Summary
Piante offrono un sistema innovativo per la produzione di proteine farmaceutiche su scala commerciale che è più scalabile, economica e sicura rispetto paradigmi attuale espressione. In questo studio, riportiamo un approccio semplice e conveniente, ma scalabile per introdurre target-gene contenente
Abstract
Colture cellulari di mammifero è la più importante piattaforma per la produzione commerciale di vaccini umani e delle proteine terapeutiche. Tuttavia, non può soddisfare la crescente domanda mondiale di prodotti farmaceutici grazie alla sua scalabilità limitata e costo elevato. Le piante hanno dimostrato di essere una delle più promettenti alternative piattaforme di produzione farmaceutica che sono robuste, scalabili, a basso costo e sicuro. Il recente sviluppo di vettori basati sul virus ha permesso rapida e di alto livello di espressione transiente di proteine ricombinanti in piante. Per ottimizzare ulteriormente l'utilità del sistema di espressione transiente, dimostriamo una metodologia semplice, efficiente e scalabile per introdurre target-gene contenente Agrobacterium in tessuto vegetale in questo studio. I nostri risultati indicano che agroinfiltration sia con siringa e vuoto metodi hanno portato alla introduzione efficiente di Agrobacterium in foglie e produzione robusta di due proteine fluorescenti, GFP e DsRed. Inoltre,dimostriamo i vantaggi unici offerti da entrambi i metodi. Siringa infiltrazione è semplice e non richiede attrezzature costose. Esso permette anche la flessibilità di entrambi infiltrare l'intero congedo con un gene bersaglio, o per introdurre geni di bersagli multipli su un unico foglio. Quindi, può essere utilizzato per l'espressione scala di laboratorio di proteine ricombinanti e per confrontare diverse proteine o vettori di espressione yield o cinetica. La semplicità della siringa infiltrazione suggerisce anche la sua utilità nella scuola superiore e l'istruzione universitaria per il soggetto delle biotecnologie. Al contrario, l'infiltrazione di vuoto è più robusto e può essere scalata-up per la produzione commerciale di proteine farmaceutiche. Esso offre anche il vantaggio di poter agroinfiltrate specie vegetali che non sono suscettibili di infiltrazione siringa come lattuga e Arabidopsis. Nel complesso, la combinazione di siringa e agroinfiltration vuoto fornisce ai ricercatori ed educatori un semplice, efficiente e robustometodologia per l'espressione proteica transiente. Esso agevolerà notevolmente lo sviluppo di proteine farmaceutiche e promuovere l'educazione scientifica.
Introduction
Dal 1970, le piante sono state esplorate come alternative alle colture cellulari di mammifero, insetto, e batteriche per la produzione commerciale di proteine ricombinanti e proteine terapeutiche 1. Sistemi a base vegetale per l'espressione di biofarmaci hanno mostrato risultati promettenti negli ultimi anni come molti nuovi trattamenti per le malattie, come il morbo di Gaucher 2, e l'influenza aviaria H5N1 3, hanno dimostrato il successo negli studi clinici. Lo sviluppo di meccanismi competenti per l'espressione di proteine ricombinanti nelle piante nei decenni successivi gli esperimenti iniziali ha creato il potenziale per i sistemi a base di piante per alterare l'attuale paradigma di produzione di proteine per tre motivi principali. In primo luogo, vi è una notevole diminuzione dei costi come bioreattori mammiferi, insetti e batteri richiedono notevoli costi di avvio, i media di crescita costosi e complicati processi di depurazione a valle 4. La creazione di pianta transgenica stabilelinee permette loro anche di surclassare la scalabilità di altri sistemi di espressione di proteine come le piante che esprimono possono essere coltivate e raccolte su scala agricola 5. In secondo luogo, sistemi di espressione a base vegetale riducono significativamente il rischio di trasmissione di un patogeno umano o animale dall'host proteina-esprimendo agli esseri umani, dimostrando superiorità nella pubblica sicurezza 6. Infine, impianti utilizza un sistema eucariotico endomembrane che è simile alle cellule di mammifero, permettendo una corretta modificazione post-traduzionale di proteine compreso glicosilazione e l'assemblaggio delle proteine multiple-subunità 7. Questa capacità pone sistemi a base vegetale avanti di quelli basati su sistemi procariotici, come batteri, poiché un numero più ampio di proteine ricombinanti farmaceutiche, inclusi anticorpi monoclonali (mAb), hanno una struttura più complessa e richiedono ampie modifiche post-traduzionali o da montaggio 8.
Ci sono due principali approdolori ad esprimere proteine ricombinanti nelle piante. Il primo è lo sviluppo di una linea transgenica stabilmente, in cui il DNA codificante per la proteina bersaglio viene clonato in una cassetta di espressione e introdotto sia ad genomi nucleari o cloroplasto. Così facendo, il DNA estraneo diventa ereditabile attraverso successive generazioni e consente enormemente migliorata scalabilità, ben oltre quella di altri sistemi di espressione 1. Introduzione di DNA esogeno al genoma nucleare è di solito realizzato da Agrobacterium tumefaciens infezione del tessuto vegetale o, meno spesso, da microproiettili bombardamento del tessuto 9. Ormoni vegetali sono poi utilizzati per indurre il differenziamento e la crescita di tessuto vegetale transgenica come radici e foglie. Trasformazione del genoma del cloroplasto non può essere raggiunto con A. tumefaciens, ma si basa interamente su particelle di oro o di tungsteno rivestite di DNA sparato balisticamente nelle cellule vegetali. Il secondo metodo di esprimere ricombinazionent proteina nelle piante è attraverso l'espressione transiente 10. In questo scenario, vettori derivati da virus ospitano il gene di interesse sono consegnati via A. tumefaciens di piante completamente sviluppate attraverso un processo chiamato agroinfiltration. Invece di integrare nel genoma della pianta, il costrutto genico espresso inizierà a dirigere la produzione transiente della proteina desiderata, che può essere raccolto e isolato dopo un breve periodo di incubazione. Espressione genica transiente offre il vantaggio di una maggiore accumulo di proteine generale così come un tempo maggiore di produzione di proteine, come piante saranno pronte raccogliere circa 1-2 settimane dopo agroinfiltration 11. Questo è significativamente più veloce rispetto ai processi di generazione, la selezione e la conferma delle linee di piante transgeniche stabili, che può richiedere diversi mesi a un anno. Questo però, è anche la limitazione del sistema di espressione transiente, in quanto non produrrà geneticamente stabile pianta lines che possono essere utilizzati per generare una banca di seme per la produzione commerciale su larga scala. Nonostante questo, sono stati sviluppati approcci per migliorare larga scala espressione transiente. Qui mostriamo un metodo di generazione di proteine che esprimono piante di Nicotiana benthamiana transitori utilizzando vettori virali decostruiti consegnati da A. tumefaciens.
Due metodi principali sono in sviluppo per la fornitura di A. tumefaciens in tessuto vegetale: panchina scala infiltrazione tramite siringa e infiltrazione larga scala tramite camera a vuoto. Entrambi i protocolli sono descritti usando N. benthamiana, che è strettamente legato alla pianta del tabacco comune, come la pianta ospite per l'espressione transiente di due proteine fluorescenti: la proteina fluorescente verde (GFP) dalle meduse Aequorea victoria e la proteina fluorescente rossa da Discosoma corallo (DsRed) 12,13. N. benthamiana è la pianta ospite più comune per laproteina ricombinante perché è suscettibile di trasformazione genetica, può produrre elevate quantità di biomassa rapidamente, ed è un produttore di seme prolifico per la produzione su scala industriale 14. Un altro vantaggio di usare N. benthamiana come ospiti per l'espressione proteica è la disponibilità di una varietà di vettori di espressione 2,5. In questo studio, i due vettori virali decostruiti, uno basato su un virus del mosaico del tabacco (TMV) RNA sistema replicone (vettori MagnICON) e l'altro derivato dal virus del nanismo giallo fagiolo (BeYDV) sistema replicone DNA (vettori geminiviral) 4,11, 15-18, sono utilizzati per trasportare il gene GFP e DsRed e consegnarli in N. cellule benthamiana via A. tumefaciens. tre costrutti di DNA saranno utilizzati per la GFP o espressione DsRed con vettori MagnICON. Essi comprendono 'modulo (pICH15879) contenente il promotore ed altri elementi genetici per guidare l'espressione del gene bersaglio, il 3' del modulo 5 contenente il gene di interesse (Pich-GFP o PICH-DsRed), e il modulo integrasi (pICH14011) codifica per un enzima che integra il 5 'e 3' insieme moduli sull'espressione 8,15. Sono necessari anche tre costrutti di DNA per l'espressione con vettori geminiviral. Oltre a vettori contenenti il replicone del gene target (pBYGFP o pBYDsRed), è richiesto un vettore codificante per la proteina di replica (pREP110) per l'amplificazione del target replicone 11,14,16. Inoltre, l'inserimento di un vettore codificante il tacere soppressore p19 del virus del rachitismo cespuglioso pomodoro è desiderato per il livello di espressione del gene target alto 11,16.
Ci sono generalmente tre fasi principali per l'introduzione di geni di proteine ricombinanti in cellule vegetali per agroinfiltration compresi crescita delle piante, A. tumefaciens cultura preparazione, e infiltrazione. Come ogni passaggio è fondamentale per il successo finale di questa procedura, quindi, una descrizione dettagliata per ognuno è fornitosia per infiltrazione siringa e vuoto infiltrazione sotto.
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Protocol
1. Crescita delle piante
- Luogo 60 torba pellet in un vassoio di propagazione. Aggiungere 4 L di acqua di rubinetto e lasciare che la torba pellet assorbire l'acqua per 2 ore.
- Aggiungere 2 N. benthamiana semi in ogni torba pellet utilizzando una seminatrice, coprire il vassoio con una cupola di plastica trasparente, e permettere loro di germinare in ° C, umidità ambiente 25 84% con un hr ciclo giorno / notte 16/8 (Figura 1A).
- Rimuovere la cupola due settimane dopo la semina, drenare l'acqua dal vassoio, e aggiungere 2 litri di fertilizzante di Jack ad una concentrazione di 1,48 g / L (Figura 1B). Continuare a crescere piante in ° C, umidità ambiente 25 50% con un hr giorno / ciclo notte 16/8. Fornitura 2 L di concime di Jack ogni 2 giorni per ogni vassoio.
- Alla settimana 4, trasferire le piante con palline di torba a un nuovo vassoio che ospita sei impianti di fornire uno spazio adeguato per l'ulteriore crescita (Figura 1C) fino a quando non sono pronti per essere infiltrato a 6 settimane di età (Figura1D).
2. A. tumefaciens Cultura Preparazione
2.1 Preparazione per Siringa Infiltration
- Streak A. tumefaciens GV3101 ceppi contenenti i vettori geminiviral p19, pREP110, pBYGFP e pBYDsRed su piastre di LB agar contenenti kanamicina (100 pg / ml). Striatura un ceppo per piastra e crescere a 30 ° C per 48 ore.
- Allo stesso modo, striscia e crescere GV3101 ceppi ospitano i vettori MagnICON del 5 'modulo (pICH15879), al 3' del modulo contenente il gene bersaglio di GFP o DsRed (Pich-GFP o Pich-DsRed) e dell'integrasi (pCH14011) su LB Agar piastre contenenti carbenicillina (100 pg / ml).
- Da una singola colonia sulla piastra di agar LB, inoculare GV3101 albergano ceppi vettori geminiviral in 3 ml di YENB supporti (0,75% estratto di lievito Bacto, 0,8% Nutrient Broth, aggiustare il pH a 7,5 con NaOH) + kanamicina (100 pg / ml) in una provetta di coltura ml a fondo rotondo 15, crescere la coltura liquida a 30 ° C inun agitatore notte con una velocità di rotazione 300 rpm.
- Allo stesso modo, inoculare e crescere GV3101 ceppi ospitano vettori MagnICON in YENB supporti + carbenicillina (100 mcg / ml) in un agitatore notte a 30 ° C.
- Misurare e registrare OD 600 valori per ogni coltura liquida con uno spettrofotometro e utilizzare la formula seguente per calcolare il volume necessario (V sub) possibile replicare per una nuova cultura con un diametro esterno di partenza 600 di 0.025 in 10 ml di mezzi YENB con antibiotici appropriati .
V inf (ml) = (10 ml) x (0,025) / OD 600 - Trasferimento V inf (ml) della coltura overnight a (10 - V sub) ml di mezzo YENB con antibiotici appropriati per ogni ceppo. Crescere la nuova cultura notte a 30 ° C in un agitatore con un tasso di rotazione 250 rpm finché il valore di OD 600 è nell'intervallo 1.7-2.0.
- Misurare e registrare OD 600 valori per ogni coltura liquida e utilizzare la formula seguente per calcUlate il volume necessario (V inf) diluiti in 50 ml di tampone di infiltrazione che invia un diametro finale 600 di 0,12 per ogni ceppo.
V inf (ml) = (50 ml) x (0,12) / OD 600 - Trasferimento V inf (ml) di ogni cultura in una provetta e centrifugare le cellule per centrifugazione a 12.000 xg per 2 minuti, rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 10 ml di tampone di infiltrazione (10 mM MES, pH 5.5, 10 mM MgSO 4) nel vortex brevemente.
- Mescolare risospeso cellule pBYGFP + pREP110 + p19, girare le celle in basso a 12.000 xg per 2 minuti, e risospendere in totale di 50 ml di tampone di infiltrazione. Questa combinazione Agrobacteria è per geminiviral espressione di GFP.
- Allo stesso modo, mescolare le seguenti combinazioni di cellule Agrobacteria, centrifugare e risospendere in 50 ml di tampone di infiltrazione. Essi includono (1) pBYDsRed + pREP110 + p19 per l'espressione geminiviral di DsRed, (2) pBYGFP + pBYDsRed + pREP110+ P19 per geminiviral co-espressione di GFP e DsRed, (3) pREp110 + p19 come controllo negativo di espressione geminiviral, (4) Pich-GFP + pICH15879 + pCH14011 per MagnICON espressione di GFP, (5) Pich-DsRed pICH15879 + + pCH14011 per l'espressione di MagnICON DsRed, e (6) pICH15879 + pCH14011 come controllo negativo per l'espressione MagnICON.
2.2 Preparazione per l'infiltrazione di vuoto
- Seminare e cultura ogni ceppo GV3101 contenente vettori geminiviral o vettori MagnICON in 15 ml di mezzi YENB con antibiotici appropriati in un pallone autoclavato 50 ml e crescere durante la notte come descritto per la siringa infiltrazione sopra.
- Misurare e registrare OD 600 valori per ogni coltura liquida con uno spettrofotometro e utilizzare la formula seguente per calcolare il volume necessario (V sub) possibile replicare per una nuova cultura con un diametro esterno di partenza 600 di 0.025 in 250 ml di mezzi YENB con antibiotici appropriati .
V sub 600 - Trasferimento V inf (ml) della coltura overnight a (250 - V sub) ml di mezzo YENB in un pallone da 1 L autoclavato con antibiotici appropriati per ogni ceppo e crescere la nuova coltura durante la notte come descritto sopra per siringa infiltrazione.
- Misurare e registrare OD 600 valori per ogni coltura liquida e utilizzare la formula seguente per calcolare il volume necessario (V inf) da diluire in 3 L di tampone infiltrazione di dare un OD finale 600 di 0,12 per ogni ceppo.
V inf (ml) = (3000 ml) x (0,12) / OD 600 - Pellet e risospendere V inf (ml) di ciascuna cultura in tampone infiltrazione come descritto per siringa infiltrazione e mescolare le culture risospeso secondo le combinazioni descritte per siringa infiltrazione. Repellet le cellule Agrobacteria misti e li Risospendere in 3 L di tampone infiltrazione.
3.1 Siringa Infiltrazione
- Scegliere quattro di 6 settimane vecchio N. piante benthamiana con 5 foglie ciascuno. Le prime tre foglie contando dall'alto di ogni pianta saranno infiltrate interamente con una delle combinazioni di A. tumefaciens tensioni nei buffer di infiltrazione. La quarta foglia sarà posto-infiltrati con tutte le combinazioni di deformazione quattro per l'espressione geminiviral o tutte e tre le combinazioni per l'espressione MagnICON. L'ultima foglia su ogni impianto verrà infiltrata con combinazioni di controlli negativi.
- Creare un piccolo nick con un ago nell'epidermide sul lato posteriore del foglio (Figura 2A). Attenzione: assicurarsi di non graffiare così difficile da perforare il foglio attraverso entrambi i lati, come le cellule agrobatteri nella miscela infiltrazione passeranno attraverso la puntura per l'altro lato della foglia.
- Prendere una stretta costante del lato anteriore della foglia e durante l'applicazione delicatacontropressione al nick con il pollice di una mano, iniettare miscele Agrobacterium in tampone infiltrazione nel nick con una siringa senza ago (Figura 2B). Nota: Poiché la miscela Agrobacterium entra nello spazio intercellulare della foglia, la zona infiltrata diventa verde visibilmente più scuro (Figura 2C).
- Continuare a iniettare miscele Agrobacterium nel nick fino a quando il cerchio verde scuro smette di espandersi. Creare un altro nick e ripetere i punti 3.1.2-3.1.4 finché l'intera foglia è infiltrata e tutta la foglia diventa verde scuro per le prime tre foglie e l'ultima foglia.
- Per la quarta foglia di ogni pianta, ogni quattro (vettore geminiviral) o tre (MagnICON vettore) combinazioni saranno infiltrati in esso. Fai un nick per ogni combinazione di ceppi di Agrobacterium, e infiltrarsi ogni nick con una combinazione.
- Dopo l'infiltrazione, muovere le piante di nuovo alla stanza crescita e Moniespressione della proteina tor tra 2-15 giorni dopo l'infiltrazione (dpi).
3.2 Vacuum Infiltrazione
- Mettere una vasca in un essiccatore a vuoto e il trasferimento 3 L tampone infiltrazione contenente i ceppi di Agrobacterium alla vasca. Collegare l'essiccatore ad una pompa a vuoto a membrana Vacuubrand (Figura 3A).
- Posizionare una pianta capovolta sulla piastra essiccatore (Figura 3B) e abbassare la piastra con la pianta finché l'intera foglia e sistema di gambo è sommersa nel buffer infiltrazione con la piastra di riposo in cima della vasca. Posizionare l'anello O essiccatore lungo il bordo e mettere il coperchio sulla camera di essiccatore (Figura 3C).
- Accendere la pompa del vuoto e avviare il cronometro quando il vuoto raggiunge 100 mbar. Aprire lentamente la valvola di rilascio sul essiccatore dopo 1 min a 100 mbar per consentire l'ingresso di Agrobacteria negli spazi interstiziali del tessuto vegetale sommersa. Ripetere questo passo si additionale tempo per assicurare una buona infiltrazione.
- Dopo l'infiltrazione, prendere la pianta di un essiccatore e rimetterlo in posizione verticale. Spostare le piante di nuovo alla stanza crescita e l'espressione della proteina del monitor tra 2-15 dpi.
4. Fluorescent Protein Detection e Fotografia
- Partendo da 2 dpi, piante spostare nella stanza buia e brillare luce UV sul lato posteriore delle foglie infiltrate con una lampada UV portatile.
- Osservare la fluorescenza verde della GFP o la fluorescenza rossa di DsRed. GFP emette un segnale forte con luce UV a onda lunga, mentre DsRed è più forte sotto raggi UV a onde corte.
- Scattare fotografie di foglie fluorescenti con una normale fotocamera digitale, senza il flash.
- Spostare le piante di nuovo alla stanza crescita dopo l'osservazione o la fotografia.
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Representative Results
1. Espressione di proteine fluorescenti con Siringa Infiltration
Per dimostrare l'efficacia della siringa infiltrazione di Agrobacterium in tessuto vegetale, abbiamo testato l'espressione di due proteine fluorescenti - GFP e DsRed - da due diverse piante vettori virali decostruiti - geminiviral e MagnICON - in N. benthamiana. Per N. foglie benthamiana che sono stati interamente infiltrato con Agrobacteria vettori geminiviral contenenti, l'espressione della GFP è stata osservata su tutta la superficie fogliare sotto luce UV a partire già dal 2 dpi e hanno raggiunto l'accumulo di picco a 4 dpi (Figura 4C). Questa espressione GFP presto dal vettore geminiviral è coerente con i risultati precedenti di altre proteine ricombinanti 14,16,18,19. Al contrario, le foglie infiltrate con MagnICON vettore contenenti combinazioni di Agrobacterium ha mostrato fluorescenza GFP solo dopo 5 dpi e ha raggiunto il suo massimo accumulatisu alle 7 dpi (Figura 4D). Alcuna fluorescenza verde era osservata da foglie infiltrate con Agrobacterium controllo miscele di pREP110 negativi + p19 (Figura 4B) o pICH15879 + pCH14011 (dati non mostrati), indicando che la fluorescenza era specifico per il gene GFP e non era il risultato di fluorescenza di fondo da le foglie. Al suo culmine l'accumulo, la fluorescenza di MagnICON vettore-espresso GFP è più intenso di quello di vettore geminiviral (Figura 4C e 4D), simili ai risultati ottenuti in precedenza per altre proteine ricombinanti 8,18. Il pattern di espressione temporale e l'intensità di fluorescenza relativa dei DsRed sono simili a quella di GFP (dati non mostrati). No necrosi maggiore è stata osservata sulle foglie infiltrate con costrutti GFP (Figura 4A). Risultati simili sono stati osservati anche per le piante DsRed che esprimono, per indicare che né proteina fluorescente è altamente tossico per gli impianti ceLLS. Tuttavia, necrosi locale al sito di nick è stato osservato e che è apparso come "buchi" nelle fotografie (figura 4). Quando entrambe le proteine fluorescenti sono state espresse sulla stessa foglia attraverso vettori geminiviral con siringa spot-infiltrazione, sono stati rilevati con il loro colore fluorescente previsto nel punto dove sono state infiltrate (Figura 5). Interessante, co-infiltrazione di GFP e DsRed provocato fluorescenza giallastra (Figura 5). L'intensità di fluorescenza DsRed sembrava essere più debole di quella GFP sulla stessa foglia. Tuttavia, questo non può riflettere l'espressione più debole di DsRed, ma piuttosto a causa della eccitazione di meno che ottimale di DsRed da luce UV. Complesso, i nostri risultati dimostrano che siringa infiltrazione introduce efficientemente gene-trasportano Agrobacteria in pianta foglie ricombinante e provocato espressione sostenuta dei nostri proteine bersaglio. Inoltre, abbiamo dimostrato che questo metodo consente la flessibilitàlità di infiltrarsi né foglie intere di accumulo massimo di una proteina bersaglio o da individuare-infiltrarsi più target proteici con più vettori per confrontare la loro espressione e di pattern di espressione.
2. Espressione di proteine fluorescenti per infiltrazione sotto vuoto
Infiltrazione sotto vuoto è inoltre esaminato per sviluppare un metodo agroinfiltration scalabile che può essere utilizzato per la produzione su larga scala di proteine ricombinanti da vegetali sistemi di espressione transiente. I nostri risultati indicano che il pattern di espressione temporale GFP o DsRed da vettori geminiviral e MagnICON era mutata del cambiamento del metodo infiltrazione e rimasero simile a quella della siringa infiltrazione. Come l'intero germoglio di una pianta è immerso nella miscela infiltrazione durante l'infiltrazione sotto vuoto, è stato osservato per fluorescenza GFP (figura 6) per tutti foglie delle piante infiltrati. Confrontato con siringa infiltrazione, è più robusto e può acinfiltrazione hieve di ogni pianta con un arco di tempo molto più breve. Ad esempio, ci vuole un abile studente 15 min a siringa-infiltrarsi un'intera 6 settimane di età N. impianto benthamiana. Al contrario, lo stesso impianto può essere infiltrati in 3 min a vuoto dall'inizio alla fine e molteplici piante possono essere infiltrato contemporaneamente.
Figura 1. N. benthamiana crescita delle piante con pellet di torba e vassoi di crescita. piante wild-type a 0 (A), 2 (B), 4 (C) e 6 (D) settimane dopo la semina.
Figura 2. Siringa infiltrazione di N. benthamiana lasciacon Agrobacterium tumefaciens. Scolare GV3101 di A. tumefaciens ospitano vettori esprimenti GFP-MagnICON state risospese in tampone di infiltrazione e caricati in una siringa senza ago. Un nick è stato creato con un ago sul lato posteriore di una vecchia foglia pianta di 6 settimane (A). L'apertura della siringa è stato posizionato contro il nick (B) e Agrobacteria in tampone infiltrazione furono iniettati nello spazio intercellulare della foglia tramite il nick (C).
Figura 3. Vuoto infiltrazione di N. benthamiana lascia con Agrobacterium tumefaciens. Strain GV3101 di A. tumefaciens contenenti bersaglio vettori esprimenti proteine sono state risospese in infiltratiotampone n e caricato in un 3 L vasca. La vasca è stato quindi posto in un essiccatore sotto vuoto che è stato collegato ad una pompa a vuoto (A). A 6 settimane vecchio impianto è stato messo a testa in giù sul piatto essiccatore (B). L'intera foglia e sistema di gambo stato poi immersi nella vasca come la piastra è stata posta in cima alla camera (C). Agroinfiltration stato ottenuto applicando e rilasciando un vuoto a 100 mbar due volte per 1 min. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 4. L'espressione di GFP in siringa agroinfiltrated foglie. Intera N. foglie benthamiana sono stati infiltrati con ceppo GV3101 di A. tumefaciens ospitano il gene GFP in un geminiviral (A e C) o MagnICON vecto (D). Foglie di controllo negativo sono stati infiltrati con ceppi Agrobacteria che non contengono tale gene GFP (B). Foglie stati fotografati sotto luce bianca (A) o di luce UV (BD) a 4 dpi (AC) o 7 dpi (D).
Figura 5. Espressione della GFP e DsRed in siringa foglie spot-agroinfiltrated. N. foglie benthamiana erano veritiere infiltrati con GV3101 ospitare la GFP, DsRed, o entrambi GFP e DsRed geni in vettori geminiviral. Un posto di controllo negativo è stato infiltrato con pREP110 + p19. Le foglie sono stati fotografati sotto luce UV a 4 dpi.
Figura 6. L'espressione di GFP nel vuoto agroinfilfoglie concentrato. N. foglie benthamiana sono stati infiltrati con GV3101 ospitare il gene GFP in vettori MagnICON. Le foglie sono stati fotografati sotto luce UV a 7 dpi.
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Discussion
La crescente domanda di prodotti farmaceutici a base di proteine a livello mondiale richiedono nuove piattaforme di produzione che sono robusti, scalabili, a basso costo e sicuro. Piante hanno dimostrato di essere uno dei sistemi di produzione alternativi più promettenti per la produzione di proteine farmaceutiche. Negli ultimi anni, lo sviluppo di vettori basati sul virus destrutturati ha consentito espressione transiente di proteine nelle piante, che migliora notevolmente la velocità e la resa dei sistemi di espressione vegetali 2,10. Per ottimizzare ulteriormente l'utilità del sistema di espressione transiente, dimostriamo un approccio semplice ma efficace e scalabile per introdurre target-gene contenente Agrobacterium in tessuto vegetale. I nostri risultati indicano che agroinfiltration sia con la siringa o il vuoto metodo ha portato all'introduzione di Agrobacterium efficiente nelle foglie e robusta produzione di due proteine fluorescenti GFP e DsRed.
Per garantire la efficient agroinfiltration e la produzione di proteine, i seguenti parametri critici devono essere attentamente controllati. Scostamenti da questi parametri possono provocare scarsa efficienza agroinfiltration ed a sua volta, l'espressione della proteina bersaglio bassa.
1. Impianto stadio di sviluppo e la salute. La variabile più probabile in questo metodo tra laboratori è il materiale vegetale per l'infiltrazione. Mentre le piante possono apparire fenotipicamente simili, il loro stadio di sviluppo e lo stato fisiologico influenzano la loro competenza ad esprimere proteine ricombinanti in modo significativo. Parametri specifici che hanno un impatto sulla crescita delle piante e livelli di espressione della proteina includono temperatura, umidità, intensità luminosa, fornitura di concime pianta età inoculazione, e il tempo richiesto per il massimo accumulo di proteina bersaglio dopo foglia infiltrazione. Le piante devono sempre ricevere la stessa quantità di acqua e fertilizzanti quotidiana. Piccole modifiche delle condizioni di crescita delle piante possono drasticamente cambiare il finale size delle piante e la loro capacità di esprimere proteine ricombinanti. I nostri studi precedenti indicano che le piante cresciute sotto la luce naturale ha prodotto più foglia di biomassa, ma resa di proteine è molto inferiore a quella cresciuta sotto luce artificiale 4. Pertanto, utilizzando la luce artificiale è il metodo di scelta per la crescita delle piante. I nostri risultati mostrano anche che una luce / 8 hr hr ciclo di buio 16 a 25 ± 0.5 ° C è la condizione ottimale per crescere N. piante benthamiana sotto tale 4 illuminazione artificiale. Abbiamo dimostrato che in queste condizioni, impianti a 6 settimane di età sono ottimali per l'espressione GFP e DsRed quanto producono alti livelli di proteine fluorescenti mentre la resa di biomassa è adeguata. Le piante di età superiore a 6 settimane producono più biomassa, ma sono troppo alto per entrare nella camera di infiltrazione 4. Inoltre, fiori cominciano a svilupparsi dopo 6 settimane di crescita, influenzando negativamente proteina ricombinante espressione 4. Di conseguenza, le piante di 6 settimane contengono la L ottimalemateriale EAF che bilancia la necessità combinata di produzione di biomassa, accumulo di proteine, e la facilità di agroinfiltration.
2. Crescita e concentrazione infiltrazione di Agrobacterium. Un altro punto chiave in questa metodologia è il controllo della crescita e concentrazione infiltrazione di A. tumefaciens, misurata dal diametro esterno 600. In ogni fase della cultura e sottocultura, ceppi di A. tumefaciens devono essere coltivate, ma non oltre il diametro esterno designato 600. Abbiamo esaminato diverse concentrazioni di A. tumefaciens per l'infiltrazione finale di N. benthamiana lascia 4. Bassa concentrazione di Agrobacterium comporterà l'insufficiente fornitura di geni bersaglio nelle piante, portando a bassa espressione proteica. D'altra parte, se la concentrazione infiltrazione di Agrobacterium è troppo elevata, innescherà una risposta ipersensibile nel tessuto infiltrato e portare a necrosi 20. Il nostro risultati dimostrato che OD 600 = 0,12 ceppo Agrobacterium bilancia l'esigenza di consegna massimo di gene costruito senza causare necrosi tissutale e la morte cellulare. Il diametro esterno 600 densità desiderata di Agrobacterium può essere ottenuto utilizzando terreni di coltura consistenti, temperatura e tempo di cultura.
3. Per l'infiltrazione sotto vuoto, è importante seguire la pressione di vuoto designato e durata infiltrazione. I nostri risultati indicano che una 3 L vasca di Agrobacterium miscela infiltrazione può essere usato per infiltrarsi circa 30 piante. Se più di 30 piante necessitano di essere infiltrato, un nuovo lotto di miscela infiltrazione Agrobacterium deve essere fornito.
4. I parametri specifici presentati in questo documento sono ottimizzati per l'espressione di proteine usando N. piante benthamiana coltivate in particolari condizioni sopra descritte con vettori decostruiti virus-based. Come discusso in precedenza, tegli parametro più difficile da controllare in questa metodologia è il materiale vegetale. Abbiamo espresso una serie di vaccini e proteine terapeutiche che utilizzano piante e la procedura di infiltrazione che abbiamo descritto qui e ottenuto ottimi risultati in tutti i casi 4,8,14,18,21-23. Questi risultati hanno dimostrato che le condizioni abbiamo sviluppato sono ottimali per l'espressione della proteina. Tuttavia, se diverse specie ospiti vegetali, vettori di espressione, o diverso N. Condizioni di crescita benthamiana sono stati utilizzati per l'infiltrazione, ogni parametro in questa metodologia avrebbe bisogno di essere ri-ottimizzato da esperimenti.
Complesso, abbiamo dimostrato che agroinfiltration con siringa e vuoto è una metodologia semplice ma efficace per introdurre geni bersaglio trasportano Agrobacterium in impianti per l'espressione transiente di proteine ricombinanti. Entrambi i metodi hanno i loro vantaggi unici a seconda della meta della ricerca e della produzione. Siringa infiltrazione è semplice, requires solo piccoli volumi di cultura Agrobacterium e non ha bisogno di costose pompe e le camere a vuoto. Come dimostrato in questo rapporto, si ha la flessibilità di entrambi infiltrarsi nella foglia intera con un gene bersaglio o utilizzare macchia infiltrazione di introdurre geni di bersagli multipli su un unico foglio. L'intero metodo infiltrazione foglia può essere utilizzato per piccola scala di laboratorio espressione di proteina ricombinante per la loro caratterizzazione biochimica, purificazione e studi funzionali preclinici 1. In contrasto, spot infiltrazione può essere usato per esprimere multipli target proteici in un'unica foglia di confrontare le loro rendimento, cinetica di espressione e la tossicità per le piante. Può anche essere utilizzata per confrontare l'espressione di una proteina reporter ha come GFP o DsRed guidato da vettori di espressione diversi sullo stesso foglio. Come risultato, la capacità di diversi vettore nel guidare accumulo di proteine e loro cinetica di espressione può essere caratterizzata. La semplicità della siringa infiltrazione permette inoltre unastrumento fattibile per insegnare e formare scuole superiori e studenti universitari in materia di biotecnologia e dell'ingegneria genetica.
In confronto con la siringa infiltrazione, l'infiltrazione di vuoto richiede l'investimento di pompe per vuoto e le camere e le più grandi volumi di culture Agrobacterium. Pertanto, non è il metodo di scelta quando poche piante necessitano di essere infiltrato. Tuttavia, fornisce la scalabilità che non può essere eguagliata da siringa infiltrazione. È più robusto e può infiltrarsi gran numero di piante in un breve periodo di tempo. Con la scala presentate in questo rapporto, siamo in grado di produrre livello grammo di proteine purificate farmaceutiche sufficienti per una fase I umana 4 sperimentazione clinica. Inoltre, questo processo può essere ulteriormente ridotta per la produzione commerciale di proteine farmaceutiche dalle piante. Ad esempio, i processi sono stati progettati per aspirare infiltrarsi tre tonnellate di N. benthamiana all'orain una scala-up operazione 24. Un altro vantaggio di infiltrazione sotto vuoto è che può essere utilizzato per agroinfiltrate specie vegetali che non sono suscettibili di infiltrazione siringa.
In sintesi, la combinazione di siringa e l'infiltrazione di vuoto offre ricercatori, biotecnologi e gli educatori di una metodologia semplice, efficiente, robusto e scalabile per l'espressione transiente di proteine ricombinanti nelle piante. Esso agevolerà notevolmente lo sviluppo e la produzione di proteine farmaceutiche e promuovere l'educazione scientifica.
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Disclosures
Gli autori non hanno interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Ringraziamo R. Sun e altri studenti del Laboratorio di Chen per il loro contributo alla centrale di generazione di materiale. Ringraziamo anche il Dott. D. Green per il suo sostegno alla ricerca di laurea presso la Facolta 'di tecnologia e l'innovazione (CTI). Questa ricerca è stata sostenuta in parte da sovvenzioni NIH U01 AI075549 e 1R21AI101329 al D. Chen, e una borsa di SSE da CTI della Arizona State University di Q. Chen. K. Leuzinger, M. Dent, J. Hurtado, e J. Stahnke sono studenti universitari finanziati dalla sovvenzione SSE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| GFP | Invitrogen | V353-20 | www.invitrogen.com See reference: Lico and Chen, et al 2008 |
| DsRed | Clontech | 632152 | www.clontech.com See reference: Baird and Zacharias, et al 2000 |
| MagnICON Vector | Icon Genetics | n/a | www.icongenetics.com See reference: giritch and Marillonnet, et al 2006 |
| Geminiviral Vector | Author’s Lab | n/a | See reference: Chen and He, et al 2011 |
| N. benthamiana | Author’s Lab | n/a | herbalistics.com.au |
| Agrobacterium tumefaciens strain gv3101 | Author’s Lab | n/a | See reference: Lai and Chen 2012 |
| LB Agar Carbenicillin-100, plates | Sigma | L0418 | www.sigmaaldrich.com |
| LB Agar Kanamycin-50, plates | Sigma | L0543 | www.sigmaaldrich.com |
| Magnesium sulfate hepa hydrate | Sigma | M2773-500 g | www.sigmaaldrich.com |
| Bacto-Tryptone | Fisher | 73049-73-7 | www.fishersci.com |
| Bacto Yeast Extract | Becton, Dickinson CO. | REF 212750 | www.bd.com |
| Difco Nutrient Broth | Becton, Dickinson CO. | REF 234000 | www.bd.com |
| MES hydrate Buffer | Sigma | M8250-1kg | www.sigmaaldrich.com |
| Carbenicillin | Sigma | C1613-1ML | www.sigmaaldrich.com |
| Kanamycin | Sigma | 70560-51-9 | www.sigmaaldrich.com |
| Sodium Hydroxide | Sigma | 221465 | www.sigmaaldrich.com |
| Jack’s Fertilizer | Hummert International | Jul-25 | www.hummert.com |
| Equipment | |||
| Vacuubrand MD4 Vacuum Pump | Fisher | 13-878-113 | www.fishersci.com |
| Vacuum Air Regulator Valve | Fisher | NC9386590 | www.fishersci.com |
| Desiccator 12 1/8" with O ring | Fisher | 08-594-15C | www.fishersci.com |
| 3 L Tub | Rubber-Maid | n/a | Rubbermaid Servn’ Saver Bowl, 10-cup will work |
| plate/shelf 230ML | Fisher | NC9489269 | www.fishersci.com |
| Peat Pellet | Hummert International | 14-2370-1 | www.hummert.com |
| Propagation Tray Dome | hydrofarm | 132052 | www.hydroponics.net |
| Propagaiton Tray | hydrofarm | 138758 | www.hydroponics.net |
| Virbo Hand Seeder | Gro-Mor INC | n/a | www.gro-morent.com |
| Flora Cart 4 shelf | Hummert International | 65-6924-1 | www.hummert.com |
| 15 ml Round Bottom Culture Tubes | Sigma | CLS430172-500EA | http://www.sigmaaldrich.com |
| Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | www.bio-rad.com |
| Spectrophotometer Cuvettes | Bio-Rad | 223-9950 | www.bio-rad.com |
| Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1415-2500 | www.usascientific.com |
| Benchtop Centrifuge | Bio-Rad | 166-0602EDU | www.bio-rad.com |
| Incubator/Shaker | Eppendorf | Excella E25 | www.eppendorf.com |
| Ultraviolet Light Model#: UVGL-25 | UVP | 95-0021-12 | www.uvp.com |
References
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