Summary
Plantas oferecer um novo sistema para a produção de proteínas farmacêuticas, em escala comercial, que é mais escalável e de custo eficaz e segura que paradigmas expressão corrente. Neste estudo, apresentamos uma abordagem simples e conveniente, mas escalável para introduzir genes alvo contendo
Abstract
Cultura de células de mamífero é a plataforma principal para a produção comercial de vacinas humanas e proteínas terapêuticas. No entanto, ele não pode atender à crescente demanda mundial por produtos farmacêuticos, devido à sua escalabilidade limitada e de alto custo. As plantas têm demonstrado ser uma das plataformas de produção farmacêuticos alternativos mais promissores que são robustas, adaptar, de baixo custo e segura. O recente desenvolvimento de vectores baseados em vírus, permitiu a expressão transiente rápida e de alto nível de proteínas recombinantes em plantas. Para optimizar ainda mais a utilidade do sistema de expressão transitória, que demonstram uma metodologia simples, eficiente e de adaptar a introdução do gene alvo contendo de Agrobacterium para o tecido vegetal neste estudo. Os nossos resultados indicam que tanto a seringa agroinfiltration com vácuo e métodos têm como resultado a introdução eficiente de Agrobacterium em folhas e robusta de produção de duas proteínas fluorescentes; GFP e DsRed. Além disso,que demonstram as vantagens únicas oferecidas pelos dois métodos. Infiltração seringa é simples e não precisa de equipamentos caros. Ele também permite a flexibilidade, quer se infiltrar toda a licença com um gene alvo, ou a introdução de genes de múltiplos alvos em uma folha. Assim, ele pode ser usado para a expressão à escala laboratorial de proteínas recombinantes, bem como para a comparação de diferentes proteínas ou vectores para a cinética de produção ou expressão. A simplicidade de infiltração seringa também sugere a sua utilidade no ensino médio e educação superior para o tema da biotecnologia. Em contraste, a infiltração por vácuo é mais robusto e pode ser dimensionada e para produção comercial de proteínas farmacêuticas. Também apresenta a vantagem de ser capaz de agroinfiltrate espécies de plantas que não são passíveis de seringa infiltração tais como a alface e Arabidopsis. Em geral, a combinação de uma seringa e agroinfiltration vácuo fornece investigadores e formadores de uma simples, eficiente e robustametodologia para a expressão da proteína transiente. Vai facilitar muito o desenvolvimento de proteínas farmacêuticas e promover a educação científica.
Introduction
Desde os anos 1970, as plantas foram explorados como alternativas a culturas de células de mamíferos, insectos, bactérias e para a produção comercial de proteínas recombinantes e uma proteína terapêutica. Sistemas à base de plantas para a expressão de biofármacos têm se mostrado promissor nos últimos anos, vários novos tratamentos para doenças, como a doença de Gaucher 2 e 3 da gripe aviária H5N1, têm demonstrado sucesso em ensaios clínicos. O desenvolvimento de mecanismos competentes para a expressão de proteínas recombinantes em plantas nas décadas desde os primeiros experimentos criou o potencial para sistemas à base de plantas para alterar o paradigma atual de produção de proteína por três razões principais. Em primeiro lugar, há uma diminuição notável do custo como bioreactores de mamíferos, insectos, bactérias e exigem custos consideráveis de arranque, meios de cultura caros e processos complicados para a purificação a jusante 4. A criação de planta transgênica estávellinhas também lhes permite superar a escalabilidade de outros sistemas de expressão como plantas que expressam proteínas poderiam ser cultivadas e colhidas em escala agrícola 5. Em segundo lugar, os sistemas de expressão à base de plantas reduzem significativamente o risco de transmissão de um agente patogénico humano ou animal, a partir do hospedeiro que expressa a proteína para os seres humanos, demonstrando a superioridade em segurança pública 6. Por fim, as plantas utilizam um sistema endomembranar eucariota que é semelhante à de células de mamífero, permitindo a correcta modificação pós-tradução, incluindo a glicosilação de proteínas e o conjunto de proteínas de várias subunidades 7. Esta capacidade coloca sistemas baseados em plantas antes de aqueles baseados em sistemas procariotas, tais como bactérias, uma vez que um número maior de proteínas recombinantes farmacêuticos, incluindo os anticorpos monoclonais (mAbs), tem uma estrutura complicada e requer extensas modificações pós-tradução ou de montagem 8.
Existem dois grandes adedores de expressar proteínas recombinantes em plantas. O primeiro é o desenvolvimento de uma linha transgénica de forma estável, onde o ADN que codifica para a proteína alvo é clonado em uma cassete de expressão e introduzido tanto o genoma nuclear ou do cloroplasto. Ao fazer isso, o DNA estranho se torna hereditário através de gerações sucessivas e permite tremendamente melhorado escalabilidade, além de outros sistemas de expressão 1. A introdução de ADN exógeno no genoma nuclear é geralmente conseguido por infecção por Agrobacterium tumefaciens de tecido de planta ou, menos frequentemente, por bombardeamento de microprojécteis de tecido 9. Hormonas de plantas são depois utilizados para induzir a diferenciação e o crescimento de tecido de planta transgénica como raízes e folhas. A transformação do genoma do cloroplasto não pode ser conseguido com A. tumefaciens, mas depende inteiramente de partículas de ouro ou tungstênio revestidas com DNA demitido balisticamente em células vegetais. O segundo método de expressar recombinaçãont proteína em plantas é através da expressão transitória 10. Neste cenário, os vetores de vírus derivados abrigando o gene de interesse são entregues via A. tumefaciens para plantas totalmente desenvolvidas através de um processo chamado agroinfiltration. Em vez de integração no genoma da planta, a construção de gene entregue começará então a dirigir a produção transiente da proteína desejada, que pode ser colhida e isolado após um curto período de incubação. A expressão do gene transitório oferece a vantagem de uma maior acumulação de proteína total, bem como um tempo melhorado de produção de proteínas, como as plantas estarão prontas para a colheita, aproximadamente 1-2 semanas após agroinfiltration 11. Isto é significativamente mais rápido do que os processos de produção, selecção e confirmação de linhas de plantas transgénicas estáveis, o que pode levar vários meses a um ano. Isto, no entanto, é também a limitação do sistema de expressão transitória, uma vez que não irá produzir geneticamente estável planta line que podem ser usados para gerar um banco de sementes para a produção comercial em grande escala. Apesar disso, as abordagens têm sido desenvolvidos para melhorar a expressão transiente em larga escala. Aqui demonstramos um método de geração de proteínas expressam plantas de Nicotiana benthamiana transitórios utilizam vetores virais desconstruídas entregues pela A. tumefaciens.
Existem dois métodos principais estão a ser desenvolvidos para a entrega de A. tumefaciens em tecido vegetal: banco de infiltração escala via seringa e infiltração em larga escala via câmara de vácuo. Ambos os protocolos são descritos aqui, usando N. benthamiana, que está intimamente relacionada com a planta do tabaco comum, como a planta hospedeira para expressão transitória de duas proteínas fluorescentes: a proteína verde fluorescente (GFP) de água-viva Aequorea victoria ea proteína fluorescente vermelha de Discosoma coral (DsRed) 12,13. N. benthamiana é a planta hospedeira mais comum paraproteína recombinante porque é susceptível à transformação genética, podem produzir quantidades elevadas de biomassa rapidamente, e é um produtor de sementes para a produção prolífica aumento de escala 14. Outra vantagem do uso de N. benthamiana como hospedeiros para a expressão da proteína é a disponibilidade de uma variedade de vectores de expressão de 2,5. Neste estudo, dois vetores virais desconstruídas, uma baseada em um vírus do mosaico do tabaco (TMV) RNA sistema replicon (vetores MagnICON) eo outro derivado do vírus anã amarela feijão (BeYDV) sistema replicon DNA (vetores geminiviral) 4,11, 15-18, são usados para transportar o gene GFP e DsRed e entregá-los em N. células benthamiana via A. tumefaciens. três construções de DNA serão utilizados para GFP ou com vectores de expressão DsRed MagnICON. Eles incluem "módulo (pICH15879) contendo o promotor e outros elementos genéticos para a condução da expressão do gene alvo, a 3 'do módulo 5 que contém o gene de interesse (Pich-GFP ou Pich-DsRed), e o módulo de integrase (pICH14011) que codifica para uma enzima que integra a 5 'e 3' módulos juntos após expressão 8,15. Três construções de DNA também são necessários para a expressão com vetores geminiviral. Em adição a vectores que contêm o replicão do gene-alvo (ou pBYGFP pBYDsRed), um vector que codifica para a proteína de replicação (pREP110) é necessária para a amplificação do alvo replicão 11,14,16. Além disso, a inclusão de um vector que codifica para o silenciamento p19 supressor de tomate espesso vírus duplos é desejado para a expressão do gene alvo de elevado nível de 11,16.
Em geral, há três passos principais para a introdução de genes de proteínas recombinantes em células de plantas por agroinfiltration incluindo o crescimento das plantas, A. tumefaciens cultura de preparação, e a infiltração. Como cada passo é crítico para o sucesso final deste procedimento, por conseguinte, uma descrição detalhada de cada uma é fornecidatanto para a infiltração seringa e infiltração por vácuo abaixo.
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Protocol
1. O crescimento das plantas
- Lugar de 60 de turfa pelotas em uma bandeja de propagação. Adicionar 4 L de água da torneira e deixar a turfa pelotas de absorver a água por 2 horas.
- Adicionar 2 N. benthamiana sementes em cada pastilha de turfa utilizando um semeador, cobrir a bandeja com uma cúpula de plástico transparente, e permitir que elas germinam num ° C, 84% de humidade ambiente de 25 com um ciclo de dia / noite de 16/8 horas (Figura 1A).
- Remover a cúpula de duas semanas após a sementeira, drenar a água da bandeja, e adicionar 2 L de fertilizante de Jack a uma concentração de 1,48 g / L (Figura 1B). Continuar a crescer as plantas numa ° C, 50% de humidade ambiente de 25 horas com um ciclo de dia / noite de 16/8. Fornecimento 2 L de fertilizante de Jack a cada 2 dias por bandeja.
- Na semana 4, transferir as plantas com turfa peletes para uma nova bandeja que hospeda seis plantas para proporcionar um espaço adequado para o crescimento (Figura 1C) até que eles estão prontos para ser infiltrado com 6 semanas de idade (Figura1D).
2. A. tumefaciens Cultura Preparação
2.1 Preparação para a infiltração Seringa
- Streak A. tumefaciens GV3101 estirpes contendo os vectores geminiviral p19, pREP110, pBYGFP pBYDsRed, e em placas de agar LB contendo canamicina (100 ng / ml). Causadas por uma estirpe de placa e crescer a 30 ° C durante 48 horas.
- Da mesma forma, causadas e crescer estirpes GV3101 albergando os vectores MagnICON do 5 'do módulo (pICH15879), a 3' do módulo que contém o gene alvo de DsRed ou GFP (Pich-GFP ou Pich-DsRed) e da integrase (pCH14011) em LB agar placas contendo carbenicilina (100 ug / ml).
- A partir de uma única colónia na placa de agar LB, inocular estirpes GV3101 abrigando vectores geminiviral em 3 ml de meio YENB (0,75% de extracto de levedura Bacto, 0,8% Nutrient Broth, ajustar o pH para 7,5 com NaOH) + canamicina (100 ng / ml) em um tubo ml de cultura de fundo redondo de 15, cultivar a cultura líquida, a 30 ° C emnum agitador durante a noite com uma taxa de rotação de 300 rpm.
- Da mesma forma, e inocular crescer estirpes GV3101 abrigando vectores MagnICON em meios YENB + carbenicilina (100 ug / ml) num agitador durante a noite a 30 ° C.
- OD valores medir e registrar 600 para cada cultura líquido com um espectrofotômetro e utilizar a fórmula abaixo para calcular o volume necessário (V sub) para ser repicadas para uma nova cultura com uma OD de partida 600 de 0.025 em 10 ml de mídia YENB com os antibióticos apropriados .
Sub V (mL) = (10 ml) x (0,025) / OD 600 - Transferência V sub (ml) da cultura durante a noite a (10 - sub V) ml de meio YENB com os antibióticos apropriados para cada estirpe. Crescer a nova cultura durante a noite a 30 ° C num agitador com uma velocidade de rotação de 250 rpm, até o valor de DO 600 está na gama de 1,7-2,0.
- Meça e registre OD 600 valores para cada cultura líquido e usar a fórmula abaixo para calcular o volume necessário (V inf) para ser diluído em 50 ml de tampão de infiltração para se obter um OD final de 600 de 0,12 para cada estirpe.
Inf V (mL) = (50 ml) x (0,12) / OD 600 - Transferência V inf (ml) de cada cultura para um tubo de microcentrífuga e girar as células por centrifugação a 12.000 xg durante 2 minutos, em seguida, remover o sobrenadante e ressuspender as células em 10 ml de tampão de infiltração (MES 10 mM, pH 5,5; MgSO 10 mM 4) em vortex brevemente.
- Misturar as células ressuspensas de pBYGFP pREP110 + + p19, rodar para baixo as células a 12.000 xg durante 2 minutos, e ressuspender em total de 50 ml de tampão de infiltração. Esta combinação de Agrobacterium é geminiviral para expressão da GFP.
- Do mesmo modo, misturar as seguintes combinações de células de Agrobacterium, girar e ressuspender-los em 50 ml de tampão de infiltração. Eles incluem: (1) pBYDsRed + pREP110 + p19 para a expressão geminiviral de DsRed, (2) pBYGFP + + pBYDsRed pREP110+ P19 geminiviral por co-expressão da GFP e DsRed, (3) pREp110 + p19 como controlo negativo de expressão geminiviral, (4) Pich-GFP + + pICH15879 pCH14011 MagnICON para a expressão de GFP, (5) Pich-DsRed + + pICH15879 pCH14011 para a expressão MagnICON de DsRed, e (6) pICH15879 + pCH14011 como controle negativo para a expressão MagnICON.
2.2 Preparação para a infiltração a vácuo
- Após a inoculação, a cultura de cada estirpe GV3101 contendo vectores ou vectores geminiviral MagnICON em 15 ml de meio YENB com antibióticos apropriados em um frasco de 50 ml e autoclavado a crescer durante a noite como descrito acima para a seringa de infiltração.
- OD valores medir e registrar 600 para cada cultura líquido com um espectrofotômetro e utilizar a fórmula abaixo para calcular o volume necessário (V sub) para ser repicadas para uma nova cultura com uma OD de partida 600 de 0.025 em 250 ml de mídia YENB com os antibióticos apropriados .
V sub 600 - Transferência V sub (ml) da cultura durante a noite a (250 - V sub) mL de meio YENB num balão de 1 L autoclavado com os antibióticos apropriados para cada estirpe e crescer uma nova cultura durante a noite como descrito acima, para a infiltração de seringa.
- Medir e registar valores de OD 600 de cada líquido de cultura e utilizar a seguinte fórmula para calcular o volume necessário (V inf) para ser diluído em 3 L de tampão de infiltração para se obter um OD final de 600 de 0,12 para cada estirpe.
Inf V (mL) = (3000 ml) x (0,12) / OD 600 - Ressuspender o sedimento e V inf (ml) de cada cultura em tampão de infiltração, tal como descrito para a infiltração de seringa e misturar as culturas ressuspensas de acordo com as combinações descritas para a infiltração de uma seringa. Repellet Agrobacteria as células mistas e ressuspender-los em 3 L de tampão de infiltração.
3.1 Seringa Infiltração
- Escolha quatro de 6 semanas de idade N. benthamiana plantas com folhas de 5 cada. As três primeiras folhas de contagem a partir do topo de cada planta vai ser infiltrada inteiramente com uma das combinações de A. tumefaciens estirpes em tampão de infiltração. A quarta folha será spot-infiltrada com todas as quatro combinações de tensão para a expressão geminiviral ou três combinações de expressão MagnICON. A última folha de cada planta será infiltrada com combinações de controles negativos.
- Criar uma pequena incisão com uma agulha na epiderme, no lado de trás da folha (Figura 2A). Atenção: certifique-se de modo a não arranhar duro como para perfurar a folha através de ambos os lados, tal como as células de Agrobacterium na mistura infiltração irá passar através do furo para o outro lado da folha.
- Tome um firme do lado da frente da folha e ao aplicar suavecontrapressão para o entalhe com o polegar de uma mão, injecta-se as misturas de Agrobacterium, em tampão de infiltração no entalhe com uma seringa sem agulha (Figura 2B). Nota: A mistura de Agrobacterium entra no espaço intercelular da folha, a área infiltrada ficará visivelmente mais escura verde (Figura 2C).
- Continuar a injectar as misturas Agrobacterium no nick até que o círculo verde mais escuro pára de se expandir. Criar outro nick e repita os passos 3.1.2-3.1.4 até que toda a folha é infiltrada e toda a folha fica verde mais escuro para as três primeiras folhas ea última folha.
- Para a quarta folha de cada planta, todas as combinações de quatro geminiviral (vector) ou três (MagnICON vector) serão infiltrados nela. Faça um nick para cada combinação de cepas de Agrobacterium, e se infiltrar cada nick com uma combinação.
- Após a infiltração, mova plantas de volta para a sala de crescimento e moniexpressão da proteína tor entre 2-15 dias após a infiltração (dpi).
3.2 Vacuum Infiltração
- Depositar uma banheira num exsicador de vácuo e de transferência 3 tampão de infiltração L contendo as estirpes de Agrobacterium para a banheira. Ligue o exsicador de vácuo a uma bomba de diafragma Vacuubrand (Figura 3A).
- Coloque uma planta de cabeça para baixo sobre a placa exsicador (Figura 3B) e baixar a placa com a planta, até que todo o sistema de folha e caule é submerso no tampão de infiltração com a placa que descansam sobre a cuba. Coloque o secador O anel ao longo da borda e coloque a tampa do secador na câmara (Figura 3C).
- Ligar a bomba de vácuo e iniciar a contagem, quando o vácuo atinge 100 mbar. Lentamente abrir a válvula de libertação no exsicador após 1 min a 100 mbar para permitir a entrada de Agrobacterium para dentro dos espaços intersticiais do tecido da planta submersa. Repita este passo um additional tempo para garantir uma boa infiltração.
- Após infiltração, levar a planta para fora do secador e colocá-lo de volta à sua posição vertical. Mover as plantas de volta para a sala de crescimento e expressão da proteína do monitor entre 2-15 dpi.
4. Proteína fluorescente de detecção e Fotografia
- A partir de 2 dpi, as plantas se movem em quarto escuro e brilhar a luz UV na parte de trás das folhas infiltradas com uma lâmpada UV de mão.
- Observar a fluorescência verde de GFP ou a fluorescência vermelha de DsRed. GFP emite um sinal mais forte com o tempo de luz UV de ondas, enquanto DsRed é mais forte sob luz ultravioleta de onda curta.
- Tire fotos de folhas fluorescentes com uma câmera digital comum, sem flash.
- Mover as plantas de volta para a sala de crescimento após a observação ou fotografia.
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Representative Results
1. Expressão de proteínas fluorescentes por infiltração Seringa
Para demonstrar a eficácia da seringa infiltração de Agrobacterium para o tecido vegetal, testou-se a expressão das duas proteínas fluorescentes - GFP e DsRed - por dois vectores virais diferentes de plantas Desconstruído - geminiviral e MagnICON - em N. benthamiana. Para N. benthamiana folhas que foram completamente infiltrados com Agrobacteria geminiviral vectores contendo, a expressão da GFP foi observada ao longo de toda a área da folha com luz ultravioleta a partir de tão cedo quanto 2 ppp e atingiu acumulação de pico em 4 dpi (Figura 4C). Esta expressão da GFP no início, por vector geminiviral é consistente com os resultados anteriores de outras proteínas recombinantes, 14,16,18,19. Em contraste, as folhas infiltradas com MagnICON vetor contendo combinações Agrobacterium mostrou fluorescência da GFP somente após cinco dpi e atingiu o seu máximo accumulatiem 7 de dpi (Figura 4D). Não foi observada fluorescência verde das folhas infiltrados com misturas de controlo negativos de Agrobacterium pREP110 + p19 (Figura 4B) ou pICH15879 pCH14011 + (dados não mostrados), indicando que a fluorescência era específica para o gene GFP e não era o resultado de fluorescência de fundo, a partir de as folhas. Na sua acumulação de pico, a fluorescência do MagnICON vector expressa a GFP é mais intensa do que a do vector geminiviral (Figura 4C e 4D), semelhante aos resultados obtidos anteriormente por outras proteínas recombinantes 8,18. O padrão de expressão temporal e a intensidade de fluorescência relativa de DsRed são semelhantes à da GFP (dados não mostrados). Nenhum dos principais necrose foi observada em plantas infiltradas com construções de GFP (Figura 4A). Também foram observados resultados semelhantes para as plantas que expressam DsRed, indicando que nem a proteína fluorescente é altamente tóxico para plantas cells. No entanto, necrose no local da nick foi observado e que apareceu como "buracos" nas fotografias (Figura 4). Quando ambas as proteínas fluorescentes foram expressos na mesma folha através de vectores geminiviral com seringa-a infiltração local, foram detectados com a sua cor fluorescente esperada no ponto em que foram infiltradas (Figura 5). Curiosamente, a co-infiltração de GFP e DsRed resultou na fluorescência amarelado (Figura 5). A intensidade de fluorescência DsRed pareceu ser mais fraca do que aquela da GFP na mesma folha. No entanto, isso pode não refletir a expressão mais fraca de DsRed, mas sim devido à excitação menos-que-ideal de DsRed pela luz UV. Em geral, os nossos resultados demonstram que a infiltração de seringa apresenta eficiente do gene recombinante que transporta Agrobacterium em folhas de plantas e resultou na expressão robusta das nossas proteínas alvo. Além disso, demonstrou-se que este método permite que a fledade, quer se infiltrar em folhas inteiras para a acumulação máxima de uma proteína-alvo ou para manchar-se infiltrar em múltiplos alvos de proteínas com múltiplos vetores para comparar sua expressão e padrão de expressão.
2. Expressão de proteínas fluorescentes por infiltração a vácuo
Infiltração de vácuo foi também examinada para desenvolver um método agroinfiltration expansível que pode ser utilizado para produção em grande escala de proteínas recombinantes através de sistemas de expressão transiente de plantas. Os nossos resultados indicam que o padrão de expressão temporal de DsRed ou GFP por geminiviral e MagnICON vectores não foi alterada pela mudança do método de infiltração e manteve-se semelhante à de infiltração de uma seringa. Como todo o rebento de uma planta é submerso na mistura de infiltração durante a infiltração a vácuo, foi observada fluorescência da GFP (Figura 6) para todas as folhas das plantas infiltradas. Comparado com a infiltração de seringa, que é mais robusto e pode acinfiltração hieve de cada planta com um período de tempo muito mais curto. Por exemplo, é preciso um estudante qualificado de 15 min a uma seringa do tipo infiltrado inteiro de 6 semanas de idade N. planta benthamiana. Em contraste, a mesma planta pode ser infiltrado em 3 min por meio de vácuo do início ao fim e várias plantas pode ser infiltrada, ao mesmo tempo.
Figura 1. N. benthamiana crescimento das plantas com pelotas de turfa e bandejas de crescimento. plantas do tipo selvagem a 0 (A), 2 (B), 4 (C) e 6 (D) semanas após a semeadura.
Figura 2. Seringa infiltração de N. deixa benthamianacom Agrobacterium tumefaciens. Coe GV3101 de A. tumefaciens abrigando vectores que expressam GFP MagnICON foram ressuspensas em tampão de infiltração e carregada para uma seringa sem agulha. Um entalhe foi criado com uma agulha no lado de trás de uma de 6 semanas de idade folha da planta de (A). A abertura da seringa foi posicionada contra o entalhe (B) e em tampão de infiltração Agrobacterium foram injectados no espaço intercelular da folha através do corte (C).
Figura 3. Aspirador de infiltração de N. benthamiana deixa com Agrobacterium tumefaciens. Strain GV3101 de A. tumefaciens contendo vectores de proteína alvo que expressam foram ressuspensas em infiltration tampão e carregado para uma banheira de 3 L. A tina foi então colocada num exsicador de vácuo, que foi ligado a uma bomba de vácuo (A). A planta de 6 semanas de idade foi colocada de cabeça para baixo na placa exsicador (B). A folha inteira e sistema de haste foi então submerso na tina como a placa foi colocada no topo da câmara (C). Agroinfiltration foi conseguido através da aplicação e liberando um vácuo a 100 mbar duas vezes por 1 min. Clique aqui para ver a figura maior .
Figura 4. Expressão de GFP em seringa agroinfiltrated folhas. Todo N. folhas benthamiana foram infiltradas com tensão GV3101 de A. tumefaciens que abrigam o gene da GFP em um geminiviral (A e C) ou MagnICON vectou (D). Folhas de controlo negativas foram infiltradas com cepas Agrobacteria que não contêm o gene GFP (B). As folhas foram fotografados sob luz branca (A) ou luz UV (BD) a 4 dpi (AC) ou 7 dpi (D).
Figura 5. Expressão de GFP e DsRed em seringa folhas spot-agroinfiltrated. N. folhas benthamiana foram spot-infiltrada com GV3101 abrigar a GFP, DsRed, ou ambos GFP e genes DsRed em vetores geminiviral. Um ponto de controle negativo foi infiltrada com pREP110 + p19. As folhas foram fotografados sob luz UV em 4 dpi.
Figura 6. A expressão de GFP em vácuo agroinfilfolhas trados. N. folhas benthamiana foram infiltradas com GV3101 abrigando o gene GFP em vetores MagnICON. As folhas foram fotografados sob luz UV em 7 dpi.
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Discussion
A crescente demanda por produtos farmacêuticos à base de proteínas em todo o mundo exigem novas plataformas de produção que são robustas, escaláveis e de baixo custo e segura. As plantas têm demonstrado ser um dos sistemas de produção alternativos mais promissores para a produção de proteínas farmacêuticas. Em anos recentes, o desenvolvimento de vectores baseados em Desconstruído vírus permitiu a expressão transitória de proteínas em plantas, o que aumenta grandemente a velocidade e o rendimento dos sistemas de expressão de plantas 2,10. Para optimizar ainda mais a utilidade do sistema de expressão transitória, que demonstram uma abordagem simples e eficiente e adaptar a introduzir-gene alvo contendo de Agrobacterium para o tecido vegetal. Os nossos resultados indicam que agroinfiltration quer com a seringa ou vácuo método tem como resultado a introdução eficiente de Agrobacterium para as folhas de plantas e produção robusta de duas proteínas fluorescentes, GFP e DsRed.
Para assegurar a efficient agroinfiltration e produção de proteína, os seguintes parâmetros críticos deve ser cuidadosamente controlada. Os desvios esses parâmetros podem resultar em baixa eficiência agroinfiltration e, por sua vez, a baixa expressão da proteína alvo.
1. Estágio de desenvolvimento da planta e da saúde. A variável mais provável nesse método entre laboratórios é o material de planta para a infiltração. Enquanto as plantas podem aparecer fenotipicamente similar, seu estágio de desenvolvimento e estado fisiológico afeta a sua competência na expressão de proteínas recombinantes significativamente. Os parâmetros específicos que têm impacto sobre o crescimento das plantas e os níveis de expressão da proteína incluem a temperatura, a humidade, a intensidade da luz, o fornecimento de adubo, idade inoculação da planta, eo tempo necessário para a acumulação máxima de proteína alvo após a infiltração da folha. As plantas devem sempre receber a mesma quantidade de água e fertilizante diária. Pequenas mudanças nas condições de crescimento das plantas pode mudar drasticamente o siz finaise das plantas e sua capacidade de expressar proteínas recombinantes. Os nossos estudos anteriores indicam que as plantas cultivadas sob luz natural rendeu mais folha de biomassa, mas a produção de proteína é muito menor do que cultivadas sob luz artificial 4. Portanto, o uso de luz artificial é o método de escolha para o crescimento da planta. Os resultados também mostram que uma luz / 8 horas de ciclo escuro de 16 horas à temperatura de 25 ± 0,5 ° C é a condição óptima para crescer N. plantas benthamiana sob tais 4 iluminação artificial. Demonstrou-se que sob estas condições, as plantas com 6 semanas de idade são o ideal para a expressão de GFP e DsRed medida em que produzem elevados níveis de proteínas fluorescentes, enquanto que o rendimento de biomassa é adequada. Plantas com mais de seis semanas de produzir mais biomassa, mas são muito alto para caber dentro da câmara de infiltração 4. Além disso, as flores começam a desenvolver-se após 6 semanas de crescimento, afectando negativamente a expressão de proteína recombinante 4. Consequentemente, as plantas de 6 semanas conter o l óptimamaterial de EAF que equilibre a necessidade combinada de produção de biomassa, a acumulação de proteínas, e a facilidade de agroinfiltration.
2. Crescimento e concentração infiltração de Agrobacterium. Outro ponto essencial neste método é o controlo do crescimento e da concentração de infiltração de A. tumefaciens, tal como medido pela OD 600. Em cada etapa de cultura e subcultura, cepas de A. tumefaciens devem ser cultivadas, mas não sobre o OD designado 600. Examinamos várias concentrações de A. tumefaciens para a infiltração final N. benthamiana deixa 4. A baixa concentração de Agrobacterium irá resultar na entrega insuficiente de genes alvo em plantas, conduzindo a baixa expressão da proteína. Por outro lado, se a concentração de infiltração de Agrobacterium é demasiado elevado, irá desencadear uma resposta de hipersensibilidade infiltrado no tecido e provocar a necrose de 20. Nosso resultados demonstraram que DO600 = 0,12 Agrobacterium estirpe equilibre a necessidade de fornecimento máximo de construção de gene sem provocar necrose dos tecidos e à morte celular. O desejado DO600 densidade de Agrobacterium pode ser obtido usando meios de cultura consistentes, temperatura e tempo de cultura.
3. Por infiltração por vácuo, é importante a seguir a pressão de vácuo e da duração designada infiltração. Os nossos resultados indicam que um 3 L cuba de mistura infiltração Agrobacterium pode ser usado para infiltrar a cerca de 30 plantas. No caso de mais de 30 plantas precisam de ser infiltrada, um novo lote de mistura de Agrobacterium infiltração deve ser fornecido.
4. Os parâmetros específicos apresentados neste trabalho são otimizados para expressão de proteínas utilizando N. benthamiana plantas cultivadas sob condições específicas descritas acima com desconstruídas vectores baseados em vírus. Como discutido anteriormente, tele parâmetro mais difícil controlar esta metodologia é o material de planta. Nós expressamos uma variedade de vacinas e proteínas terapêuticas utilizando plantas eo procedimento de infiltração descrevemos aqui e obteve excelentes resultados em todos os casos 4,8,14,18,21-23. Estes resultados demonstraram que as condições que foram desenvolvidos são óptimas para a expressão da proteína. No entanto, se diferentes espécies de plantas hospedeiras, vetores de expressão, ou diferente N. Condições de crescimento benthamiana foram usadas para a infiltração, cada parâmetro nesta metodologia precisa de voltar a ser optimizado por meio de experimentos.
No geral, nós demonstramos que agroinfiltration com seringa e vácuo é uma metodologia simples, mas eficiente para a introdução de genes alvo em plantas por Agrobacterium transportando para a expressão transitória de proteínas recombinantes. Ambos os métodos têm suas vantagens únicas, dependendo do objetivo da pesquisa e produção. Infiltração seringa é simples, requerendoes apenas pequenos volumes de cultura de Agrobacterium e não precisa de bombas caros e as câmaras de vácuo. Como foi demonstrado no presente relatório, tem a flexibilidade necessária para se infiltrar ou toda a folha com um gene alvo ou usar mancha de infiltração para introduzir genes de múltiplos alvos em uma folha. Todo o método de infiltração de folha pode ser usada para a expressão de escala laboratorial pequena de proteína recombinante para a sua caracterização bioquímica, a purificação, a pré-clínicos e estudos funcionais 1. Em contraste, o local de infiltração podem ser usadas para expressar vários alvos de proteína sobre uma folha para comparar o seu rendimento, a cinética de expressão e de toxicidade para as plantas. Ele também pode ser usado para comparar a expressão de uma proteína repórter tal como DsRed ou GFP conduzida por vectores de expressão diferentes na mesma folha. Como resultado, a capacidade do vector diferente na condução de acumulação da proteína e a sua cinética de expressão podem ser caracterizados. A simplicidade de infiltração seringa também permite que umferramenta viável para ensinar e treinar o ensino médio e estudantes de graduação no tema da biotecnologia e da engenharia genética.
Em comparação com a infiltração de seringa, infiltração por vácuo requer o investimento de bombas de vácuo e câmaras e maiores volumes de culturas de Agrobacterium. Portanto, não é o método de escolha quando precisa apenas de algumas plantas que deve ser infiltrada. No entanto, ele fornece a escalabilidade, que não pode ser igualada por infiltração seringa. É mais robusto e pode infiltrar um grande número de plantas num curto período de tempo. Com a escala apresentada neste relatório, somos capazes de produzir o nível de gramas de proteínas farmacêuticas purificada suficiente para uma fase I de ensaio clínico humano 4. Além disso, este processo pode ainda ser dimensionada e para produção comercial de proteínas farmacêuticas a partir de plantas. Por exemplo, os processos estão a ser concebidos para aspirar infiltrado três toneladas de N. benthamiana plantas por horaem uma operação de aumento de escala 24. Outra vantagem da infiltração por vácuo é que ele pode ser usado para agroinfiltrate espécies de plantas que não são propícios para a infiltração de uma seringa.
Em resumo, a combinação de seringa e infiltração a vácuo fornece pesquisadores, biotecnólogos e educadores uma metodologia simples, eficiente, robusta e escalável para a expressão transitória de proteínas recombinantes em plantas. Vai facilitar muito o desenvolvimento ea produção de proteínas farmacêuticas e promover a educação científica.
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Disclosures
Os autores não competindo interesses financeiros.
Acknowledgments
Agradecemos R. Sun e outros estudantes do laboratório de Chen por sua contribuição para usina de geração de material. Agradecemos também a Dr. D. Green por seu apoio de pesquisa de graduação na Faculdade de Tecnologia e Inovação (CTI). Esta pesquisa foi apoiada em parte pelo NIH concede U01 AI075549 e 1R21AI101329 para Q. Chen, e uma bolsa de SSE de CTI do Arizona State University para Q. Chen. K. Leuzinger, M. Dent, J. Hurtado, e J. Stahnke são estudantes de graduação apoiados pela concessão SSE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| GFP | Invitrogen | V353-20 | www.invitrogen.com See reference: Lico and Chen, et al 2008 |
| DsRed | Clontech | 632152 | www.clontech.com See reference: Baird and Zacharias, et al 2000 |
| MagnICON Vector | Icon Genetics | n/a | www.icongenetics.com See reference: giritch and Marillonnet, et al 2006 |
| Geminiviral Vector | Author’s Lab | n/a | See reference: Chen and He, et al 2011 |
| N. benthamiana | Author’s Lab | n/a | herbalistics.com.au |
| Agrobacterium tumefaciens strain gv3101 | Author’s Lab | n/a | See reference: Lai and Chen 2012 |
| LB Agar Carbenicillin-100, plates | Sigma | L0418 | www.sigmaaldrich.com |
| LB Agar Kanamycin-50, plates | Sigma | L0543 | www.sigmaaldrich.com |
| Magnesium sulfate hepa hydrate | Sigma | M2773-500 g | www.sigmaaldrich.com |
| Bacto-Tryptone | Fisher | 73049-73-7 | www.fishersci.com |
| Bacto Yeast Extract | Becton, Dickinson CO. | REF 212750 | www.bd.com |
| Difco Nutrient Broth | Becton, Dickinson CO. | REF 234000 | www.bd.com |
| MES hydrate Buffer | Sigma | M8250-1kg | www.sigmaaldrich.com |
| Carbenicillin | Sigma | C1613-1ML | www.sigmaaldrich.com |
| Kanamycin | Sigma | 70560-51-9 | www.sigmaaldrich.com |
| Sodium Hydroxide | Sigma | 221465 | www.sigmaaldrich.com |
| Jack’s Fertilizer | Hummert International | Jul-25 | www.hummert.com |
| Equipment | |||
| Vacuubrand MD4 Vacuum Pump | Fisher | 13-878-113 | www.fishersci.com |
| Vacuum Air Regulator Valve | Fisher | NC9386590 | www.fishersci.com |
| Desiccator 12 1/8" with O ring | Fisher | 08-594-15C | www.fishersci.com |
| 3 L Tub | Rubber-Maid | n/a | Rubbermaid Servn’ Saver Bowl, 10-cup will work |
| plate/shelf 230ML | Fisher | NC9489269 | www.fishersci.com |
| Peat Pellet | Hummert International | 14-2370-1 | www.hummert.com |
| Propagation Tray Dome | hydrofarm | 132052 | www.hydroponics.net |
| Propagaiton Tray | hydrofarm | 138758 | www.hydroponics.net |
| Virbo Hand Seeder | Gro-Mor INC | n/a | www.gro-morent.com |
| Flora Cart 4 shelf | Hummert International | 65-6924-1 | www.hummert.com |
| 15 ml Round Bottom Culture Tubes | Sigma | CLS430172-500EA | http://www.sigmaaldrich.com |
| Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | www.bio-rad.com |
| Spectrophotometer Cuvettes | Bio-Rad | 223-9950 | www.bio-rad.com |
| Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1415-2500 | www.usascientific.com |
| Benchtop Centrifuge | Bio-Rad | 166-0602EDU | www.bio-rad.com |
| Incubator/Shaker | Eppendorf | Excella E25 | www.eppendorf.com |
| Ultraviolet Light Model#: UVGL-25 | UVP | 95-0021-12 | www.uvp.com |
References
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