Summary
Pflanzen bieten ein neuartiges System für die Produktion von pharmazeutischen Proteinen in einem kommerziellen Maßstab, die besser skalierbare, kosteneffiziente und sichere als aktuellen Ausdruck Paradigmen ist. In dieser Studie berichten wir über eine einfache und bequeme, aber skalierbaren Ansatz zur Ziel-Gen enthält, einführen
Abstract
Säugerzellen ist das wichtigste Plattform für die kommerzielle Produktion von menschlichen Impfstoffen und therapeutischen Proteinen. Allerdings kann es nicht die steigende weltweite Nachfrage nach Arzneimitteln wegen seiner begrenzten Skalierbarkeit und hohe Kosten. Pflanzen haben gezeigt, dass eine der vielversprechendsten alternativen pharmazeutischen Produktion Plattformen, die robuste, skalierbare, kostengünstige und sicher sind. Die jüngste Entwicklung von Virus-basierten Vektoren hat rasche und High-Level transiente Expression von rekombinanten Proteinen in Pflanzen erlaubt. Zur weiteren Optimierung der Nützlichkeit des transienten Expressionssystem zeigen wir eine einfache, effiziente und skalierbare Methode zur Target-Gen, das in Agrobacterium Pflanzengewebe einzuführen in dieser Studie. Unsere Ergebnisse zeigen, dass sowohl mit Agroinfiltration Spritze und Vakuumverfahren bei der effizienten Einführung von Agrobacterium in Blätter und robuste Produktion von zwei fluoreszierenden Proteinen geführt haben; GFP und DsRed. Fernerdemonstrieren wir die einzigartigen Vorteile von beiden Methoden angeboten. Spritze Infiltration ist einfach und braucht keine teure Ausrüstung. Es ermöglicht auch die Flexibilität, um entweder die gesamte infiltrieren verlassen mit einem Ziel-Gen oder von Genen von mehreren Zielen auf ein Blatt einzuführen. So kann es für Labormaßstab Expression rekombinanter Proteine sowie für den Vergleich verschiedener Proteine oder Vektoren für die Ausbeute oder Expressionskinetik verwendet werden. Die Einfachheit der Spritze Infiltration schlägt auch ihre Nutzbarkeit in der High School und College-Ausbildung für das Fach Biotechnologie. Im Gegensatz dazu ist Vakuuminfiltration robuster und Scale-Up für die kommerzielle Herstellung von pharmazeutischen Proteinen. Es bietet auch den Vorteil, dass sie in der Lage, Pflanzenarten, die nicht zugänglich sind für Spritze Infiltration wie Salat und Arabidopsis agroinfiltrate. Insgesamt bietet die Kombination aus Spritze und Vakuum Agroinfiltration Forscher und Pädagogen eine einfache, effiziente und robusteMethodik für die transiente Proteinexpression. Es wird dadurch wesentlich erleichtert die Entwicklung von pharmazeutischen Proteinen und Förderung von Wissenschaft Bildung.
Introduction
Seit den 1970er Jahren haben die Pflanzen als Alternative zu Säugetier-, Insekten-und bakteriellen Zellkulturen für die kommerzielle Produktion von rekombinanten Proteinen und Protein-Therapeutika 1 untersucht. Plant-basierte Systeme für die Expression von Biopharmazeutika haben Versprechen in den letzten Jahren als mehrere neue Behandlungen für Krankheiten, wie Morbus Gaucher 2 und aviäre Influenza H5N1 3 dargestellt ist, haben gezeigt, Erfolg in klinischen Studien. Die Entwicklung von Mechanismen für die zuständigen Expression rekombinanter Proteine in Pflanzen in den Jahrzehnten seit den ersten Versuchen hat das Potenzial für eine Anlage-basierte Systeme, um die aktuelle Paradigma der Protein-Produktion für drei Hauptgründe verändern erstellt. Erstens gibt es eine bemerkenswerte Abnahme der Kosten als Säugetier-, Insekten und Bakterien Bioreaktoren erfordern erhebliche Anlaufkosten, teure Nährmedien und komplizierte Prozesse für Downstream-Reinigung 4. Die Schaffung von stabilen transgenen PflanzeLinien ermöglicht ihnen auch die Skalierbarkeit der Systeme übertreffen anderen Ausdruck als Protein exprimieren Pflanzen angebaut und geerntet werden in einem landwirtschaftlichen Skala 5. Zweitens, auf pflanzlicher Basis Ausdruck Systeme deutlich reduzieren das Risiko der Übertragung eines menschlichen oder tierischen Erreger aus dem Protein-Expression Host für den Menschen, zeigt Überlegenheit in der öffentlichen Sicherheit 6. Schließlich verwenden Pflanzen einen eukaryotischen Endomembransystem ähnlich Säugerzellen ist, für eine angemessene posttranslationale Modifikation von Proteinen einschließlich Glycosylierung und der Zusammenbau von mehreren Untereinheit Proteine 7. Diese Fähigkeit bringt pflanzliche Systeme vor solche auf Basis von prokaryotischen Systemen, wie Bakterien, da eine größere Anzahl von pharmazeutischen rekombinanten Proteinen, einschließlich monoklonale Antikörper (mAbs), eine kompliziertere Struktur und erfordern umfangreiche posttranslationale Modifikationen oder Anordnung 8.
Es gibt zwei große entspreschmerzt zu Expression rekombinanter Proteine in Pflanzen. Die erste ist die Entwicklung einer stabilen transgenen Linie, wobei DNA, die für das Zielprotein in eine Expressionskassette kloniert und eingeführt, um die Kern-oder Chloroplastengenome nicht. Dabei wird die Fremd-DNA durch die nachfolgenden Generationen vererbbar und ermöglicht enorm verbesserte Skalierbarkeit, weit über die anderer Expressionssysteme 1. Einführung von exogener DNA in das Kerngenom wird normalerweise durch Agrobacterium tumefaciens Infektion von Pflanzengewebe erreicht oder, seltener, durch Mikroprojektilbeschuss des Gewebes 9. Pflanzenhormone werden dann verwendet, um die Differenzierung und das Wachstum von transgenen Pflanzengewebe wie Wurzeln und Blätter zu induzieren. Transformation des Chloroplasten-Genom nicht erreicht werden A. tumefaciens, sondern verlässt sich ganz auf Gold-oder Wolfram-Partikel mit DNA beschichtet gefeuert ballistisch in Pflanzenzellen. Das zweite Verfahren zur Expression Rekombinationnt-Protein in Pflanzen durch transiente Expression 10. In diesem Szenario werden Virus-abgeleiteten Vektoren, die das Gen von Interesse via A. geliefert tumefaciens zu voll entwickelten Pflanzen durch einen Prozess namens Agroinfiltration. Statt der Integration in das pflanzliche Genom, wird die gelieferte Genkonstrukt dann damit beginnen, die transiente Produktion des gewünschten Proteins, die geerntet und nach kurzer Inkubationszeit isoliert werden zu lenken. Transient Genexpression bietet den Vorteil einer größeren allgemeinen Protein-Akkumulation sowie einer verbesserten Zeit von Protein-Produktion, wie die Pflanzen bereit sein wird, ca. 1-2 Wochen nach Agroinfiltration 11 ernten. Dies ist deutlich schneller als die Prozesse der Erzeugung, Auswahl und Bestätigung von stabilen transgenen Linien, die mehrere Monate dauern kann bis zu einem Jahr. Dies ist aber auch die Begrenzung der transienten Expressionssystem, da es nicht ergeben genetisch stabile Anlage lines, die verwendet werden, um eine Samenbank für groß angelegte kommerzielle Produktion erzeugen kann. Trotzdem haben Ansätze entwickelt worden, um in großem Maßstab transiente Expression zu verbessern. Hier zeigen wir eine Methode zur Erzeugung von transienten Protein-Expression Nicotiana benthamiana Pflanzen mittels viraler Vektoren dekonstruiert von A. geliefert tumefaciens.
Zwei wichtige Methoden werden für die Lieferung von A. entwickelt tumefaciens in Pflanzengewebe: bench scale Infiltration über eine Spritze und große Infiltration über Vakuumkammer. Beide Protokolle werden hier mit N. beschrieben benthamiana, die eng mit der gemeinsamen Tabakpflanze verwandt ist, als Wirtspflanze für transiente Expression von zwei fluoreszierende Proteine: das grün fluoreszierende Protein (GFP) aus Qualle Aequorea victoria und der rot fluoreszierendes Protein aus Discosoma Koralle (DsRed) 12,13. N. benthamiana ist die häufigste Wirtspflanzerekombinantes Protein, weil es zugänglich für genetische Transformation ist, können große Mengen an Biomasse rasch ergeben, und ist ein überaus produktiver Saatguthersteller für Scale-up-Produktion 14. Ein weiterer Vorteil der Verwendung von N. benthamiana als Gastgeber für die Proteinexpression ist die Verfügbarkeit einer Vielzahl von Expressionsvektoren 2,5. In dieser Studie wurden zwei dekonstruiert virale Vektoren, eine auf einer Tabak-Mosaik-Virus (TMV) RNA Replikon System (magnICON Vektoren) und die andere von der Bohne yellow dwarf virus (BeYDV) DNA Replikon System (geminiviral Vektoren) 4,11 ermittelt, die 15-18, werden verwendet, um die GFP und DsRed-Gen tragen und sie geben in N. benthamiana Zellen über A. tumefaciens. Drei DNA-Konstrukte für GFP oder DsRed Expression mit magnICON Vektoren verwendet werden. Dazu gehören das 5'-Modul (pICH15879), das den Promotor und andere genetische Elemente für den Antrieb der Expression des Ziel-Gens, das 3'-Modul, das das Gen von Interesse (PICH-GFP oder PICH-DsRed) und der Integrase-Modul (pICH14011) für ein Enzym codiert, das die 5 'und 3'-Module miteinander integriert bei Expression 8,15. Drei DNA-Konstrukte werden auch für die Expression mit geminiviral Vektoren benötigt. Zusätzlich zu Vektoren, die Replikon des Zielgens (pBYGFP oder pBYDsRed) ist ein Vektor, der für die Replikation Protein (pREP110) für die Amplifikation der Ziel-Replikon 11,14,16 erforderlich. Darüber hinaus ist die Einbeziehung eines Vektors Codieren des Silencing Suppressor p19 aus Tomate buschigen stunt virus für hohe Zielgenexpression 11,16 gewünscht.
Im Allgemeinen gibt es drei wesentliche Schritte zur Einführung von Genen von rekombinanten Proteinen in Pflanzenzellen durch Agroinfiltration einschließlich Pflanzenwachstums, A. tumefaciens Kultur Vorbereitung und Infiltration. Da jeder Schritt ist entscheidend für den letztendlichen Erfolg dieses Verfahrens daher wird eine detaillierte Beschreibung für jede vorgesehen istsowohl für Spritze Infiltration und Vakuuminfiltration unten.
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Protocol
1. Plant Growth
- Platz 60 Torf Pellets in einem Anzuchtplatte. In 4 l Leitungswasser und lassen Sie den Torf Pellets absorbieren das Wasser für 2 Stunden.
- In 2 N. benthamiana Samen in jeder Torf Pellets mit einem seeder, decken Sie das Fach mit einem transparenten Kunststoff-Kuppel und es ihnen ermöglichen, in einem 25 ° C, 84% Luftfeuchtigkeit Umgebung mit einem 16/8 h Tag / Nacht-Zyklus (Abbildung 1A) keimen.
- Entfernen Sie die Kuppel zwei Wochen nach Aussaat, lassen Sie das Wasser aus dem Fach, und mit 2 L von Jacks Dünger in einer Konzentration von 1,48 g / L (Abbildung 1B). Weiter zu Pflanzen in einem 25 ° C, 50% Luftfeuchtigkeit Umgebung mit einem 16/8 h Tag / Nacht-Zyklus wachsen. Versorgung 2 L von Jacks Dünger alle 2 Tage pro Fach.
- In Woche 4, übertragen Sie die Pflanzen mit Torf Pellets zu einem neuen Fach, das sechs Pflanzen beherbergt, um ausreichend Platz für weiteres Wachstum (Abbildung 1C) bereitzustellen, bis sie bereit sind, an Alter von 6 Wochen (Abbildung infiltriert werden1D).
2. A. tumefaciens Kultur Vorbereitung
2.1 Vorbereitung für Spritze Infiltration
- Serie A. tumefaciens GV3101 Stämme mit den geminiviral Vektoren p19, pREP110, pBYGFP und pBYDsRed auf LB-Agar-Platten mit Kanamycin (100 ug / ml). Streak ein Stamm pro Platte und wachsen bei 30 ° C für 48 Stunden.
- Ebenso Streifen und wachsen GV3101 Stämmen, die magnICON Vektoren der 5 'Modul (pICH15879), das 3'-Modul, das die Target-Gen von GFP oder DsRed (Pich-GFP oder Pich-DsRed) und Integrase (pCH14011) auf LB-Agar Platten mit Carbenicillin (100 ug / ml).
- Von einer einzigen Kolonie auf der LB-Agar Platte, impfen GV3101 Stämmen, geminiviral Vektoren in 3 ml YENB Medien (0,75% Bacto Hefeextrakt, 0,8% Nährbouillon, pH-Wert auf 7,5 mit NaOH) + Kanamycin (100 ug / ml) in eine 15-ml-Tube Kultur, wachsen die Flüssigkeit Kultur bei 30 ° C ina Schüttler über Nacht mit einer 300 rpm Drehzahl.
- Ebenso impfen und zu wachsen GV3101 Stämmen, magnICON Vektoren in YENB media + Carbenicillin (100 ug / ml) in einem Schüttler über Nacht bei 30 ° C.
- Messung und Aufzeichnung von OD 600-Werte für jede Flüssigkeit Kultur mit einem Spektralphotometer und verwenden Sie die folgende Formel, um das notwendige Volumen (V sub), um für eine neue Kultur mit einem Startpreis von 0,025 OD 600 werden in 10 ml YENB subkultiviert mit geeigneten Antibiotika berechnen .
V sub (ml) = (10 ml) x (0,025) / OD 600 - Transfer-V sub (ml) der Übernacht-Kultur auf (10 - V sub) ml YENB Medien mit entsprechenden Antibiotika für jeden Stamm. Wachsen die neue Kultur über Nacht bei 30 ° C in einem Schüttler mit einer 250 rpm Drehzahl bis die OD 600-Wert im Bereich von 1,7-2,0.
- Messen und aufzeichnen OD 600-Werte für jede Flüssigkeit Kultur und verwenden Sie die folgende Formel in CalcUlate das benötigte Volumen (V inf) in 50 ml Infiltration Puffer verdünnt werden, um einen endgültigen OD 600 von 0,12 für jeden Stamm geben.
V inf (ml) = (50 ml) x (0,12) / OD 600 - Transfer-V inf (ml) von jeder Kultur in ein Mikrozentrifugenröhrchen und Spin-Down der Zellen durch Zentrifugation bei 12.000 xg für 2 min, Überstand entfernen und dann die Zellen in 10 ml Infiltration Puffer (10 mM MES, pH 5,5; 10 mM MgSO 4) durch Vortexen kurz.
- Mischen resuspendiert Zellen pBYGFP + + pREP110 p19, drehen Sie die Zellen nach unten bei 12.000 xg für 2 min, und resuspendieren in insgesamt 50 ml Puffer Infiltration. Diese Kombination ist für Agrobakterien geminiviral Expression von GFP.
- Ebenso mischen die folgenden Kombinationen von Agrobakterien Zellen, Spin-down und resuspendieren sie in 50 ml Puffer Infiltration. Dazu gehören (1) pBYDsRed + + pREP110 p19 für geminiviral Expression von DsRed, (2) pBYGFP + + pBYDsRed pREP110+ P19 für geminiviral Co-Expression von GFP und DsRed, (3) pREp110 + p19 als negative Kontrolle geminiviral Ausdruck, (4) Pich-GFP + + pICH15879 pCH14011 für magnICON Expression von GFP, (5) Pich-DsRed + + pICH15879 pCH14011 für magnICON Expression von DsRed, und (6) pICH15879 + pCH14011 als negative Kontrolle für magnICON Ausdruck.
2.2 Vorbereitung für Vakuuminfiltration
- Impfen und Kultur jedes GV3101 Stamm, geminiviral Vektoren oder magnICON Vektoren in 15 ml YENB Medien mit entsprechenden Antibiotika in einem 50 ml Autoklaven überführt und über Nacht wachsen wie für Spritze Infiltration oben beschrieben.
- Messung und Aufzeichnung von OD 600-Werte für jede Flüssigkeit Kultur mit einem Spektralphotometer und verwenden Sie die folgende Formel, um das notwendige Volumen (V sub), um für eine neue Kultur mit einem Startpreis von 0,025 OD 600 werden in 250 ml YENB subkultiviert mit geeigneten Antibiotika berechnen .
V sub 600 - Transfer-V sub (ml) der Übernacht-Kultur auf (250 - V sub) ml YENB Medien in einer 1 L autoklavierte Kolben mit geeigneten Antibiotika für jeden Stamm und wachsen die neue Kultur über Nacht wie für Spritze Infiltration oben beschrieben.
- Messen und aufzeichnen OD 600-Werte für jede Flüssigkeit Kultur und verwenden Sie die folgende Formel, um das notwendige Volumen (V inf) in 3 L der Infiltration verdünnt werden, um eine endgültige OD 600 von 0,12 für jeden Stamm geben berechnen.
V inf (ml) = (3000 ml) x (0,12) / OD 600 - Pellet resuspendieren und V inf (ml) von jeder Kultur in Infiltration Puffer für Spritze Infiltration beschrieben und mischen Sie die resuspendierten Kulturen nach den Kombinationen für Spritze Infiltration beschrieben. Repellet die gemischten Agrobakterien Zellen resuspendieren und sie in 3 L der Infiltration Puffer.
3.1 Spritze Infiltration
- Wählen Sie vier 6-Wochen alten N. benthamiana Pflanzen mit 5 verlässt jeder. Die ersten drei Blätter von oben gezählt von jeder Pflanze wird vollständig mit einer der Kombinationen von A. infiltriert tumefaciens-Stämme in Infiltration Puffer. Das vierte Blatt wird spot-infiltriert mit allen vier Stamm-Kombinationen für geminiviral Ausdruck oder allen drei Kombinationen für magnICON Ausdruck. Das letzte Blatt auf jeder Anlage wird mit einer Kombination aus negativen Kontrollen infiltriert werden.
- Erstellen einer kleinen Einschnitt mit einer Nadel in der Epidermis an der Rückseite des Flügels (Abbildung 2A). Vorsicht: Achten Sie darauf, nicht zu kratzen, so hart wie zu durchbohren das Blatt durch beide Seiten, da die Zellen in der Agrobakterien Infiltration Mischung wird durch die Punktion auf die andere Seite des Blattes passieren.
- Nehmen Sie einen festen Halt der Vorderseite des Blattes und unter sanftemGegendruck der nick mit dem Daumen einer Hand, injizieren die Mischungen in Agrobacterium Infiltration Puffer in die nick mit einer Spritze ohne Nadel (Abbildung 2B). Hinweis: Da die Agrobacterium Gemisch tritt die Interzellulärraum des Blattes, das infiltrierte Bereich wird sichtbar dunkleren Grün drehen (Abbildung 2C).
- Fahren Sie mit dem Agrobacterium Mischungen in die nick injizieren, bis die dunkleren grünen Kreis stoppt, um zu erweitern. Erstellen Sie eine weitere nick und wiederholen Sie die Schritte, bis die gesamte 3.1.2-3.1.4 Blatt infiltriert wird und das ganze Blatt wird dunkler grün für die ersten drei Blätter und das letzte Blatt.
- Für das vierte Blatt jeder Pflanze, werden alle vier (geminiviral Vektor) oder drei (magnICON Vektor) Kombinationen hinein infiltriert werden. Machen Sie einen nick für jede Kombination von Agrobacterium-Stämme, und infiltrieren jede nick mit einer Kombination.
- Nach der Infiltration bewegen Pflanzen wieder zum Wachstum Zimmer und monitor Proteinexpression zwischen 2-15 Tage nach der Infiltration (dpi).
3.2 Vakuuminfiltration
- Legen Sie eine Badewanne in einem Vakuum-Exsikkator und Transfer 3 L Infiltration Puffer, die Agrobacterium-Stämme in die Wanne. Verbinden Sie den Exsikkator zu einem Vacuubrand Membran-Vakuumpumpe (3A).
- Legen Sie eine Pflanze kopfüber auf den Exsikkator Platte (3B) und senken Sie die Platte mit der Pflanze, bis das gesamte Blatt und Stamm-System wird in den Puffer Infiltration mit der Platte ruht oben auf der Wanne untergetaucht. Setzen Sie den O-Ring Exsikkator entlang des Randes und setzen Sie den Deckel auf den Exsikkator Kammer (3C).
- Einschalten der Vakuumpumpe und den Startzeitpunkt, wenn das Vakuum erreicht 100 mbar. Langsam öffnen Sie das Ablassventil auf dem Exsikkator nach 1 min bei 100 mbar bis zum Eingang von Agrobakterien in die Zwischenräume des untergetauchten Pflanzengewebe zu ermöglichen. Wiederholen Sie diesen Schritt ein additionalen Zeit, um gute Infiltration zu gewährleisten.
- Nach der Infiltration, nehmen Sie die Pflanze aus dem Exsikkator und steckte es wieder in die aufrechte Position. Bewegen Pflanzen wieder zum Wachstum Zimmer und Monitor Proteinexpression zwischen 2-15 dpi.
4. Fluorescent Protein Detection and Photography
- Ausgehend von 2 dpi, move Pflanzen in dunklen Raum und Glanz UV-Licht auf der Rückseite des infiltrierten Blätter mit einem handgeführten UV-Lampe.
- Beachten Sie die grüne Fluoreszenz von GFP oder die rote Fluoreszenz von DsRed. GFP gibt ein stärkeres Signal mit langwelligen UV-Licht, während DsRed ist stärker unter kurzwelligem UV-Licht.
- Machen Sie Fotos von fluoreszierenden Blätter mit einer normalen Digitalkamera ohne Blitz.
- Bewegen Pflanzen wieder zum Wachstum Zimmer nach Beobachtung oder Fotografie.
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Representative Results
1. Expression von fluoreszierenden Proteinen durch Spritze Infiltration
Um die Wirksamkeit der Spritze Infiltration von Agrobacterium in Pflanzengewebe zu demonstrieren, testeten wir die Expression von zwei fluoreszierenden Proteinen - GFP und DsRed - von zwei verschiedenen dekonstruiert Anlage virale Vektoren - geminiviral und magnICON - in N. benthamiana. Für N. benthamiana Blätter, die vollständig mit Agrobakterien haltigen geminiviral Vektoren wurden infiltriert wurde GFP-Expression über die gesamte Blattfläche unter UV-Licht ab so früh wie 2 dpi beobachtet und erreichte Spitzenwert Akkumulation bei 4 dpi (4C). Diese frühe GFP-Expression durch geminiviral Vektor ist konsistent mit früheren Ergebnissen anderer rekombinanter Proteine 14,16,18,19. Im Gegensatz dazu verlässt mit magnICON Vektor enthaltenden Agrobacterium Kombinationen zeigten GFP-Fluoreszenz erst nach 5 dpi und erreicht seine maximale accumulati infiltriertan um 7 dpi (4D). Keine grüne Fluoreszenz von Blättern mit Negativkontrolle Agrobacterium Mischungen pREP110 infiltriert beobachtet + p19 (4B) oder pICH15879 + pCH14011 (Daten nicht gezeigt), was darauf hinweist, dass die Fluoreszenz spezifisch für das GFP-Gen war und nicht das Ergebnis von Hintergrundfluoreszenz von die Blätter. An seiner Spitze Akkumulation, ist die Fluoreszenz magnICON Vektor-exprimierten GFP intensiver als das von geminiviral Vektor (4C und 4D), ähnlich zu den Ergebnissen zuvor für andere rekombinante Proteine 8,18 erhalten. Die zeitliche Expressionsmuster und die relative Fluoreszenzintensität von DsRed sind ähnlich wie GFP (Daten nicht gezeigt). Keine größeren Nekrosen auf den Blättern mit GFP-Konstrukte (4A) infiltriert beobachtet. Ähnliche Ergebnisse wurden auch für DsRed-exprimierenden Pflanzen beobachtet, was anzeigt, dass weder fluoreszierendes Protein hochgiftig Anlage ce istlls. Allerdings wurde in der lokalen Nekrose nick Ort beobachtet, und sie erschien als "Löcher" in den Fotografien (Abbildung 4). Wenn beide fluoreszierenden Proteine auf dem gleichen Blatt über geminiviral Vektoren mit Spritze spot-Infiltration zum Ausdruck gebracht wurden, wurden sie mit ihrer erwarteten fluoreszierende Farbe in der Stelle, wo sie infiltriert wurden (Abbildung 5) nachgewiesen. Interessanterweise co-Infiltration von GFP und DsRed in gelbliche Fluoreszenz ergab (Abbildung 5). Die Intensität der DsRed-Fluoreszenz zu sein schien schwächer als die der GFP auf demselben Blatt. Dies kann jedoch nicht unbedingt die schwächere Expression von DsRed, sondern vielmehr aufgrund der weniger-als-optimale Anregung durch UV-Licht DsRed. Insgesamt zeigen unsere Ergebnisse, dass Spritze Infiltration effizient stellt rekombinante Gen-tragenden Agrobakterien in Blätter und führte robust Ausdruck unserer Zielproteine. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass diese Methode die Flexibilität ermöglichtkeit, entweder infiltrieren ganze Blätter für maximale Akkumulation von einem Zielprotein oder an den Spot-infiltrieren mehrere Protein-Targets mit mehreren Vektoren für den Vergleich ihrer Expression und Expression.
2. Expression von fluoreszierenden Proteinen durch Vakuuminfiltration
Vakuuminfiltration wurde ebenfalls geprüft, um eine skalierbare Agroinfiltration Methode, die für die großtechnische Herstellung von rekombinanten Proteinen durch pflanzliche transiente Expression Systemen verwendet werden können zu entwickeln. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die zeitliche Expression von GFP oder DsRed durch geminiviral und magnICON Vektoren nicht durch die Änderung der Infiltration Verfahren verändert und blieben ähnlich der Spritze Infiltration. Da die gesamten Dreharbeiten einer Pflanze wird in der Infiltration Mischung während Vakuuminfiltration untergetaucht wurde die Fluoreszenz für GFP (Abbildung 6) für alle Blätter der infiltrierten Pflanzen beobachtet. Verglichen mit Spritze Infiltration ist es robust und achieve Infiltration von jeder Pflanze mit einem viel kürzeren Zeitraum. Zum Beispiel dauert es eine qualifizierte Studenten 15 min-Spritze infiltrieren eine ganze 6 Wochen alten N. benthamiana Pflanze. Im Gegensatz dazu kann die gleiche Anlage in 3 min durch Vakuum werden von Anfang bis Ende und mehrere Pflanzen können in der gleichen Zeit infiltriert werden infiltriert.
Abbildung 1. N. benthamiana Pflanzenwachstum Torfquelltöpfe und Wachstum Tabletts. Wildtyppflanzen bei 0 (A), 2 (B), 4 (C) und 6 (D) Wochen nach der Aussaat.
Abbildung 2. Spritze Infiltration von N. benthamiana Blättermit Agrobacterium tumefaciens. GV3101 von A. tumefaciens beherbergen GFP-exprimierenden magnICON Vektoren wurden in Infiltration Puffer resuspendiert und in eine Spritze ohne Nadel. Ein nick wurde mit einer Nadel auf der Rückseite eines 6 Wochen alten Pflanze Blatt (A) erzeugt. Die Öffnung der Spritze wurde gegen den nick (B) und in Agrobakterien Infiltration Puffer wurden in den interzellulären Raum des Blattes über den nick (C) injiziert positioniert.
Abbildung 3. Vacuum Infiltration von N. benthamiana Blätter mit Agrobacterium tumefaciens. Stamm GV3101 von A. tumefaciens enthält Zielprotein-exprimierenden Vektoren wurden in infiltratio resuspendiertn Puffer und in einen 3 L Wanne. Die Wanne wurde dann in einen Vakuumexsikkator, die mit einer Vakuumpumpe (A) verbunden platziert. A 6-Wochen alte Anlage wurde kopfüber auf den Exsikkator Platte (B) platziert. Die gesamte Blatt und Stamm System wurde dann in die Wanne eingetaucht, wenn die Platte oben auf der Kammer (C) gebracht wurde. Agroinfiltration wurde durch Anlegen und Freigeben eines Vakuum bei 100 mbar zweimal für 1 min erreicht. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
Abbildung 4. Expression von GFP in Spritze agroinfiltrated Blätter. Entire N. benthamiana Blätter wurden mit dem Stamm GV3101 von A. infiltriert tumefaciens beherbergen das GFP-Gen in einer geminiviral (A und C) oder magnICON vectoder (D). Negative Kontrolle Blätter wurden mit Agrobakterien-Stämme, die nicht enthalten, dass die GFP-Gen (B) infiltriert. Die Blätter wurden unter weißem Licht (A) oder UV-Licht (BD) bei 4 dpi (AC) oder 7 dpi (D) fotografiert.
Abbildung 5. Expression von GFP und DsRed in Spritze spot-agroinfiltrated Blätter. N. benthamiana Blätter waren mit GV3101 beherbergen die GFP, DsRed oder GFP und DsRed sowohl Gene in geminiviral Vektoren spot-infiltriert. Eine negative Kontrolle vor Ort wurde mit pREP110 + p19 infiltriert. Die Blätter wurden unter UV-Licht bei 4 dpi fotografiert.
Abbildung 6. Expression von GFP in Vakuum agroinfilButter und Blättern. N. benthamiana Blätter wurden mit GV3101 beherbergen das GFP-Gen in magnICON Vektoren infiltriert. Die Blätter wurden unter UV-Licht bei 7 dpi fotografiert.
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Discussion
Die steigenden Anforderungen an die Protein-basierten Pharmazeutika weltweit erfordern neue Produktion Plattformen, die robuste, skalierbare, kostengünstige und sicher sind. Pflanzen haben gezeigt, dass eine der vielversprechendsten alternativen Produktionssystemen für Herstellung pharmazeutischer Proteine sein. In den letzten Jahren wurde die Entwicklung von deconstructed Virus basierende Vektoren transienten Expression von Proteinen in Pflanzen, die eine wesentliche Steigerung der Geschwindigkeit und Ausbeute der Anlage Expressionssysteme 2,10 aktiviert. Zur weiteren Optimierung der Nützlichkeit des transienten Expressionssystem zeigen wir eine einfache, aber effiziente und skalierbare Ansatz zur Ziel-Gen, das in Agrobacterium Pflanzengewebe einzuführen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Agroinfiltration entweder mit der Spritze oder Vakuum-Methode bei der effizienten Einführung von Agrobacterium in die Blätter und robust Produktion von zwei fluoreszierenden Proteinen, GFP und DsRed geführt hat.
Um das zu gewährleisten efficient Agroinfiltration und Protein-Produktion, müssen die folgenden kritischen Parameter sorgfältig kontrolliert werden. Abweichungen von diesen Parametern kann in niedrigen Agroinfiltration Effizienz und wiederum niedriges Ziel Proteinexpression führen.
1. Pflanze Entwicklungsstadium und Gesundheit. Die wahrscheinlichste Variable in diesem Verfahren zwischen den Laboratorien ist das Pflanzenmaterial für die Infiltration. Während Pflanzen erscheinen phänotypisch ähnliche, auf ihre Entwicklungsstadium und physiologischen Zustand ihre Kompetenz in Expression rekombinanter Proteine signifikant. Bestimmte Parameter, die Auswirkungen auf das Pflanzenwachstum und die Proteinexpression Ebenen haben, zählen: Temperatur, Luftfeuchtigkeit, Lichtintensität, die Lieferung von Dünger, Pflanzenschutzmittel Impfung Alter, und die Zeit für die maximale Akkumulation von Zielprotein nach Blatt Infiltration erforderlich. Pflanzen müssen konsequent erhalten gleiche Mengen von Wasser und Dünger täglich. Geringfügige Änderungen in den Bedingungen des Pflanzenwachstums kann drastisch verändern die endgültige size von Pflanzen und deren Fähigkeit, rekombinante Proteine zu exprimieren. Unsere bisherigen Studien zeigen, dass Pflanzen unter natürlichen Lichtbedingungen gewachsen Blattbiomasse ergab, aber Ausbeute an Protein ist viel geringer als die unter Kunstlicht 4 gewachsen. Daher ist die Verwendung künstlichen Lichts ist die Methode der Wahl für das Pflanzenwachstum. Unsere Ergebnisse zeigen auch, dass ein 16 Stunden Licht / 8 h Dunkel-Zyklus bei 25 ± 0,5 ° C ist die optimale Voraussetzung für N. wachsen benthamiana Pflanzen unter solchen künstlichen Beleuchtung 4. Wir haben gezeigt, dass unter diesen Bedingungen, 6-Wochen-Pflanzen die optimale Alter für GFP und DsRed Expression sind, wie sie High-Level von fluoreszierenden Proteinen, während die Ausbeute an Biomasse ist ausreichend produzieren. Pflanzen älter als 6-Wochen produzieren mehr Biomasse sind aber zu groß, um in die Infiltration Kammer 4 passen. Außerdem beginnen Blumen nach 6 Wochen Wachstum entwickeln, beeinträchtigen rekombinante Proteinexpression 4. Folglich enthalten 6-Wochen-Pflanzen die optimale leaf Material, das die kombinierte Notwendigkeit Biomasseertrag, Protein-Akkumulation, und die Leichtigkeit der Agroinfiltration ausgleicht.
2. Wachstum und Infiltration Konzentration von Agrobacterium. Ein weiterer wichtiger Punkt bei dieser Methode ist die Kontrolle von Wachstum und Infiltration Konzentration von A. tumefaciens, wie durch die OD 600 gemessen. In jeder Kultur und Subkultur Schritt Stämme von A. tumefaciens muss angebaut werden, aber nicht über die OD 600 bezeichnet. Wir haben mehrere Konzentrationen von A. untersucht tumefaciens für die endgültige Infiltration von N. benthamiana Blätter 4. Low Agrobacterium Konzentration wird in der unzureichenden Bereitstellung von Ziel-Genen in Pflanzen führen, was zu einer niedrigen Protein-Expression. Auf der anderen Seite, wenn die Konzentration der Infiltration Agrobacterium zu hoch ist, löst er eine Überempfindlichkeitsreaktion in dem infiltrierten Gewebe und zu Nekrosen 20. Unser rrgebnisse gezeigt, dass OD 600 = 0,12 Agrobacterium-Stamm die Notwendigkeit für maximale Fördermenge von Gen-Konstrukt gleicht ohne Nekrosen und Zelltod. Die gewünschte Dichte OD 600 von Agrobacterium kann durch konsequente Kulturmedien, Temperatur und Kultur Zeit erhalten werden.
3. Für Vakuuminfiltration, ist es wichtig, die bezeichneten Unterdruck und Infiltration Dauer folgen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass eine 3 L Wanne Agrobacterium Infiltration Mischung verwendet werden, um etwa 30 Anlagen infiltrieren werden. Wenn mehr als 30 Anlagen, die infiltriert werden sollen, muss eine neue Charge von Agrobacterium Infiltration Gemisch versorgt werden.
4. Die spezifischen Parameter in diesem Papier werden zur Expression von Proteinen unter Verwendung von N. optimiert benthamiana Pflanzen unter bestimmten Bedingungen gewachsen oben beschrieben mit dekonstruiert Virus-basierten Vektoren. Wie bereits erwähnt, ter schwierigste Parameter in dieser Methodik steuern ist das Pflanzenmaterial. Wir haben eine Vielzahl von Impfstoffen und therapeutischen Proteinen unter Verwendung von Pflanzen und die Infiltration Verfahren, das wir hier beschrieben, und erhalten hervorragende Ergebnisse in allen Fällen 4,8,14,18,21-23 ausgedrückt. Diese Ergebnisse zeigten, dass die Bedingungen, die wir entwickelt haben, optimal für die Proteinexpression sind. Allerdings, wenn verschiedene Wirtspflanzen, Expressionsvektoren oder verschiedene N. Benthamiana Anbaubedingungen für die Infiltration verwendet wurden, würde jeder Parameter in dieser Methode müssen durch Experimente neu optimiert werden.
Insgesamt haben wir gezeigt, dass Agroinfiltration mit Spritze und Vakuum eine einfache, aber effiziente Methode zur Target-Gen trägt Agrobacterium in Pflanzen für transiente Expression rekombinanter Proteine einzuführen. Beide Methoden haben ihre einzigartigen Vorteile je nach Ziel der Forschung und Produktion. Spritze Infiltration ist einfach, requires nur kleine Volumina von Agrobacterium Kultur und muss nicht teuer Pumpen und Vakuum Kammern. Wie in diesem Bericht gezeigt, hat die Flexibilität, entweder infiltrieren das gesamte Blatt mit einem Ziel-Gen oder verwenden Stelle Infiltration Gene mehrerer Ziele auf ein Blatt einzuführen. Die gesamte Blatt Infiltration Verfahren kann bei kleinen Labormaßstab Expression von rekombinantem Protein für die biochemische Charakterisierung, Reinigung und präklinischen funktionelle Studien 1 verwendet werden. Im Gegensatz dazu können vor Ort Infiltration verwendet, um mehrere Protein-Targets auf ein Blatt ausdrücken, ihre Ausbeute, Ausdruck Kinetik und Toxizität der Pflanzen zu vergleichen. Es kann auch verwendet werden, um die Expression eines Reporter-Protein wie GFP vergleichen oder DsRed angetrieben von verschiedenen Expressionsvektoren auf dem gleichen Blatt. Als Ergebnis können verschiedene Vektor die Fähigkeit in Fahrt Proteinakkumulation und ihre Expression Kinetik charakterisiert werden. Die Einfachheit der Spritze Infiltration ermöglicht auch einemachbar Werkzeug zu lehren und trainieren High School und Studenten in das Thema Bio-und Gentechnologie.
Im Vergleich mit Spritze Infiltration erfordert Vakuuminfiltration die Investition von Vakuumpumpen und Kammern und größere Mengen von Agrobacterium Kulturen. Daher ist es nicht die Methode der Wahl, wenn nur ein paar Pflanzen, die infiltriert werden müssen. Dennoch bietet sie die Skalierbarkeit, die nicht durch eine Spritze Infiltration angepasst werden kann. Es ist robust und kann eine große Anzahl von Pflanzen in einem kurzen Zeitraum zu infiltrieren. Mit dem Umfang in diesem Bericht enthaltenen Angaben, sind wir in der Lage, gram Ebene gereinigt pharmazeutischen Proteinen ausreichend für eine Phase I der klinischen Studie 4 produzieren. Ferner kann dieser Prozess weiter vergrößerten für die kommerzielle Herstellung von pharmazeutischen Proteinen aus Pflanzen. Zum Beispiel sind Verfahren dazu bestimmt ist, unter Vakuum infiltriert drei Tonnen N. benthamiana Pflanzen pro Stundein einem Scale-up-Betrieb 24. Ein weiterer Vorteil der Vakuum-Infiltration ist, dass es verwendet werden, um Pflanzen, die nicht zugänglich sind, für die Spritze Infiltration agroinfiltrate werden.
Zusammenfassend stellt die Kombination aus Spritze und Vakuuminfiltration Forscher, Biotechnologen und Lehrer eine einfache, effiziente, robuste und skalierbare Methode für die transiente Expression von rekombinanten Proteinen in Pflanzen. Es wird dadurch wesentlich erleichtert die Entwicklung und Produktion von pharmazeutischen Proteinen und Förderung von Wissenschaft Bildung.
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Disclosures
Die Autoren haben keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Acknowledgments
Wir danken R. Sun und andere Studenten von Chens Labor für ihren Beitrag zur Material-Generation zu pflanzen. Wir danken auch Dr. D. Green für seine Unterstützung von Bachelor-Forschung in der Hochschule für Technik und Innovation (KTI). Diese Forschung wurde teilweise durch Zuschüsse NIH U01 AI075549 und 1R21AI101329 zu Q. Chen und eine SSE Zuschuss von CTI der Arizona State University auf Q. Chen unterstützt. K. Leuzinger, M. Dent, J. Hurtado und J. Stahnke sind Studenten von der SSE Zuschuss unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| GFP | Invitrogen | V353-20 | www.invitrogen.com See reference: Lico and Chen, et al 2008 |
| DsRed | Clontech | 632152 | www.clontech.com See reference: Baird and Zacharias, et al 2000 |
| MagnICON Vector | Icon Genetics | n/a | www.icongenetics.com See reference: giritch and Marillonnet, et al 2006 |
| Geminiviral Vector | Author’s Lab | n/a | See reference: Chen and He, et al 2011 |
| N. benthamiana | Author’s Lab | n/a | herbalistics.com.au |
| Agrobacterium tumefaciens strain gv3101 | Author’s Lab | n/a | See reference: Lai and Chen 2012 |
| LB Agar Carbenicillin-100, plates | Sigma | L0418 | www.sigmaaldrich.com |
| LB Agar Kanamycin-50, plates | Sigma | L0543 | www.sigmaaldrich.com |
| Magnesium sulfate hepa hydrate | Sigma | M2773-500 g | www.sigmaaldrich.com |
| Bacto-Tryptone | Fisher | 73049-73-7 | www.fishersci.com |
| Bacto Yeast Extract | Becton, Dickinson CO. | REF 212750 | www.bd.com |
| Difco Nutrient Broth | Becton, Dickinson CO. | REF 234000 | www.bd.com |
| MES hydrate Buffer | Sigma | M8250-1kg | www.sigmaaldrich.com |
| Carbenicillin | Sigma | C1613-1ML | www.sigmaaldrich.com |
| Kanamycin | Sigma | 70560-51-9 | www.sigmaaldrich.com |
| Sodium Hydroxide | Sigma | 221465 | www.sigmaaldrich.com |
| Jack’s Fertilizer | Hummert International | Jul-25 | www.hummert.com |
| Equipment | |||
| Vacuubrand MD4 Vacuum Pump | Fisher | 13-878-113 | www.fishersci.com |
| Vacuum Air Regulator Valve | Fisher | NC9386590 | www.fishersci.com |
| Desiccator 12 1/8" with O ring | Fisher | 08-594-15C | www.fishersci.com |
| 3 L Tub | Rubber-Maid | n/a | Rubbermaid Servn’ Saver Bowl, 10-cup will work |
| plate/shelf 230ML | Fisher | NC9489269 | www.fishersci.com |
| Peat Pellet | Hummert International | 14-2370-1 | www.hummert.com |
| Propagation Tray Dome | hydrofarm | 132052 | www.hydroponics.net |
| Propagaiton Tray | hydrofarm | 138758 | www.hydroponics.net |
| Virbo Hand Seeder | Gro-Mor INC | n/a | www.gro-morent.com |
| Flora Cart 4 shelf | Hummert International | 65-6924-1 | www.hummert.com |
| 15 ml Round Bottom Culture Tubes | Sigma | CLS430172-500EA | http://www.sigmaaldrich.com |
| Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | www.bio-rad.com |
| Spectrophotometer Cuvettes | Bio-Rad | 223-9950 | www.bio-rad.com |
| Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1415-2500 | www.usascientific.com |
| Benchtop Centrifuge | Bio-Rad | 166-0602EDU | www.bio-rad.com |
| Incubator/Shaker | Eppendorf | Excella E25 | www.eppendorf.com |
| Ultraviolet Light Model#: UVGL-25 | UVP | 95-0021-12 | www.uvp.com |
References
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