Summary
Les plantes offrent un nouveau système pour la production de protéines pharmaceutiques à l'échelle commerciale qui est plus évolutive, rentable et sûre de paradigmes d'expression actuels. Dans cette étude, nous présentons une approche simple et pratique, mais évolutive pour introduire du gène cible contenant
Abstract
Culture de cellules de mammifères est la plate-forme importante pour la production commerciale de vaccins humains et protéines thérapeutiques. Toutefois, il ne peut pas répondre à la demande mondiale croissante pour les produits pharmaceutiques en raison de son évolutivité limitée et coût élevé. Les plantes ont montré pour être l'une des plateformes les plus prometteuses alternatives de production pharmaceutiques qui sont robustes, évolutives et à faible coût et en toute sécurité. Le développement récent de vecteurs à base de virus a permis l'expression transitoire rapide et à haut niveau de protéines recombinantes dans les plantes. Pour optimiser davantage l'utilité du système d'expression transitoire, nous démontrons une méthode simple, efficace et évolutive pour introduire du gène cible contenant Agrobacterium dans un tissu végétal dans cette étude. Nos résultats indiquent que agroinfiltration à la fois avec une seringue vide et méthodes ont abouti à la mise en place efficace d'Agrobacterium dans des feuilles et de la production robuste de deux protéines fluorescentes, GFP et DsRed. Par ailleurs,nous démontrons les avantages uniques offerts par les deux méthodes. infiltration de la seringue est simple et ne nécessite pas de matériel coûteux. Il permet également la souplesse voulue pour infiltrer la durée du congé avec un gène cible, ou d'introduire des gènes cibles multiples sur une feuille. Ainsi, il peut être utilisé pour l'expression de l'échelle du laboratoire de protéines recombinantes ainsi que pour comparer différentes protéines ou des vecteurs de rendement ou d'expression cinétique. La simplicité de l'infiltration de la seringue suggère également son utilité dans l'enseignement secondaire et collégial pour le sujet de la biotechnologie. En revanche, l'infiltration sous vide est plus robuste et peut être adapté en place pour la production commerciale de protéines pharmaceutiques. Il offre également l'avantage d'être en mesure de agroinfiltrate espèces végétales qui ne se prêtent pas à l'infiltration de la seringue comme la laitue et Arabidopsis. Dans l'ensemble, la combinaison de la seringue et agroinfiltration à vide offre aux chercheurs et éducateurs un moyen simple, efficace et robusteméthodologie pour l'expression transitoire de protéines. Il va grandement faciliter le développement de protéines pharmaceutiques et de promouvoir l'enseignement des sciences.
Introduction
Depuis les années 1970, les plantes ont été étudiées comme des alternatives aux cultures de cellules de mammifères, d'insectes et des bactéries pour la production commerciale de protéines recombinantes et des protéines thérapeutiques 1. Les systèmes à base de plantes pour l'expression de produits biopharmaceutiques ont montré des résultats prometteurs au cours des dernières années, plusieurs nouveaux traitements pour les maladies, comme la maladie de Gaucher 2, et la grippe aviaire H5N1 3, ont connu le succès dans les essais cliniques. Le développement des mécanismes compétents pour l'expression de protéines recombinantes dans les plantes dans les décennies qui ont suivi ces premières expériences a créé le potentiel pour les systèmes à base de plantes pour modifier le paradigme actuel de la production de protéines pour trois raisons principales. Tout d'abord, il ya une diminution notable des coûts de bioréacteurs de mammifères, d'insectes et bactéries nécessitent des dépenses considérables de démarrage, les médias de croissance coûteux, et les processus complexes de purification en aval 4. La création de plante transgénique stablelignes leur permet aussi de dépasser l'évolutivité d'autres systèmes d'expression que les plantes exprimant des protéines pourraient être cultivées et récoltées à l'échelle agricole 5. Deuxièmement, les systèmes d'expression à base de plantes réduisent considérablement le risque de transmission d'un agent pathogène humain ou d'un animal à partir de l'hôte protéines exprimant à l'homme, ce qui démontre la supériorité de la sécurité publique 6. Enfin, les plantes utilisent un système endomembranaire eucaryote qui est semblable à des cellules de mammifères, ce qui permet à la bonne modification post-traductionnelle de protéines comprenant la glycosylation et l'assemblage des protéines à sous-unités multiples 7. Cette capacité met systèmes à base de plantes en avance sur ceux basés sur des systèmes procaryotes, comme les bactéries, car un plus grand nombre de protéines recombinantes pharmaceutiques, y compris les anticorps monoclonaux (Acm), ont une structure plus complexe et nécessiterait d'importantes modifications post-traductionnelles ou assemblage 8.
Il existe deux grands appromaux à l'expression de protéines recombinantes dans les plantes. Le premier est le développement d'une lignée transgénique stable, où l'ADN codant pour la protéine cible est clonée dans une cassette d'expression et introduit soit à des génomes nucléaires ou chloroplastiques. Pour ce faire, l'ADN étranger devient héréditaire à travers les générations et permet de considérablement amélioré l'évolutivité, bien au-delà que d'autres systèmes d'expression 1. Introduction d'ADN exogène dans le génome nucléaire est habituellement obtenue par Agrobacterium tumefaciens infection des tissus de la plante ou, plus rarement, par bombardement de microprojectiles du tissu 9. Les hormones végétales sont ensuite utilisés pour induire la différenciation et de la croissance du tissu de plante transgénique tel que les racines et les feuilles. La transformation du génome chloroplastique ne peut pas être obtenue avec A. tumefaciens, mais repose entièrement sur des particules d'or ou de tungstène recouvertes d'ADN tiré balistique dans des cellules végétales. La seconde méthode d'exprimer recombinaisonnt protéines dans les plantes est à travers l'expression transitoire 10. Dans ce scénario, les vecteurs dérivés de virus hébergeant le gène d'intérêt sont livrés via A. tumefaciens aux plantes entièrement développées par un processus appelé agroinfiltration. Au lieu d'intégrer dans le génome de la plante, la construction du gène livré va alors commencer à diriger la production transitoire de la protéine désirée, qui peut être récoltée et isolé après une courte période d'incubation. Expression transitoire de gènes offre l'avantage d'une plus grande accumulation de la protéine globale ainsi qu'une amélioration du temps de production de protéines, comme les plantes seront prêts à récolter environ 1-2 semaines après agroinfiltration 11. Ce chiffre est nettement plus rapide que les procédés de production, la sélection et la confirmation de lignées de plantes transgéniques stables, ce qui peut prendre plusieurs mois à un an. Cependant, c'est aussi la limitation du système d'expression transitoire, car il ne cédera pas génétiquement stable plante lines qui peuvent être utilisés pour générer une banque de semences pour la production commerciale à grande échelle. Malgré cela, des approches ont été développées pour améliorer l'expression transitoire à grande échelle. Ici, nous démontrons une méthode de génération de protéines exprimant transitoires Nicotiana benthamiana utilisant des vecteurs viraux déconstruits livrés par A. tumefaciens.
Deux grandes méthodes sont en cours d'élaboration pour la livraison de A. tumefaciens dans les tissus de la plante: l'infiltration de l'échelle du laboratoire via une seringue et d'infiltration à grande échelle via la chambre à vide. Les deux protocoles sont décrits ici en utilisant N. benthamiana, qui est étroitement liée à la plante de tabac commun, comme la plante hôte pour l'expression transitoire de deux protéines fluorescentes: la protéine fluorescente verte (GFP) de méduse Aequorea victoria et la protéine fluorescente rouge de Discosoma corail (DsRed) 12,13. N. benthamiana est la plante hôte la plus courante pourprotéine recombinante, car il se prête à la transformation génétique, peut produire de grandes quantités de biomasse rapidement, et est un producteur prolifique de semences pour la production à grande échelle jusqu'à 14. Un autre avantage de l'utilisation de N. benthamiana comme hôtes pour l'expression des protéines est la disponibilité d'une variété de vecteurs d'expression 2,5. Dans cette étude, deux vecteurs viraux déconstruits, l'un basé sur un ARN système réplicon (vecteurs MagnICON) et l'autre dérivé du système réplicon ADN (vecteurs geminiviral) 4,11 virus du nanisme jaune de haricot (BeYDV), le virus de la mosaïque du tabac (TMV) 15-18, sont utilisés pour transporter le gène GFP et DsRed et de les livrer dans N. cellules benthamiana Via A. tumefaciens Trois constructions d'ADN. seront utilisés pour la GFP ou expression DsRed avec des vecteurs d'MagnICON. Ils comprennent en 5 'module (pICH15879) contenant le promoteur et d'autres éléments génétiques pour entraîner l'expression du gène cible, l'extrémité 3' module contenant le gène d'intérêt (PICH-GFP-PICH ou DsRed), et le module de l'intégrase (pICH14011) codant pour une enzyme qui intègre les extrémités 5 'et 3' modules ensemble lors de l'expression 8,15. Trois constructions d'ADN sont également nécessaires pour l'expression des vecteurs geminiviral. En plus de vecteurs contenant le réplicon du gène cible (pBYGFP ou pBYDsRed), un vecteur codant pour la protéine de réplication (pREP110) est requise pour l'amplification de la cible réplicon 11,14,16. En outre, l'inclusion d'un vecteur codant pour la p19 suppresseur de silence à partir de virus de rabougrissement de la tomate est souhaitée pour l'expression d'un gène cible de haut niveau 11,16.
Il ya généralement trois grandes étapes pour l'introduction de gènes de protéines recombinantes dans des cellules végétales par agroinfiltration y compris la croissance des plantes, A. préparation culture tumefaciens, et l'infiltration. Comme chaque étape est cruciale pour le succès final de cette procédure, par conséquent, une description détaillée de chaque est fournià la fois pour l'infiltration de la seringue et l'infiltration sous vide en dessous.
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Protocol
1. Croissance des végétaux
- Lieu 60 pastilles de tourbe dans un bac de propagation. Ajouter 4 L d'eau du robinet et laisser les pastilles de tourbe absorber l'eau pendant 2 heures.
- Ajouter 2 N. benthamiana graines dans chaque tourbe granulés à l'aide d'un semoir, couvrent le plateau avec un dôme en plastique transparent, et leur permettre de germer dans une ° C, l'environnement d'humidité de 25 à 84% avec un cycle jour / nuit 16/8 h (figure 1A).
- Retirez le dôme deux semaines après le semis, drainer l'eau du bac, et ajouter 2 litres d'engrais de Jack à une concentration de 1,48 g / L (figure 1B). Continuer à pousser des plantes dans une ° C, l'environnement d'humidité de 25 à 50% avec un HR jour / cycle de nuit 16/8. Fournir 2 L de l'engrais Jack de tous les 2 jours par plateau.
- A la semaine 4, transférer les plantes avec pastilles de tourbe à un nouveau plateau qui héberge six usines de fournir suffisamment d'espace pour davantage de croissance (figure 1C) jusqu'à ce qu'ils soient prêts à être infiltré à 6 semaines d'âge (figure1D).
2. A. tumefaciens Culture Préparation
2.1 Préparation pour l'infiltration de la seringue
- Série A. GV3101 souches tumefaciens contenant les vecteurs geminiviral p19, pREP110, pBYGFP et pBYDsRed sur des plaques d'agar LB contenant de la kanamycine (100 pg / ml). Morts à une souche par plaque et croître à 30 ° C pendant 48 heures.
- De même, série et grandir GV3101 souches portant les vecteurs de MagnICON de l'extrémité 5 'module (pICH15879), 3' module contenant le gène cible de la GFP ou DsRed (Pich-GFP ou Pich-DsRed) et intégrase (pCH14011) sur gélose LB des plaques contenant de la carbénicilline (100 ug / ml).
- À partir d'une seule colonie sur la plaque de gélose LB, inoculer GV3101 souches portant vecteurs geminiviral dans 3 ml de milieu YENB (0,75% d'extrait de levure Bacto, 0,8% de bouillon de nutriments, ajuster le pH à 7,5 avec NaOH) + kanamycine (100 pg / ml) dans un tube de culture à fond rond de 15 ml, grandir la culture liquide à 30 ° C dansun agitateur pendant une nuit avec une vitesse de rotation de 300 tours par minute.
- De même, ensemencer et cultiver GV3101 souches portant les vecteurs de MagnICON dans YENB médias + carbénicilline (100 ug / ml) dans un shaker pendant la nuit à 30 ° C.
- Mesurer et enregistrer DO 600 valeurs pour chaque culture liquide avec un spectrophotomètre et utiliser la formule suivante pour calculer le volume nécessaire (V sub) pour être repiquées pour une nouvelle culture avec un OD à partir de 0,025 600 dans 10 ml de milieu YENB avec des antibiotiques appropriés .
V sub (ml) = (10 ml) x (0,025) / OD 600 - Transfert V sub (ml) de la culture de la nuit à (10 - V sub) ml de milieu YENB avec des antibiotiques appropriés pour chaque souche. Cultiver la nouvelle culture d'une nuit à 30 ° C dans un agitateur avec une vitesse de rotation de 250 tours par minute jusqu'à ce que de la valeur de DO 600 est dans la gamme de 1,7 à 2,0.
- Mesurer et enregistrer OD 600 valeurs pour chaque culture liquide et utiliser la formule ci-dessous pour calculer le volume nécessaire (V inf) doit être dilué dans 50 ml de tampon d'infiltration de donner une DO finale 600 de 0,12 pour chaque souche.
V inf (ml) = (50 ml) x (0,12) / OD 600 - Transfert V inf (ml) de chaque culture dans un tube à centrifuger et centrifuger les cellules par centrifugation à 12000 g pendant 2 min, retirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans un tampon d'infiltration de 10 ml (10 mM MES, pH 5,5, 10 mM MgSO 4) au vortex brièvement.
- Mélanger les cellules de pBYGFP + pREP110 + p19 remis en suspension, tourner les cellules vers le bas à 12.000 g pendant 2 min, et remettre au total de 50 ml de tampon d'infiltration. Cette combinaison Agrobacteria est l'expression de la GFP geminiviral.
- De même, mélanger les combinaisons suivantes de cellules agrobactéries, ralentit et les remettre en suspension dans 50 ml de tampon d'infiltration. Ils incluent (1) pBYDsRed + pREP110 + p19 d'expression geminiviral de DsRed, (2) pBYGFP + + pBYDsRed pREP110+ P19 pour geminiviral co-expression de la GFP et DsRed, (3) pREp110 + p19 comme contrôle négatif de l'expression geminiviral, (4) Pich-GFP + + pICH15879 pCH14011 d'expression MagnICON de la GFP, (5) Pich-DsRed + pICH15879 + pCH14011 pour l'expression de MagnICON DsRed, et (6) pICH15879 + pCH14011 comme témoin négatif pour l'expression d'MagnICON.
2.2 Préparation pour une infiltration sous vide
- Inoculate et la culture de chaque souche GV3101 contenant des vecteurs geminiviral ou vecteurs de MagnICON dans 15 ml de milieu YENB avec des antibiotiques appropriés dans un flacon stérilisé à l'autoclave de 50 ml et de croître pendant la nuit comme décrit pour seringue infiltration ci-dessus.
- Mesurer et enregistrer DO 600 valeurs pour chaque culture liquide avec un spectrophotomètre et utiliser la formule suivante pour calculer le volume nécessaire (V sub) pour être repiquées pour une nouvelle culture avec un départ OD 600 de 0.025 dans 250 ml de milieu YENB avec des antibiotiques appropriés .
V sous 600 - Transfert V sub (ml) de la culture de la nuit à (250 - V sub) ml de milieu YENB dans un ballon de 1 autoclave avec des antibiotiques appropriés pour chaque souche et croître la nouvelle culture de la nuit tel que décrit à l'infiltration de la seringue au-dessus.
- Mesurer et enregistrer OD 600 valeurs pour chaque culture liquide et utiliser la formule suivante pour calculer le volume nécessaire (V inf) à diluer dans 3 L de tampon d'infiltration de donner une DO finale 600 de 0,12 pour chaque souche.
V inf (ml) = (3000 ml) x (0,12) / OD 600 - Pellet et remettre en suspension inf V (ml) de chaque culture dans le tampon d'infiltration tel que décrit à l'infiltration de la seringue et mélanger les cultures remises en suspension en fonction des combinaisons mentionnées à l'infiltration de la seringue. Repellet les cellules agrobactéries mixtes et les remettre en suspension dans 3 L de tampon d'infiltration.
3.1 Seringue Infiltration
- Choisissez quatre âgées de 6 semaines N. benthamiana avec 5 feuilles chacun. Les trois premières feuilles de comptage à partir de la partie supérieure de chaque plante sont infiltrés entièrement à l'une des combinaisons de A. tumefaciens souches dans le tampon d'infiltration. La quatrième feuille sera ponctuelle infiltré avec toutes les combinaisons de contrainte quatre pour l'expression geminiviral ou trois combinaisons pour l'expression MagnICON. La dernière feuille de chaque plante sera infiltrée par des combinaisons de contrôles négatifs.
- Créer une petite entaille avec une aiguille dans l'épiderme de la face arrière de la feuille (figure 2A). Attention: veillez à ne pas rayer si difficile à percer la feuille par les deux parties, comme les cellules agrobactéries dans le mélange d'infiltration vont passer à travers la ponction de l'autre côté de la feuille.
- Prendre une prise ferme de la face avant de la feuille et en appliquant doucecontre-pression à l'entaille avec le pouce d'une main, injecter des mélanges d'Agrobacterium dans le tampon d'infiltration dans le nick avec une seringue sans aiguille (figure 2B). Remarque: Comme le mélange Agrobacterium pénètre dans l'espace intercellulaire de la feuille, la zone d'infiltration devient vert visiblement plus sombre (figure 2C).
- Continuer à injecter des mélanges d'Agrobacterium dans le nick jusqu'à ce que le cercle vert foncé cesse de se développer. Créer un autre nick et répétez les étapes 3.1.2-3.1.4 jusqu'à la feuille entière est infiltrée et la feuille entière devient vert foncé pour les trois premières feuilles et la dernière feuille.
- Pour la quatrième feuille de chaque plante, toutes les combinaisons de quatre (vecteur geminiviral) ou trois (MagnICON vecteur) seront infiltrés dedans. Faire une entaille pour chaque combinaison de souches d'Agrobacterium, et infiltrer chaque entaille avec une combinaison.
- Après infiltration, déplacer des plantes à la salle de la croissance et Moniexpression de protéine TOR entre 2-15 jours après l'infiltration (dpi).
3.2 Infiltration vide
- Placer un bac dans un dessiccateur à vide et un tampon d'infiltration de L 3 de transfert contenant les souches d'Agrobacterium à la baignoire. Raccorder le dessiccateur à une pompe à vide à membrane Vacuubrand (figure 3A).
- Placer une plante à l'envers sur la plaque de dessiccateur (figure 3B) et abaisser la plaque avec la plante jusqu'à ce que toute la feuille et le système de tige est immergée dans le tampon d'infiltration avec la plaque de repos au sommet de la cuve. Placez l'anneau de dessiccateur O le long de la jante et mettre le couvercle de dessiccateur sur la chambre (figure 3C).
- Mettre la pompe à vide et commencer à chronométrer quand le vide atteint 100 mbar. Ouvrez lentement la vanne de sortie sur le dessiccateur après 1 min à 100 mbar pour permettre l'entrée de Agrobacteria dans les espaces interstitiels des tissus de la plante submergée. Répétez cette étape une additional temps pour assurer une bonne infiltration.
- Après infiltration, prenez la plante sur le dessiccateur et le remettre dans sa position verticale. Déplacez plantes à la salle de la croissance et de l'expression de la protéine de contrôle entre 2-15 dpi.
4. Détection de la protéine fluorescente et Photographie
- A partir de 2 dpi, déplacer des plantes dans une pièce sombre et faire briller la lumière UV sur la face arrière des feuilles infiltrées avec une lampe UV à main.
- Respecter la fluorescence verte de la GFP ou la fluorescence rouge de DsRed. GFP émet un signal plus fort avec de la lumière UV à ondes longues, tandis que DsRed est plus forte sous la lumière UV à ondes courtes.
- Prenez des photos de feuilles fluorescentes avec un appareil photo numérique ordinaire sans flash.
- Déplacez plantes à la salle de la croissance après l'observation ou la photographie.
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Representative Results
1. L'expression de protéines fluorescentes par infiltration de la seringue
Pour démontrer l'efficacité de la seringue infiltration d'Agrobacterium dans les tissus de la plante, nous avons testé l'expression de deux protéines fluorescentes - GFP et DsRed - par deux plantes vecteurs viraux différents déconstruits - geminiviral et MagnICON - en N. benthamiana. Pour N. benthamiana feuilles qui ont été entièrement infiltrés avec agrobactéries vecteurs geminiviral contenant, expression de la GFP a été observée sur la zone de feuille entière sous lumière UV à partir dès le 2 ppp et atteint accumulation pic à 4 ppp (figure 4C). Cette expression de la GFP tôt par le vecteur geminiviral est cohérent avec les résultats antérieurs d'autres protéines recombinantes 14,16,18,19. En revanche, les feuilles infiltré avec MagnICON vecteur contenant des combinaisons d'Agrobacterium a montré fluorescence de la GFP seulement après 5 ppp et atteint son maximum accumulatisur au 7 dpi (figure 4D). Aucune fluorescence verte a été observée à partir des feuilles infiltrées avec des mélanges d'Agrobacterium de contrôle négatif de pREP110 + p19 (figure 4B) ou pICH15879 + pCH14011 (données non présentées), ce qui indique que la fluorescence est spécifique du gène GFP et n'était pas le résultat de la fluorescence de fond de les feuilles. Lors de sa accumulation de pointe, la fluorescence de MagnICON vecteur exprimé GFP est plus intense que celle du vecteur geminiviral (figure 4C et 4D), similaire aux résultats obtenus précédemment pour d'autres protéines recombinantes 8,18. Le modèle d'expression temporelle et l'intensité de fluorescence relative de DsRed sont similaires à celles de la GFP (données non présentées). Aucune nécrose majeure n'a été observée sur les feuilles infiltrées par des constructions GFP (figure 4A). Des résultats similaires ont également été observées pour DsRed exprimant plantes, indiquant que ni la protéine fluorescente est très toxique pour les plantes CElls. Cependant, une nécrose locale sur le site Nick a été observé et ils sont apparus comme des «trous» dans les photographies (figure 4). Lorsque les deux protéines fluorescentes ont été exprimées sur la même feuille par des vecteurs geminiviral avec une seringue spot-infiltration, ils ont été détectés avec leur couleur fluorescente prévue à l'endroit où ils ont été infiltrés (Figure 5). Fait intéressant, co-infiltration de la GFP et DsRed abouti à fluorescence jaunâtre (figure 5). L'intensité de fluorescence DsRed semble être plus faible que celle de la GFP sur la même feuille. Toutefois, cela peut ne pas refléter la faible expression de DsRed, mais plutôt en raison de l'excitation moins-que-optimale des DsRed par la lumière UV. Dans l'ensemble, nos résultats démontrent que l'infiltration de la seringue introduit efficacement portant le gène recombinant Agrobacteria dans les feuilles des plantes et a donné lieu à l'expression robuste de nos protéines cibles. En outre, nous avons démontré que cette méthode permet la flexibilitélité soit infiltrer feuilles entières pour l'accumulation maximale d'une protéine cible ou à repérer-infiltrer plusieurs cibles de protéines ayant de multiples vecteurs pour comparer leur expression et leur mode d'expression.
2. L'expression de protéines fluorescentes par infiltration sous vide
infiltration sous vide a également été examinée au point une méthode de agroinfiltration évolutive qui peut être utilisé pour la production à grande échelle de protéines recombinantes par des systèmes d'expression transitoire de plantes. Nos résultats indiquent que le modèle d'expression temporelle de la GFP ou DsRed par geminiviral et MagnICON vecteurs n'ont pas été modifiées par le changement de méthode d'infiltration et est demeuré semblable à celui de l'infiltration de la seringue. Comme l'ensemble de tige d'une plante est immergé dans le mélange d'infiltration pendant l'infiltration sous vide, la fluorescence a été observé pour la GFP (figure 6) pour toutes les feuilles des plantes infiltrées. Par rapport à l'infiltration de la seringue, il est plus robuste et peut acinfiltration ACHIEVE de chaque plante avec un délai beaucoup plus court. Par exemple, il faut un étudiant qualifié 15 min à seringue infiltrer un ensemble de 6 semaines N. usine benthamiana. En revanche, la même plante peut être infiltré en 3 min par le vide du début à la fin et plusieurs plantes peuvent être infiltré dans le même temps.
Figure 1. N. la croissance des plantes benthamiana avec pastilles de tourbe et des plateaux de croissance. plantes de type sauvage à 0 (A), 2 (b), 4 (C) et 6 (D) semaines après le semis.
Figure 2. Seringue infiltration de N. laisse benthamianaavec Agrobacterium tumefaciens. Egouttez GV3101 de A. tumefaciens hébergeant exprimant la GFP vecteurs de MagnICON ont été remises en suspension dans du tampon d'infiltration et chargés dans une seringue sans aiguille. Une entaille a été réalisé avec une aiguille sur la face arrière d'une feuille de plante vieille de 6 semaines (A). L'ouverture de la seringue a été placée contre le nick (B) et Agrobacteria dans un tampon d'infiltration ont été injectés dans l'espace intercellulaire de la feuille via le nick (C).
Figure 3. Aspirateur infiltration de N. benthamiana laisse avec Agrobacterium tumefaciens. souche GV3101 de A. tumefaciens contenant des cibles vecteurs exprimant la protéine ont été remises en suspension dans infiltration tampon et chargé dans un bain L 3. Le bain a été ensuite placé dans un dessiccateur sous vide qui a été raccordé à une pompe à vide (A). A 6 semaines ancienne usine a été placé à l'envers sur la plaque de dessiccateur (B). L'ensemble de lame et le système de tiges a été ensuite immergé dans la cuve lorsque la plaque a été placée au sommet de la chambre (C). Agroinfiltration a été obtenue en appliquant et en libérant un vide à 100 mbar deux fois pendant 1 min. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 4. Expression de la GFP en seringue agroinfiltrated feuilles. Tout N. feuilles benthamiana ont été infiltrés par la souche GV3101 de A. tumefaciens hébergeant le gène de la GFP dans une geminiviral (A et C) ou MagnICON vectou (D). Feuilles témoins négatifs ont été infiltrés par des souches d'agrobactéries qui ne contiennent pas ce gène GFP (B). Les feuilles ont été photographiés en lumière blanche (A) ou à la lumière UV (BD) à 4 ppp (AC) ou 7 dpi (D).
Figure 5. Expression de la GFP et DsRed en seringue feuilles spot-agroinfiltrated. N. feuilles benthamiana étaient sur place infiltré avec GV3101 hébergeant le GFP, DsRed, ou les deux gènes GFP et DsRed dans des vecteurs geminiviral. Un point de contrôle négatif a été infiltré avec pREP110 + p19. Les feuilles ont été photographiés sous lumière UV à 4 ppp.
Figure 6. Expression de la GFP dans le vide agroinfilfeuilles castrés. N. feuilles benthamiana ont été infiltrés avec GV3101 hébergeant le gène de la GFP dans des vecteurs de MagnICON. Les feuilles ont été photographiés sous lumière UV à 7 dpi.
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Discussion
La demande croissante de produits pharmaceutiques à base de protéines dans le monde entier exigent de nouvelles plates-formes de production qui sont robustes, évolutives et à faible coût et en toute sécurité. Les plantes ont montré pour être l'un des systèmes de production alternatifs les plus prometteurs pour la production de protéines pharmaceutiques. Au cours des dernières années, le développement de déconstruits vecteurs à base de virus a permis l'expression transitoire de protéines dans les plantes, ce qui améliore considérablement la vitesse et le rendement des systèmes d'expression végétaux 2,10. Pour optimiser davantage l'utilité du système d'expression transitoire, nous démontrons une approche simple mais efficace et évolutive pour introduire du gène cible contenant Agrobacterium dans les tissus de la plante. Nos résultats indiquent que agroinfiltration avec la seringue et vide méthode a abouti à la mise en place efficace d'Agrobacterium dans les feuilles des plantes et la production robuste de deux protéines fluorescentes, GFP et DsRed.
Pour assurer le véhicunt agroinfiltration et la production de protéines, les paramètres essentiels suivants doivent être soigneusement contrôlées. Écarts par rapport à ces paramètres peuvent entraîner une faible efficacité agroinfiltration et à son tour, l'expression de protéines à faible cible.
1. Usine scène et la santé du développement. La variable la plus probable dans ce procédé est entre les laboratoires de la matière végétale pour l'infiltration. Bien que les plantes peuvent apparaître phénotype similaire, leur stade de développement et l'état physiologique affectent leur compétence dans l'expression de protéines recombinantes de manière significative. Des paramètres spécifiques qui ont une incidence sur la croissance des plantes et les niveaux d'expression de protéines comprennent la température, l'humidité, l'intensité lumineuse, la fourniture d'engrais, l'âge d'inoculation de plantes, et le temps nécessaire pour l'accumulation maximale de protéine cible après l'infiltration des feuilles. Les plantes doivent toujours recevoir des quantités égales d'eau et d'engrais par jour. Des changements mineurs dans les conditions de croissance des plantes peuvent changer radicalement le siz finalee des plantes et leur capacité à exprimer des protéines recombinantes. Nos études antérieures indiquent que les plantes cultivées sous lumière naturelle ont produit plus de biomasse foliaire, mais le rendement en protéines est très inférieure à celle développée sous la lumière artificielle 4. Par conséquent, en utilisant la lumière artificielle est la méthode de choix pour la croissance des plantes. Nos résultats montrent également qu'une heure de lumière / 8 cycle d'obscurité 16 heures à 25 ± 0,5 ° C est la condition optimale de croître N. benthamiana sous un tel éclairage artificiel 4. Nous avons démontré que, dans ces conditions, les plantes 6 semaines sont l'âge optimal pour la GFP et l'expression DsRed car ils produisent des hauts niveaux de protéines fluorescentes tandis que le rendement de la biomasse est suffisante. Les plantes âgées de 6 semaines produisent plus de biomasse, mais sont trop grands pour entrer dans la chambre d'infiltration 4. En outre, les fleurs commencent à se développer après 6 semaines de croissance, ce qui affecte négativement l'expression des protéines recombinantes 4. Par conséquent, les plantes 6 semaines contiennent le l optimalmatériel de l'AEP qui concilie la nécessité combinée de production de biomasse, l'accumulation de protéines, et la facilité de agroinfiltration.
2. La croissance et la concentration de l'infiltration d'Agrobacterium. Un autre point clé de cette méthode est le contrôle de la croissance et de la concentration d'infiltration A. tumefaciens, tel que mesuré par l'OD 600. A chaque étape de la culture et sous-culture, des souches de A. tumefaciens doivent être cultivés, mais pas sur le OD désigné 600. Nous avons examiné plusieurs concentrations de A. tumefaciens pour l'imprégnation finale du N. benthamiana 4 feuilles. Une faible concentration de Agrobacterium se traduira par la livraison insuffisante de gènes cibles dans les plantes, conduisant à une faible expression de la protéine. D'autre part, si la concentration d'infiltration d'Agrobacterium est trop élevé, il va déclencher une réaction d'hypersensibilité dans les tissus infiltrés et conduire à une nécrose 20. Notre résultats ont démontré que la DO 600 = 0,12 souche d'Agrobacterium équilibre entre la nécessité pour un débit maximal de construction du gène sans provoquer de nécrose tissulaire et la mort cellulaire. La DO 600 densité désirée d'Agrobacterium peut être obtenu en utilisant des milieux de culture cohérents, la température et le temps de culture.
3. Pour une infiltration sous vide, il est important de suivre la dépression désigné et la durée d'infiltration. Nos résultats indiquent que l'un 3 L baquet de mélange d'infiltration Agrobacterium peut être utilisé pour infiltrer environ 30 plantes. Si plus de 30 plantes ont besoin d'être infiltré, un nouveau lot de mélange d'infiltration Agrobacterium doit être fourni.
4. Les paramètres spécifiques présentées dans ce document sont optimisés pour l'expression de protéines en utilisant N. benthamiana cultivées dans des conditions spécifiques décrites ci-dessus avec déconstruits vecteurs à base de virus. Comme indiqué plus haut, til paramètre le plus difficile à contrôler dans cette méthode est la matière végétale. Nous avons exprimé une variété de vaccins et de protéines thérapeutiques en utilisant des plantes et la procédure d'infiltration, nous avons décrit ici et a obtenu d'excellents résultats dans tous les cas 4,8,14,18,21-23. Ces résultats ont démontré que les conditions que nous avons développés sont optimales pour l'expression des protéines. Toutefois, si les différentes espèces de plantes hôtes, vecteurs d'expression, ou différent N. Benthamiana conditions de croissance ont été utilisés pour l'infiltration, chaque paramètre de cette méthode devra être ré-optimisé par des expériences.
Dans l'ensemble, nous avons démontré que agroinfiltration avec une seringue et le vide est une méthode simple et efficace pour introduire un gène cible portant Agrobacterium dans des plantes pour l'expression transitoire de protéines recombinantes. Les deux méthodes ont leurs avantages uniques en fonction de l'objectif de la recherche et de la production. infiltration de la seringue est simple, nécessitantes seulement de petits volumes de culture Agrobacterium et n'a pas besoin de pompes coûteuses et les chambres à vide. Comme démontré dans ce rapport, il a la souplesse voulue pour infiltrer toute la feuille avec un gène cible ou utiliser tache infiltration pour introduire des gènes de plusieurs cibles sur une feuille. L'ensemble du procédé d'infiltration de la feuille peut être utilisé pour l'expression de l'échelle du laboratoire de petite protéine recombinante pour leur caractérisation biochimique, de purification et des études fonctionnelles précliniques 1. En revanche, la tache infiltration peut être utilisé pour exprimer de multiples cibles de protéines sur une feuille de comparer leur rendement, de la cinétique d'expression et la toxicité pour les plantes. Il peut également être utilisé pour comparer l'expression d'une protéine rapporteur comme la GFP ou DsRed entraînée par les différents vecteurs d'expression sur la même feuille. En conséquence, la capacité de vecteur différent dans la conduite de l'accumulation de protéines et de leur cinétique d'expression peut être caractérisée. La simplicité de l'infiltration de la seringue permet également uneoutil possible d'enseigner et de former lycéens et étudiants de premier cycle au sujet de la biotechnologie et du génie génétique.
En comparaison avec l'infiltration de seringue, une infiltration sous vide nécessite l'investissement de pompes à vide et les chambres et les grands volumes de cultures tumefaciens. Par conséquent, ce n'est pas la méthode de choix lorsque quelques plantes ont besoin d'être infiltré. Cependant, il offre l'évolutivité qui ne peut être égalé par infiltration de la seringue. Il est plus robuste et peut s'infiltrer dans un grand nombre de plantes dans un court laps de temps. Avec l'échelle présentée dans ce rapport, nous sommes en mesure de produire des niveaux gramme de protéines purifiées pharmaceutiques suffisante pour un essai chez l'homme que je clinique de phase 4. En outre, ce processus peut encore être mise à l'échelle en place pour la fabrication commerciale de protéines pharmaceutiques à partir de plantes. Par exemple, les processus sont conçus pour aspirer infiltrer trois tonnes de N. benthamiana par heuredans une opération de mise à l'échelle 24. Un autre avantage de l'infiltration sous vide est qu'il peut être utilisé pour agroinfiltrate espèces végétales qui ne se prêtent pas à l'infiltration de la seringue.
En résumé, la combinaison de seringue et une infiltration sous vide fournit les chercheurs, les biotechnologistes et les éducateurs, une méthodologie simple, efficace, robuste et évolutive pour l'expression transitoire de protéines recombinantes dans les plantes. Il va grandement faciliter le développement et la production de protéines pharmaceutiques et de promouvoir l'enseignement des sciences.
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Disclosures
Les auteurs n'ont aucun conflit d'intérêts financiers.
Acknowledgments
Nous remercions R. Sun et d'autres étudiants du Laboratoire de Chen pour leur contribution à planter génération de matériel. Nous remercions également le Dr D. Green pour son soutien à la recherche de premier cycle au Collège de technologie et l'innovation (CTI). Cette recherche a été financée en partie par des subventions du NIH U01 AI075549 et 1R21AI101329 à Q. Chen, et une subvention SSE de CTI de l'Arizona State University à Q. Chen. K. Leuzinger, M. Dent, J. Hurtado, et J. Stahnke sont des étudiants pris en charge par la subvention SSE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| GFP | Invitrogen | V353-20 | www.invitrogen.com See reference: Lico and Chen, et al 2008 |
| DsRed | Clontech | 632152 | www.clontech.com See reference: Baird and Zacharias, et al 2000 |
| MagnICON Vector | Icon Genetics | n/a | www.icongenetics.com See reference: giritch and Marillonnet, et al 2006 |
| Geminiviral Vector | Author’s Lab | n/a | See reference: Chen and He, et al 2011 |
| N. benthamiana | Author’s Lab | n/a | herbalistics.com.au |
| Agrobacterium tumefaciens strain gv3101 | Author’s Lab | n/a | See reference: Lai and Chen 2012 |
| LB Agar Carbenicillin-100, plates | Sigma | L0418 | www.sigmaaldrich.com |
| LB Agar Kanamycin-50, plates | Sigma | L0543 | www.sigmaaldrich.com |
| Magnesium sulfate hepa hydrate | Sigma | M2773-500 g | www.sigmaaldrich.com |
| Bacto-Tryptone | Fisher | 73049-73-7 | www.fishersci.com |
| Bacto Yeast Extract | Becton, Dickinson CO. | REF 212750 | www.bd.com |
| Difco Nutrient Broth | Becton, Dickinson CO. | REF 234000 | www.bd.com |
| MES hydrate Buffer | Sigma | M8250-1kg | www.sigmaaldrich.com |
| Carbenicillin | Sigma | C1613-1ML | www.sigmaaldrich.com |
| Kanamycin | Sigma | 70560-51-9 | www.sigmaaldrich.com |
| Sodium Hydroxide | Sigma | 221465 | www.sigmaaldrich.com |
| Jack’s Fertilizer | Hummert International | Jul-25 | www.hummert.com |
| Equipment | |||
| Vacuubrand MD4 Vacuum Pump | Fisher | 13-878-113 | www.fishersci.com |
| Vacuum Air Regulator Valve | Fisher | NC9386590 | www.fishersci.com |
| Desiccator 12 1/8" with O ring | Fisher | 08-594-15C | www.fishersci.com |
| 3 L Tub | Rubber-Maid | n/a | Rubbermaid Servn’ Saver Bowl, 10-cup will work |
| plate/shelf 230ML | Fisher | NC9489269 | www.fishersci.com |
| Peat Pellet | Hummert International | 14-2370-1 | www.hummert.com |
| Propagation Tray Dome | hydrofarm | 132052 | www.hydroponics.net |
| Propagaiton Tray | hydrofarm | 138758 | www.hydroponics.net |
| Virbo Hand Seeder | Gro-Mor INC | n/a | www.gro-morent.com |
| Flora Cart 4 shelf | Hummert International | 65-6924-1 | www.hummert.com |
| 15 ml Round Bottom Culture Tubes | Sigma | CLS430172-500EA | http://www.sigmaaldrich.com |
| Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | www.bio-rad.com |
| Spectrophotometer Cuvettes | Bio-Rad | 223-9950 | www.bio-rad.com |
| Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1415-2500 | www.usascientific.com |
| Benchtop Centrifuge | Bio-Rad | 166-0602EDU | www.bio-rad.com |
| Incubator/Shaker | Eppendorf | Excella E25 | www.eppendorf.com |
| Ultraviolet Light Model#: UVGL-25 | UVP | 95-0021-12 | www.uvp.com |
References
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