Summary
植物は現在の式のパラダイムより、スケーラブルでコスト効率の高い、安全である商業規模で医薬品タンパク質の生産のための新たなシステムを提供しています。本研究では、我々を含む、標的遺伝子を導入するための簡単で便利な、まだスケーラブルなアプローチを報告
Abstract
哺乳動物細胞培養は、ヒト用ワクチンと治療用タンパク質の商業生産のための主要なプラットフォームです。しかし、その限られたスケーラビリティと高コストのために医薬の増加世界的な需要を満たすことができない。植物は、低コストで安全な、スケーラブル、堅牢で最も有望な代替医薬品製造プラットフォームの1つであることが示されている。ウイルスベースのベクターの最近の開発は、植物における組換えタンパク質の迅速かつ高レベルの一過性発現を可能にした。さらに一過性発現システムの有用性を最適化するために、我々はこの研究では、植物組織に標的遺伝子を含有するアグロバクテリウムを導入するための、単純で効率的でスケーラブルな方法を示す。 GFPとDsRedの、両方シリンジ、真空方法は葉と2つの蛍光タンパク質の強固な生産にアグロバクテリウムの効率的な導入につながったとの我々の結果は、アグロを示している。さらに、我々は両方の方法によって提供されるユニークな利点を示しています。シリンジ浸潤は簡単で、高価な機器を必要としません。また、柔軟性がいずれかの標的遺伝子で全体の休暇に潜入するために、または1つの葉に複数のターゲットの遺伝子を導入することができます。このように、組換えタンパク質の実験室規模の発現のために、並びに収率又は発現動態のために異なるタンパク質またはベクターを比較するために使用することができる。シリンジ浸潤のシンプルさは、またバイオテクノロジーの主題のための高校や大学教育におけるその有用性を示唆している。対照的に、真空浸潤がより堅牢であり、医薬タンパク質の商業的製造のためにスケールアップすることができる。また、レタスやシロイヌナズナなどのシリンジ浸潤従順でない植物種をagroinfiltrateすることができるという利点があります。全体的には、注射器、真空アグロの組み合わせは、シンプルで効率的、かつ堅牢な研究者や教育者を提供しています一過性タンパク質発現のための方法。それが大幅に医薬品タンパク質の開発を促進し、科学教育を推進していきます。
Introduction
1970年代から、植物は、組換えタンパク質およびタンパク質治療1の商業的生産のために、哺乳動物、昆虫、および細菌細胞培養物の代替として検討されている。バイオ医薬品の発現のための植物ベースのシステムでは、ゴーシェ病2、鳥H5N1インフルエンザ3のように、病気のためのいくつかの新規治療法として近年の約束を示している臨床試験の成功を示している。それらの最初の実験以来、数十年の植物での組換えタンパク質の発現のために有能なメカニズムの開発には、3つの主な理由のためにタンパク質生産の現在のパラダイムを変更する植物ベースのシステムの可能性を作成しました。まず、哺乳類、昆虫、そして細菌のバイオリアクターは、かなりのスタートアップコスト、高価な増殖培地、下流浄化4のための複雑なプロセスを必要とし、コストの顕著な低下を起こすことがあります。安定したトランスジェニック植物の作成ラインはまた、タンパク質を発現する植物が成長し、農業の規模5で収穫することができるように、彼らが他の発現システムのスケーラビリティを上回ることができます。第二に、植物に基づく発現系は、著しく公共の安全6の優位性を実証し、ヒトへのタンパク質を発現する宿主からヒトまたは動物の病原体を送信する危険性を低減する。最後に、植物は、グリコシル化およびマルチサブユニットタンパク質のアセンブリ7を含むタンパク質の適切な翻訳後修飾を可能にする、哺乳動物細胞に類似している真核細胞内膜システムを利用する。この能力が先に細菌などの原核生物系、に基づいて、それらの植物ベースのシステムを置き、モノクローナル抗体（mAb）を含む医薬品の組換えタンパク質の広い数が、より複雑な構造を持ち、広範な翻訳後修飾またはアセンブリ8が必要です。
二つの主要な適切があります植物において組換えタンパク質を発現する痛み。まず、標的タンパク質をコードするDNAを発現カセットにクローニングし、核または葉緑体ゲノムのいずれかに導入されて安定してトランスジェニック系統の開発である。そうすることで、外来DNAは、後続世代を遺伝になり、はるかに他の発現系1のそれを超えて、途方もなく改善されたスケーラビリティを可能にします。核ゲノムへの外来DNAの導入は通常、組織9の微粒子銃によって、よりしばしば、植物組織のアグロバクテリウム·ツメファシエンスの感染によって達成されるか。植物ホルモンは、その後、根や葉などのトランスジェニック植物組織の分化と増殖を誘導するために使用される。葉緑体ゲノムの形質転換は、A.では達成できないツメファシエンスが、DNAでコーティングされた金またはタングステン粒子に完全に依存しては、植物細胞に弾道発射。再結合を表現する第二の方法植物中のntタンパク質は、一過性発現10を介してである。このシナリオでは、目的の遺伝子を保持するウイルス由来のベクターは、A.を介して配信されていアグロと呼ばれるプロセスを経て完全に開発された植物にツメファシエンス 。代わりに、植物ゲノムに統合することで、送達、遺伝子構築物は、短い潜伏期間の後に採取し、単離することができる所望のタンパク質の一時的な生産を指示し始める。植物はアグロ11後約1〜2週間を収穫できるようになりますように一過性の遺伝子発現は、より大きな全体のタンパク質の蓄積だけでなく、タンパク質生産の改善、時間の利点を提供しています。これは、生成、選択、年に数ヶ月かかることが安定したトランスジェニック植物系統の確認、のプロセスよりもかなり高速です。それは遺伝的に安定植物リチウムが得られないのでしかし、これは、また、一過性発現系の制限です大規模な商業生産のための種子バンクを生成するために使用することができる別項。これにもかかわらず、アプローチは、大規模な一過性の発現を改善するために開発されてきた。ここでは、A.によって配信解体ウイルスベクターを用いた一過性タンパク質発現ベンサミアナタバコ植物の発生する1つの方法を示すツメファシエンス 。
二つの主要な方法がAの送達のために開発されている植物組織へのツメファシエンス ：真空チャンバを介して注射器や大規模溶浸を介してベンチスケールの浸潤。両方のプロトコルは、Nを使用してここで説明されている密接に共通のタバコ植物に関連しているベンサミ、、2つの蛍光タンパク質の一過性発現のための宿主植物として：クラゲオワンクラゲとDiscosomaサンゴ（DsRedを）12,13から赤色蛍光タンパク質から緑色蛍光タンパク質（GFP）。 N. benthamianaのはのための最も一般的な宿主植物であるそれは遺伝的形質転換に従順であるため、組換えタンパク質は、急速にバイオマスを大量に産出し、スケールアップ生産14多作シードプロデューサーであることができます。 N.を使用することの別の利点タンパク質発現のための宿主としては、ベンサミ発現ベクター2,5の様々な可用性である。本研究では、2解体ウイルスベクター、タバコモザイクウイルス（TMV）RNAレプリコンシステム（MagnICONベクトル）とBean黄色萎縮ウイルス（BeYDV）DNAレプリコン系（geminiviralベクトル）4,11由来その他、に基づくもの15-18は 、GFPとDsRedの遺伝子を運ぶとNにそれらを提供するために使用されA.経由benthamianaの細胞ツメファシエンス。スリーDNA構築物は、GFPまたはMagnICONベクトルとDsRedの発現のために使用されます。彼らは、5 'プロモーターおよび標的遺伝子の発現を駆動するための他の遺伝要素を含むモジュール（pICH15879）、3'関心のある遺伝子（PICHを含むモジュールを含む-GFPまたはPICH-DsRedを）、およびインテグモジュール（pICH14011）は、式8,15次第5 'および3'モジュールを一緒に統合する酵素をコードする。三DNA構築物はまた、geminiviralベクターで発現のために必要とされる。標的遺伝子（pBYGFP又はpBYDsRed）のレプリコンを含むベクターに加えて、複製タンパク質（pREP110）をコードするベクターは、標的レプリコン11,14,16の増幅に必要とされる。また、トマト毛スタントウイルス由来のサイレンシング抑制P19をコードするベクターの包含は、高レベルの標的遺伝子発現11,16が望まれる。
植物の成長、A.含むアグロによる植物細胞への組換えタンパク質の遺伝子を導入するための3つの手順は、一般にありツメファシエンス文化の準備、および浸潤。すべてのステップでは、それぞれの詳細な説明が提供され、したがって、この手順の最終的な成功のために重要であるように、シリンジ浸潤と下減圧浸潤の両方に。
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Protocol
1。植物成長
- 伝播トレイに60泥炭ペレットを置きます。水道水4リットルを追加し、泥炭ペレットは2時間のために水を吸収することができます。
- 2 Nを追加シーダーを使用して、各泥炭ペレットにbenthamianaの種子は、透明なプラスチックドームでトレイをカバーし、それらが8分の16時間の昼/夜サイクル（ 図1A）で25℃、84％湿度環境で発芽することができます。
- 二週間播種後ドームを外し、トレイから水を排水し、1.48グラム/ L（ 図1B）の濃度でジャックの肥料の2 Lを追加します。 8分の16時間昼/夜サイクルは25℃、湿度50％の環境下で植物を成長を続けています。トレイあたり2日ごとにジャックの肥料の2 Lを供給してください。
- 彼らは6週齢（ 図で浸透させることが準備が整うまで、4週では、更なる成長（ 図1C）のために十分なスペースを提供するために6工場をホストする新しいトレイに泥炭ペレット工場を移転1D）。
2。A.ツメファシエンス文化準備
シリンジ浸潤用2.1準備
- ストリークA. geminiviralベクトルP19、pREP110、pBYGFP、およびカナマイシン（100μgの/ ml）を含有するLB寒天プレート上でpBYDsRedを含むツメファシエンス GV3101菌株。ストリーク1プレート当たりひずみと48時間30℃で成長する。
- 同様に、筋や5のMagnICONベクトル宿すGV3101株 'モジュール（pICH15879）、3' LB寒天上にGFPあるいはDsRedを（PICH-GFPまたはPICH-DsRedを）、およびインテグ（pCH14011）の標的遺伝子を含むモジュールを育てるカルベニシリンを（は100μg/ ml）を含有するプレート。
- LB寒天プレート上の単一のコロニーから、YENBメディア3mlの（0.75％バクトイーストエキス、0.8％栄養ブロスは、NaOHでpHを7.5に調整）+カナマイシン（100μgの/ ml）の中にgeminiviralベクトルを保有GV3101株を接種15ミリリットル丸底培養管、30℃で液体培養を成長°Cで300 rpmの回転速度で一晩振とう機。
- 同様に、30℃で一晩振とう機に+カルベニシリン（100μg/mlの/ ml）を℃のYENBメディアにMagnICONベクトルを保有GV3101株を接種し、成長
- 分光光度計で各液体培養のために測定し、記録OD 600値は、適切な抗生物質でYENB培地10ml中の0.025の開始OD 600と新しい文化のために継代培養することに必要な容積（V サブ ） を計算するには、以下の式を使用し。
V サブ （溶液）=（10ml）溶液×（0.025）/ OD 600 - 一晩培養の譲渡V サブ （ML）（10 - V サブ ）に各菌株に対する適切な抗生物質とYENBメディアのmlの。 OD 600値が1.7から2.0の範囲内になるまで、250 rpmの回転速度で30℃で一晩新しい文化°シェーカーでCを育てる。
- 測定し、それぞれの液体培養のためにOD 600の値を記録し、計算値には、以下の式を使用し各株について0.12の最終的なOD 600を与えるために浸透バッファー50mlに希釈することが必要な容積（V INF）を ulate。
V infファイル （溶液）=（50ミリリットル）×（0.12）/ OD 600 - 転送Vマイクロ遠心チューブに各培養のinfファイル （ml）と2分間12,000 xgで遠心分離して細胞をスピンダウンし、10mMのMES、pHは5.5（10ミリリットル浸潤バッファーに細胞を再懸濁後、上清を除去し、10mMの硫酸マグネシウム4）簡単にボルテックスで。
- 、pBYGFP + pREP110 + P19の再懸濁した細胞を混ぜて2分間12,000 xgで細胞をスピンダウンし、浸潤バッファー50mlの合計に懸濁します。このアグロバクテリウム組み合わせは、GFPのgeminiviral表現のためである。
- 同様に、 アグロバクテリウム細胞の次の組み合わせを混ぜ、スピンダウンと浸潤バッファー50mlに再懸濁します。彼らは、（1）pBYDsRed + pREP110 DsRedのgeminiviralの表現、（2）pBYGFP + pBYDsRed + pREP110用+ P19GFPとDsRedを、（3）pREp110のgeminiviral共発現のための+ P19 + P19 geminiviral式のネガティブコントロールとして、（4）PICH-GFP + pICH15879 GFP、（5）PICH-DsRedをのMagnICON発現用+ pCH14011 + pICH15879 + DsRedを、（6）pICH15879のMagnICON発現のpCH14011 + pCH14011 MagnICON発現のネガティブコントロールとして。
減圧浸潤用2.2準備
- 接種や文化それぞれGV3101 50ミリリットルオートクレーブフラスコ内の適切な抗生物質でYENBメディアの15ミリリットルにgeminiviralベクトルまたはMagnICONベクトルを含むひずみと成長は一晩、上記のシリンジ浸潤に関して説明。
- 分光光度計、適切な抗生物質でYENBメディアの250ml中に0.025の開始OD 600と新しい文化のために継代培養することに必要な容積（V サブ ） を計算するには、以下の式を使用して各液体培養のための測定と記録OD 600値。
V サブ 600 - （250 - V サブ ）に一晩培養の譲渡V サブ （ml）を各株のための適切な抗生物質を1 Lオートクレーブフラスコ中YENBメディアmlの一夜上記シリンジ浸潤に関して説明新しい文化を育てる。
- 測定し、それぞれの液体培養のためにOD 600の値を記録し、各株に対して0.12の最終OD 600を与える浸透バッファ3Lに希釈されるために必要な容積（V INF）を計算するには、以下の式を使用します。
V infファイル （ML）=（3000ミリリットル）×（0.12）/ OD 600 - ペレットと浸透バッファ内の各文化の再懸V INF（ml）を注射器浸潤で説明し、シリンジ浸潤のため記載の組合せに応じて再懸濁培養液を混ぜると。 Repellet混合アグロバクテリウム細胞と浸潤バッファ3Lに、それらを再懸濁します。
3.1シリンジ浸透
- 4 6週齢のNを選択してください5葉それぞれにベンサミは植物。各工場の上から数えて最初の三つの葉はAの組み合わせのいずれかが完全に浸透されます浸透バッファ内の歪みをツメファシエンス 。第四の葉がgeminiviral式またはMagnICON式の3つのすべての組み合わせについてすべての4つの歪みの組み合わせでスポット浸透されます。各工場の最後の葉が陰性対照の組み合わせで浸透されます。
- 葉の裏側（ 図2A）上の表皮に針で小さなニックネームを作成します。注意：浸潤混合物中のアグロバクテリウム細胞は葉の反対側に穿刺を通過するように、両側を通して葉貫通するように一生懸命傷つけないように注意してください。
- 葉の表側をしっかりホールドを取り、穏やかかけながら片手の親指でニックにカウンター圧力が、針（ 図2B）なしシリンジでニックに浸透バッファ内のアグロバクテリウムの混合物を注入する。注： アグロバクテリウムの混合物は、葉の細胞間隙に入ると、浸潤領域（ 図2C）目に見えて暗く緑色に変わります。
- 暗い緑色の円が拡大して止まるまでニックにアグロバクテリウム混合物を注入し続けています。全体の葉が浸透し、全体の葉は最初の三つの葉と最後の葉のために暗い緑色に点灯するまで、別のニックネームと繰り返し3.1.2-3.1.4を作成します。
- 各工場の第四の葉は、4つのすべて（geminiviralベクトル）または3（MagnICONベクトル）の組み合わせは、それに浸透されます。 アグロバクテリウム株の組み合わせごとに1つのニックネームを作成し、1つの組み合わせで、各ニックネームに潜入。
- 浸透した後、成長室とMONIに工場を戻すポスト浸潤（dpi）で2-15日の間にTorのタンパク質発現。
3.2減圧浸潤
- 真空デシケーターと浴槽へのアグロバクテリウム株を含む振込3 L浸潤バッファに浴槽を置きます。 Vacuubrandダイヤフラム真空ポンプ（ 図3A）にデシケーターを接続します。
- デシケータープレート（ 図3B）に逆さまに工場を置き、全体の葉や茎システムは浴槽の上に休んでいる板を浸透バッファに浸漬されるまで、植物とプレートを下げる。リムに沿ってデシケーターOリングを置き、室（ 図3C）のデシケーターのふたを置く。
- 真空ポンプの電源を入れ、真空が100ミリバールに達したときにタイミングを開始します。ゆっくり沈んで植物組織の間質空間にアグロバクテリウムの入り口を可能にするために100ミリバールで1分後にデシケーターのリリースバルブを開きます。このステップを1 additiを繰り返し良い浸透を確保するためonal時間。
- 浸透した後、デシケーターの植物を取り出し、その直立の位置に戻す。成長室とモニター2-15解像度間でのタンパク質発現に植物をバックに移動します。
4。蛍光タンパク質の検出と写真
- 暗い部屋に2解像度、移動植物からの起動と手持ちのUVランプで浸潤葉の裏面にUV光を当てる。
- GFPまたはDsRedのの赤色蛍光の緑色の蛍光を観察する。 DsRedのは、短波のUV光の下で強くなる一方GFPは、長波長のUV光で強い信号を放つ。
- フラッシュなしとの定期的なデジタルカメラで蛍光葉の写真を撮る。
- 観察や撮影後の成長部屋に植物をバックに移動します。
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Representative Results
1。シリンジ浸潤を蛍光タンパク質の発現
geminiviralとMagnICON - - N.二つの異なる解体植物ウイルスベクターによって- GFPとDsRedの-植物組織へのアグロバクテリウムのシリンジ浸潤の有効性を実証するため、我々は、2つの蛍光タンパク質の発現を試験したベンサミ 。 N.のために完全にアグロバクテリウムを含有geminiviralベクトル、GFPの発現と浸潤したbenthamianaの葉は、早ければ2と解像度から始まるUV光下全体の葉面積にわたって観察し、4解像度（ 図4C）でピークに達し、蓄積された。 geminiviralベクターによるこの初期GFP発現は、他の組換えタンパク質14,16,18,19の以前の結果と一致している。これとは対照的に、MagnICONベクトル含有アグロの組み合わせが唯一の5解像度後GFP蛍光を示し、その最大accumulatiに達して浸透葉7解像度（ 図4D）でオン。まだ緑色蛍光が蛍光GFP遺伝子に特異的であったから、バックグラウンド蛍光の結果ではなかったことを示す、pREP110の陰性対照アグロバクテリウム混合物で浸潤葉から+ p19に（ 図4B）またはpICH15879 + pCH14011た（データは示さず）観察されなかった葉。そのピークの蓄積で、MagnICONベクトル発現GFPの蛍光は、以前他の組換えタンパク質8,18で得られた結果と同様geminiviralベクトル（ 図4Cおよび4D）のそれよりも激しいです。一時的な発現パターンとDsRedの相対蛍光強度は、GFP（データは示さず）と同様である。は大きな壊死はGFPコンストラクト（ 図4A）で浸潤葉に認められなかった。同様の結果は、どちらの蛍光タンパク質は、植物セリウムに非常に有毒であることを示す、DsRedを発現する植物を観察したLLS。しかし、ニック部位の局所壊死が観察され、それらは、写真に"穴"（ 図4）として登場しました。両方の蛍光タンパク質はシリンジスポット浸潤を伴うgeminiviralベクトルを介して同じリーフ上に発現されたとき、それらが浸潤した地点（ 図5）におけるその予想蛍光色で検出した。 GFPの興味深いことに、共同浸潤と黄色がかった蛍光（ 図5）をもたらしDsRedを。 DsRedの蛍光の強度は同じリーフにGFPのそれよりも弱いように見えた。しかし、これは弱いDsRedの表現ではなく、紫外光によってDsRedをのより少なくより最適な励起のために反映できないことがあります。全体的に、我々の結果は、注射器の浸潤が効率的組換え遺伝子を運ぶ植物の葉にアグロバクテリウムを紹介し、我々の標的タンパク質の堅牢な表現をもたらしたことを示している。また、この方法はフレキシブルにすることができることを実証いずれかの標的タンパク質またはその発現と発現パターンを比較するための複数のベクターとするスポット·潜入する複数のタンパク質ターゲットの最大の蓄積のために全体の葉に潜入するための性。
2。減圧浸潤によって蛍光タンパク質の発現
真空浸潤はまた、植物一過性発現系による組換えタンパク質の大規模生産のために使用することができるスケーラブルなアグロ方法を開発することを検討した。我々の結果は、一時的なGFP発現のパターン又はgeminiviralとMagnICONベクトルによってDsRedをを浸潤法の変化により変更され、シリンジ浸潤と同様のままであったことを示す。植物の茎全体を真空浸潤の間に浸透混合物中に浸漬されているように、蛍光が含浸植物のすべての葉のためにGFP（ 図6）について観察された。シリンジ浸潤と比較して、より堅牢であり、交流缶はるかに短い時間枠で各工場のhieve浸潤。例えば、シリンジ浸潤全体を1つ6週齢Nに当生徒15分所要ベンサミプラント 。対照的に、同じ植物を最初から最後まで真空により3分で浸透させることができ、複数の工場を同時に浸透させることができる。
図1。N.泥炭ペレットおよび成長トレイとbenthamianaの植物成長野生型植物0（）において、 図2（B）、図4（C）及び図6（D）週間播種後。
図2。 N.のシリンジ浸潤benthamianaの葉アグロバクテリウム·ツメファシエンスと。AのGV3101ひずみGFP発現ベクターMagnICONを保有ツメファシエンスが浸透緩衝液に再懸濁し、針なし注射器に充填した。ニックネームは、6週齢の植物の葉（）の裏側に針を使用して作成されました。注射器の開口部が浸透バッファにニック（B）およびアグロバクテリアに対して配置された刻み目（C） を介して、リーフの間隙に注入した。
図3。 N.の真空浸潤benthamianaのは、アグロバクテリウム·ツメファシエンスの葉。A.のひずみGV3101標的タンパク質を発現するベクターを含むツメファシエンスは infiltratioに再懸濁しn個のバッファと3リットルの浴槽にロード。浴槽次いで、真空ポンプ（A）に接続した真空デシケーターに入れた。 6週齢の植物をデシケータープレート（B）上に逆さまに置かれた。プレートがチャンバー（C）の上に置かれたように全体の葉や茎のシステムは、その後、浴槽に浸漬された。アグロは、1分間二回100ミリバールで真空を適用し、解放することによって達成された。 大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。
図4。シリンジagroinfiltrated葉におけるGFPの発現。全体N. benthamianaの葉はAの菌株GV3101を浸透したgeminiviral（とC）またはMagnICON VECTにGFP遺伝子を保有ツメファシエンスまたは（D）。ネガティブコントロールの葉はそのGFP遺伝子（B）を含まないアグロバクテリウム株と浸透させていた。葉は4解像度（AC）または7解像度（D）での白色光（）またはUV光（BD）の下で撮影した。
図5。 GFPの発現とシリンジスポットagroinfiltrated葉でDsRedを。N. benthamianaの葉はGV3101はGFP、DsRedの、またはgeminiviralベクトルにおけるGFPとDsRedの遺伝子の両方を保有すると、スポット潜入した。陰性コントロールスポットがpREP110 + P19と浸透しました。葉は4 dpiでUV光下で撮影した。
図6。真空agroinfilにおけるGFPの発現trated葉。N. benthamianaの葉はGV3101をMagnICONベクターにGFP遺伝子を有するで浸潤した。葉は7 dpiでUV光下で撮影した。
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Discussion
タンパク質ベースの医薬品の需要の増加は、世界的な堅牢でスケーラブルな、低コストかつ安全で新しい生産プラットフォームが必要です。植物は、医薬用タンパク質生産のための最も有望な代替的な生産システムのいずれかであることが示されている。近年では、解体ウイルスに基づくベクターの開発が大きく速度および植物発現系2,10の収率を高める植物におけるタンパク質の一過性発現を可能にした。さらに一過性発現システムの有用性を最適化するために、我々は植物組織に標的遺伝子含むアグロバクテリウムを導入するためのシンプルで効率的でスケーラブルなアプローチを示しています。我々の結果は、注射器や真空方式のいずれかとアグロは、植物の葉と2つの蛍光タンパク質、GFPとDsRedの堅牢な生産にアグロバクテリウムの効率的な導入をもたらしたことを示します。
efficieを確保するためNTのアグロとタンパク質生産、以下の重要なパラメータは慎重に制御する必要があります。これらのパラメータからの逸脱は、低アグロ効率が、ターン、低い標的タンパク質発現の可能性があります。
1。植物発達段階と健康。研究室間のこの方法で最も可能性が高い変数が浸透のための植物材料である。植物は表現型が同じように見えるかもしれないが、彼らの発達段階や生理状態が大幅に組換えタンパク質を発現するには彼らの能力に影響を与えます。植物の成長およびタンパク質の発現レベルに影響を与える特定のパラメータは、温度、湿度、光強度、肥料の供給、植物接種年齢、葉の浸潤後に標的タンパク質の最大蓄積するのに要する時間を含む。植物は一貫して、毎日、水と肥料の等量を受け取る必要があります。植物の成長条件の軽微な変更は、大幅最終SIZを変更することがあり植物や組換えタンパク質を発現する能力のE。我々の以前の研究では、自然光下で生育した植物は、より多くの葉のバイオマスが得られたことを示しているが、タンパク質収量は人工光の下で成長した4よりもはるかに少ない。したがって、人工光を使用して植物の成長に最適な方法である。我々の結果はまた、ことを示している25℃で16時間明/ 8時間暗サイクル±0.5℃はNを成長するための最適な条件であるこのような人工的な照明の下で4 ベンサミは植物。我々は、バイオマス収量が適切である間、彼らは蛍光タンパク質を高レベルで生産するように、これらの条件下で、6週間の植物がGFPとDsRedの発現のために最適な年齢であることを実証した。 6週間以上経過した植物は、多くのバイオマスを生産するが、浸透室4内に収まるようにあまりにも背が高いです。また、花がマイナスの組換えタンパク質の発現に影響を与える4、成長の6週間後に発症し始める。これにより、6週間の植物は最適なリットルを含有するバイオマス収量、タンパク質の蓄積、およびアグロの容易さの合計必要性のバランスをとるEAF材料。
2。 アグロバクテリウムの成長と浸潤濃度。この方法のもう一つの重要な点は、Aの成長と浸透濃度の制御であるとしてOD 600で測定しツメファシエンス 、。 A.それぞれの文化やサブカルチャーのステップでは、株ツメファシエンスは、指定されたOD 600以上に成長してではなく、しなければならない我 々はAの複数の濃度を調べたNの最後の浸潤のためツメファシエンスbenthamianaのは 4を残します。低アグロバクテリウム濃度が低いタンパク質の発現をもたらす、植物への標的遺伝子の送達が不十分になります。 アグロバクテリウムの浸透濃度が高すぎる一方で、それは浸潤組織における過敏感反応をトリガーし、壊死20につながる。当社のResultsは、OD 600が 0.12 = アグロバクテリウム株は、組織の壊死および細胞死を引き起こすことなく、遺伝子構築物の最大送達のための必要性のバランスをとることを実証した。 アグロバクテリウムの所望の密度OD 600は、一貫した培養培地、温度、培養時間を使用することによって得ることができる。
3。減圧浸潤のために、それは指定された真空圧と浸透時間に従うことが重要である。我々の結果は、 アグロ浸潤混合物のいずれかの3 L槽を約30植物を浸透させるために使用することができることを示している。 30以上の植物を溶浸する必要がある場合は、 アグロ浸潤混合物の新たなバッチを供給する必要がある。
4。本論文で提示された具体的パラメータは、Nを用いたタンパク質の発現のために最適化されベンサミ植物は解体ウイルスに基づくベクターで上述した特定の条件下で増殖させた。前述のように、Tこの方法で制御するために彼の最も困難なパラメータには、植物材料である。私たちは、植物や我々がここで説明すると、すべてのケース4,8,14,18,21-23で優れた結果を得た浸潤·プロシージャを使用して、ワクチンと治療用タンパク質の様々を表明している。これらの結果は、我々が開発した条件は、タンパク質発現のために最適であることを実証した。ただし、別のホスト植物種、発現ベクター、または異なるN. benthamianaの成長条件は、この方法の各パラメータは、実験によって再最適化される必要があり、浸潤のために使用した。
全体的に、我々は、注射器と真空とのアグロ組換えタンパク質の一過性発現のために植物にアグロバクテリウムを担持する標的遺伝子を導入するためのシンプルで効率的な方法論であることを実証した。どちらの方法も、研究と生産の目標に応じて、彼らのユニークな利点を持っている。シリンジ浸潤は、のrequir簡単ですアグロバクテリウムの培養ESのみ少量で高価なポンプ、真空チャンバーを必要としません。本報告書で示したように、それはどちらか一つのターゲット遺伝子と全葉に潜入、または1つの葉に複数のターゲットの遺伝子を導入するために、スポット浸透を使用できる柔軟性を持っています。全体の葉の浸潤法は、小さな実験室規模の生化学的特徴付けのための組換えタンパク質の発現、精製、及び前臨床研究の1官能性のために使用することができる。対照的に、スポット浸潤は、その収率、発現動態や植物に対する毒性を比較するために、1つのリーフに複数のタンパク質標的を発現するために使用することができる。また、例えば、GFPのような1つのレポータータンパク質の発現を比較したり、同じリーフに異なる発現ベクターにより駆動DsRedをすることができる。結果として、タンパク質の蓄積およびそれらの発現動態を駆動する別のベクトルの能力を特徴づけることができる。シリンジ浸潤のシンプルさは、またそれが可能高校やバイオテクノロジーや遺伝子工学の対象に学部学生を教え、訓練するための実行可能なツールです。
シリンジ浸潤と比較して、減圧浸潤は、真空ポンプとチャンバ及びアグロバクテリウム培養物のより大きい体積の投資を必要とする。ほんの少数の植物が浸潤する必要がある場合したがって、最適な方法ではない。しかし、それは注射器の浸潤によって一致させることができないスケーラビリティを提供します。これは、より堅牢であり、短時間に多数の植物に侵入することができる。本報告書で提示スケールで、我々は第I相臨床試験の4のために十分な医薬品の精製タンパク質のグラムレベルを生産することができます。さらに、このプロセスでは、植物由来の医薬品タンパク質の商業的製造のために、さらにスケールアップすることができます。例えば、プロセスはNの3トンに潜入掃除するように設計されています時速ベンサミ工場スケールアップ運転24インチ減圧浸潤の別の利点は、それがシリンジ浸潤のために適していない植物種をagroinfiltrateするために使用することができるということである。
要約すると、注射器、真空浸潤の組み合わせは、研究者、生物工学や教育植物の組換えタンパク質の一過性発現のために、シンプルな効率的な、堅牢でスケーラブルな方法論を提供しています。それが大幅に医薬品タンパク質の開発と生産を促進し、科学教育を推進していきます。
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Disclosures
著者らは、金銭の利益を競っていない。
Acknowledgments
私たちは、R.太陽と植物材料の生成への貢献のために陳氏の研究室の他の学生に感謝します。また、技術革新（CTI）の大学の学部の研究の彼のサポートのために博士D.グリーンに感謝します。この研究は、Q.陳にNIH助成U01 AI075549と1R21AI101329、およびQ.陳にアリゾナ州立大学のCTIからSSE助成金によって部分的にサポートされていました。 K. Leuzinger、M.デント、J.ウルタドとJ. Stahnkeは、SSEの助成金によって支え学部学生です。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| GFP | Invitrogen | V353-20 | www.invitrogen.com See reference: Lico and Chen, et al 2008 |
| DsRed | Clontech | 632152 | www.clontech.com See reference: Baird and Zacharias, et al 2000 |
| MagnICON Vector | Icon Genetics | n/a | www.icongenetics.com See reference: giritch and Marillonnet, et al 2006 |
| Geminiviral Vector | Author’s Lab | n/a | See reference: Chen and He, et al 2011 |
| N. benthamiana | Author’s Lab | n/a | herbalistics.com.au |
| Agrobacterium tumefaciens strain gv3101 | Author’s Lab | n/a | See reference: Lai and Chen 2012 |
| LB Agar Carbenicillin-100, plates | Sigma | L0418 | www.sigmaaldrich.com |
| LB Agar Kanamycin-50, plates | Sigma | L0543 | www.sigmaaldrich.com |
| Magnesium sulfate hepa hydrate | Sigma | M2773-500 g | www.sigmaaldrich.com |
| Bacto-Tryptone | Fisher | 73049-73-7 | www.fishersci.com |
| Bacto Yeast Extract | Becton, Dickinson CO. | REF 212750 | www.bd.com |
| Difco Nutrient Broth | Becton, Dickinson CO. | REF 234000 | www.bd.com |
| MES hydrate Buffer | Sigma | M8250-1kg | www.sigmaaldrich.com |
| Carbenicillin | Sigma | C1613-1ML | www.sigmaaldrich.com |
| Kanamycin | Sigma | 70560-51-9 | www.sigmaaldrich.com |
| Sodium Hydroxide | Sigma | 221465 | www.sigmaaldrich.com |
| Jack’s Fertilizer | Hummert International | Jul-25 | www.hummert.com |
| Equipment | |||
| Vacuubrand MD4 Vacuum Pump | Fisher | 13-878-113 | www.fishersci.com |
| Vacuum Air Regulator Valve | Fisher | NC9386590 | www.fishersci.com |
| Desiccator 12 1/8" with O ring | Fisher | 08-594-15C | www.fishersci.com |
| 3 L Tub | Rubber-Maid | n/a | Rubbermaid Servn’ Saver Bowl, 10-cup will work |
| plate/shelf 230ML | Fisher | NC9489269 | www.fishersci.com |
| Peat Pellet | Hummert International | 14-2370-1 | www.hummert.com |
| Propagation Tray Dome | hydrofarm | 132052 | www.hydroponics.net |
| Propagaiton Tray | hydrofarm | 138758 | www.hydroponics.net |
| Virbo Hand Seeder | Gro-Mor INC | n/a | www.gro-morent.com |
| Flora Cart 4 shelf | Hummert International | 65-6924-1 | www.hummert.com |
| 15 ml Round Bottom Culture Tubes | Sigma | CLS430172-500EA | http://www.sigmaaldrich.com |
| Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | www.bio-rad.com |
| Spectrophotometer Cuvettes | Bio-Rad | 223-9950 | www.bio-rad.com |
| Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1415-2500 | www.usascientific.com |
| Benchtop Centrifuge | Bio-Rad | 166-0602EDU | www.bio-rad.com |
| Incubator/Shaker | Eppendorf | Excella E25 | www.eppendorf.com |
| Ultraviolet Light Model#: UVGL-25 | UVP | 95-0021-12 | www.uvp.com |
References
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