune complex in Nicotiana benthamiana. Plant Biotechnology Journal. 9, 807-816 (2011).
- Phoolcharoen, W., et al. A nonreplicating subunit vaccine protects mice against lethal Ebola virus challenge. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 20695-20700 (2011).
- Herbst-Kralovetz, M., Mason, H. S., Chen, Q. Norwalk virus-like particles as vaccines. Expert Rev. Vaccines. 9, 299-307 (2010).
- Chen, Q., et al. Agroinfiltration as an effective and scalable strategy of gene delivery for production of pharmaceutical proteins. Adv. Tech. Biol. Med. 1, 103 (2013).
