Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Rekombinant Proteinlerin Yüksek-düzey Geçici İfade için Bitkiler Verimli Agroinfiltration

Published: July 23, 2013 doi: 10.3791/50521
* These authors contributed equally

Summary

Bitkiler Geçerli ifade paradigmalar göre daha daha fazla, ölçeklenebilir bir maliyet-etkin ve emniyetli olan, bir ticari bir ölçekte ilgili sayısız farmasötik bir proteinlerin bölgesinin üretimi için bir Roman sistem mü tavsiye edeceksiniz. Bu çalışmada, biz içeren hedef-gen tanıtmak için bir basit ve kullanışlı, henüz ölçeklenebilir bir yaklaşım rapor

Abstract

Memeli hücre kültürü İnsan aşısı ve terapötik proteinler bölgesinin ticari bir üretimi için gerekli ana bir platform olduğunu. Ancak, onun sınırlı ölçeklenebilirlik ve yüksek maliyet nedeniyle ilaç için artan dünya çapında talep karşılamak değildir. Bitkiler sağlam, ölçeklenebilir, düşük maliyetli ve güvenli olan en umut verici alternatif ilaç üretim platformlarından biri olduğu gösterilmiştir var. Virüs-temelli Vektörel Çizimler bölgesinin son gelişme bitkilerde otelinin yeniden birleştirici proteinlerin bölgesinin çabuk ve daha yüksek-düzey geçici ifade izin verdi biriktirdi. Daha da geçici ifade sisteminin yardımcı programı optimize etmek için, biz bu çalışmada bitki doku içine hedef-genini içeren Agrobacterium tanıtmak için bir, basit, verimli ve ölçeklenebilir metodoloji göstermek. GFP ve DsRed; Bizim sonuçlarımız yöntemleri yaprakları ve, iki floresan proteinleri bölgesinin sağlam bir üretim haline Agrobacterium'un bölgesinin etkin bir şekilde giriş sonuçlandı oylandı şırınga ve vakum her ikisi de ile bu agroinfiltration işaret etmektedir. Bundan başka,biz her iki yöntem tarafından sunulan benzersiz avantajlar göstermek. Şırınga infiltrasyon basittir ve pahalı ekipman gerekmez. Bu, aynı zamanda esneklik ya da tek bir hedef geni ile olmak üzere bütün bir izni içine süzülmek maksadıyla, ya da bir yaprak ilgili sayısız birden fazla hedeflere bölgesinin genleri tanıtmak için fiyatları karşılaştırın. Bu nedenle, bu yeniden birleştirici proteinlerin bölgesinin laboratuar ölçekli bir ekspresyonu için yanı sıra tekrarlamalı olarak verim ya da ifade kinetiği, için farklı proteinler ya da Vektörel Çizimler fiyatları karşılaştırırken için ikinci el edilebilir. Şırınga infiltrasyon sadeliği, aynı zamanda biyoteknoloji konusunu için lise ve üniversite eğitimi yılında kendi programını göstermektedir. Buna karşılık yılında, vakum infiltrasyonu ile daha sağlam bir olduğunu ve farmasötik bir proteinlerin bölgesinin ticari bir Üretim yılı için ölçekli-kadar olabilir. Ayrıca bu tür marul ve Arabidopsis olarak şırınga infiltrasyon için mükellef değildir bitki türleri agroinfiltrate mümkün olmanın avantajı sunuyor. Genel olarak değiştirin, şırıngayı ve vakum agroinfiltration bölgesinin bir kombinasyon araştırmacı ve eğitimci tarafından görüşler sağlar, bir, basit, verimli, ve sağlamgeçici protein ekspresyonu için metodoloji. Bu büyük ölçüde ilaç proteinlerin gelişimi kolaylaştırmak ve fen eğitimi teşvik edecektir.

Introduction

1970'lerden bu yana, bitkiler rekombinant proteinler ve protein tedavi 1 en ticari üretimi için, memeli böcek, ve bakteriyel hücre kültürleri alternatif olarak araştırılmıştır. Biyofarmasötik ifadesi için bitki-tabanlı sistemler klinik çalışmalarda başarı göstermiştir, Gaucher Hastalığı 2, ve kuş H5N1 gribi 3 gibi hastalıklar, için birkaç yeni tedaviler olarak son yıllarda söz göstermiştir. Bu ilk deneyleri yılından bu yana on yıllarda bitkilerde rekombinant protein ekspresyonu için yetkili mekanizmaların gelişimi üç ana nedenden dolayı protein Mevcut üretim paradigma değiştirmek için bitki-tabanlı sistemler için potansiyel yarattı. İlk olarak,, memeli böcek, ve bakteriyel biyoreaktörler hatırı sayılır başlangıç ​​maliyetleri, pahalı büyüme ortamı, ve aşağı akım saflaştırma 4 için karmaşık süreçler gerektiren olarak maliyet yılında kayda değer bir azalma var. Istikrarlı bir transgenik bir bitki bölgesinin yaratılması,hatları da protein ifade bitkilerin yetiştirildiği ve bir tarım ölçeği 5 üzerinde hasat olabilir gibi onları diğer ifade sistemlerinin ölçeklenebilirlik geride için izin verir. İkinci olarak, bitki-tabanlı ifade sistemleri önemli ölçüde kamu güvenliği 6 içinde üstünlüğünü gösteren, insanlara protein-ifade ana bilgisayardan bir insan veya hayvan patojen verici riskini azaltmak. Son olarak, bitkiler glikosilasyon ve birden çok-alt-birimi proteinlerin 7 bölgesinin derleme dahil olmak üzere proteinleri bölgesinin düzgün bir yazılan Mesajı göster-translasyonel modifikasyonu için izin veren, memeli hücreleri için 'e benzer olduğunu, bir ökariyotik endomembran sistemi kullanmaktadır. Bu yetenek bir daha karmaşık yapıya sahip ve kapsamlı posttranslasyonel değişiklikler veya montaj 8 gerektiren, monoklonal antikorlar (mAbs) de dahil olmak üzere ilaç rekombinant proteinlerin daha geniş bir dizi, yılından bu yana, bakteriler gibi prokaryotik sistemleri, dayalı olanlar öncesinde bitki-tabanlı sistemler koyar.

Iki büyük beğenme vardır Birbitkiler otelinin yeniden birleştirici proteinler ifade eden bulundunuz aşkınla kanıyor. Olanlar önce Herhangi, hedef ilgili protein için kodlama DNA'nın bir ifade kaset içine klonlandı ve nükleer ya da kloroplast, genomların Her iki durumda da için tanıtıldı, bir stabil bir şekilde transgenik hattı ile, bölgesinin bir gelişmedir. Bunu yaparken, yabancı DNA nesiller başarılı yoluyla kalıtsal hale gelir ve kadar diğer ekspresyon sistemleri 1 özelliğinin ötesinde bir, muazzam geliştirilmiş ölçeklenebilirlik için izin verir. Nükleer genom için bunlara dışarıdan ayrıca DNA sokulması; Ortalama gönderim süresi doku, 9 takım arasından mikroprojektil bombardımanı edenler tarafından, daha az sıklıkta,, bir bitki dokusu bölgesinin Agrobacterium tumefaciens'in enfeksiyon edenler tarafından gerçekleştirildiğini ya da edilir. Bitki hormonları O zamanki farklılaşma ve kökleri ve yaprakları gibi bu tür transgenik bir bitki dokusunun bölgesinin büyümesini teşvik etmek için ikinci el uygulanır. Olan kloroplastın genom bölgesinin dönüştürülmesi A ile birlikte elde edilebilir değil, olabilir DNA ile kaplanmış tumefaciens ', fakat altın veya tungsten partikülleri, ilgili sayısız tamamen güvenir bitki hücrelerine yerleştirmek için balistik olarak ateş etti. Recombina ifade İkinci yöntembitkiler otelinin nt protein geçici ifade aracılığıyla 10 olduğunu. Bu senaryoda yılında, faiz bölgesinin edilen geni taşıyan virüs-Türetilmiş bir Vektörel Çizimler A. cihaz aracılığıyla teslim edilir bir süreç yoluyla tam gelişmiş bitkiler için tumefaciens agroinfiltration çağırdı. Bunun yerine, bitki genomuna içine entegre bölgesinin idarelerce, teslim alınan gen yapısı, O zamanki, kısa bir kuluçka bir süre sonra hasat edildi ve izole edilebilir verebiliriz, böylelikle istenilen proteinin, bölgesinin geçici doğrudan üretimde bulunmak bulundunuz başlayacak doyurmaya. Bitkiler agroinfiltration 11 sonra yaklaşık 1-2 hafta hasat için hazır olacak gibi geçici gen ekspresyonu, daha büyük bir genel protein birikimi yanı sıra protein üretim geliştirilmiş bir zaman avantajı sunuyor. Bu, bir yıl için birkaç ay sürebilir istikrarlı transgenik bitki hatları, nesil, seçimi, ve onay süreçleri daha önemli ölçüde daha hızlı olduğunu. Bu genetik olarak istikrarlı bitki li verim olmayacak gibi Ancak bu,, aynı zamanda geçici ifade sisteminin sınırlamasıdırbüyük bir ölçekli ticari üretim için bir tohum bankası oluşturmak için de kullanılabilir olabilir Nes. Bu rağmen, yaklaşımları büyük ölçekli bir geçici ifade iyileştirmek için geliştirilmiştir oylandı oylandı. Burada, biz A. edenler tarafından teslim edilen yapıbozuma viral bir Vektörel Çizimler kullanarak geçici bir proteini-ifade eden Nicotiana benthamiana bitkilerin bölgesinin nesil bölgesinin biri yöntem ortaya koymaktadır tumefaciens.

İki büyük Yöntemleri A. bölgesinin Sevkiyat için geliştirilen ediliyor edilmektedir bitki doku içine tumefaciens: vakum odası aracılığı ile şırınga ve büyük ölçekli infiltrasyon aracılığı ile tezgah ölçek infiltrasyonu. Her iki protokol N. kullanıyorsanız burada açıklanmıştır yakından ortak tütün bitki ile ilgilidir benthamiana,, iki floresan proteinleri geçici ifadesi için ev sahibi bitki olarak: denizanası Aequorea victoria ve Discosoma mercan (DsRed) 12,13 gelen kırmızı floresan proteini gelen yeşil floresan proteini (GFP). N. benthamiana için var En sık görülen ev sahibi bitki olduğunubu genetik transformasyon için uygun, çünkü rekombinant protein, hızlı bir şekilde biyokütle yüksek miktarda verim, ve ölçek-up üretim 14 için bir üretken tohum üreticisidir olabilir. N kullanarak bölgesinin bir diğer gibi olanaklar protein ekspresyonu için hosts olarak benthamiana ekspresyon Vektörel Çizimler 2,5 bölgesinin, bir ve çeşitli bölgesinin Rezervasyon durumuna olduğunu. Bu çalışmada, yılında, iki yapıbozuma viral bir Vektörel Çizimler de, bir tütün mozaik virüsü (TMV) RNA dır replikon da içerebilir sistemi (MagnICON Vektörel Çizimler) ve fasulye sarı, cüce bir virüsü (BeYDV), DNA replikon da içerebilir sistemi (geminiviral Vektörel Çizimler) 4,11 adlı işletmeye türeyen diğer, ilgili sayısız dayalı bir 15-18, GFP ve DsRed gen taşımak ve N. içine onları teslim etmek için kullanılan edilir A. yoluyla benthamiana hücreleri tumefaciens '. Üç DNA yapıları GFP ile veya MagnICON Vektörel Çizimler ile birlikte DsRed ekspresyon için ikinci el uygulanmaz doyurmaya. Onlar İlgi bölgesinin ait geni ihtiva eden modülü (PiCh 5 en ', hedef gen, normal gene 3 bölgesinin ifade sürüş için en promotör ve diğer genetik elementler içeren modülü (pICH15879)' include-GFP veya PiCh-DsRed) eklenmiş ve, integraz modülü (pICH14011) ifade 8,15 üzerine doğrudan 5 've 3' modüllerin birlikte başarılı çalışmalarını entegre eden bir enzim için kodlama tekniklerinin anlaşılması. Üç DNA yapıları, aynı zamanda geminiviral Vektörel Çizimler ile ilgili yeni biçimler için ihtiyaç vardır. , Hedef genin (pBYGFP ya da pBYDsRed) bölgesinin replikon da içerebilir ihtiva eden Vektörel Çizimler bulundunuz Buna ek olarak yani, çoğaltma proteini (pREP110) Şunun için kodlama yapan bir Vektörel çizim, hedef replikon da içerebilir 11,14,16 bölgesinin amplifikasyonu için gereklidir. Bundan başka, domates bushy stunt virus adlı işletmeye susturma bastırıcı syf 19 kodlayan bir Vektörel çizim bölgesinin eklenmesi yüksek seviyesi hedef gen ekspresyonu 11,16 için arzu edilir.

Bitki büyüme, A. de dahil olmak üzere agroinfiltration edenler tarafından bitki hücrelerine yerleştirmek için yeniden birleştirici proteinlerin bölgesinin genlerin bölgesinin tanıtımı yılı için üç büyük adımlar genel olarak, vardır Bir tumefaciens kültür hazırlanması, ve infiltrasyon. Her biri için her adımda Bu yordamı bölgesinin nihai başarısı için kritik öneme sahiptir gibi, bu nedenle, ayrıntılı bir açıklama verilmedi edilmektedirşırınga infiltrasyon ve aşağıda vakum infiltrasyon her ikisi için de.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Bitki Büyüme

  1. Bir yayılma tepsiye Sıra 60 turba pelet. Musluk suyu bölgesinin 4 L-ekleyin ve bunları turba peletler, 2 saat için en su emme izin ver.
  2. 2 N. Ekle bir ekme makinesi kullanarak her bir turba pelet içine benthamiana tohumları, bir şeffaf plastik kubbe ile tepsiyi kapağı, ve onları bir 16/8 saat gündüz / gece döngüsü (Şekil 1A) ile bir 25 ° C, 84% nemli bir ortamda çimlenmeye için izin verir.
  3. , Iki hafta içinde tohumlama sonra kubbe Filtreyi kaldır kaseti adlı işletmeye su tahliye, ve 1.48 Kullanıcı g / L olarak (Şekil 1B) bölgesinin bir konsantrasyonda Jack at ait Kullanıcı gübre bölgesinin 2 L ekleyin. Bir 16/8 saat gündüz / gece döngüsü ile bir 25 ° C, 50% nemli bir ortamda bitkiler büyümek için devam edin. Jack'in gübre 2 L tepsi başına her 2 gün Tedarik.
  4. Onlar yaş 6 hafta (Şekil de infiltre edilecek hazır olana kadar hafta 4 anda, daha fazla büyüme (Şekil 1C) için yeterli alan sağlamak için altı bitkiler barındıran bir yeni bir tepsiye turba pelet ile bitkiler transferi1D).

2. A. tumefaciens Kültür Hazırlık

Şırınga İnfiltrasyon için 2.1 Hazırlık

  1. Streak A. geminiviral Vektörel Çizimler P19, pREP110, pBYGFP, ve kanamisin (100 ug / ml), içeren LB Agar, plakalar ilgili sayısız pBYDsRed ihtiva eden tumefaciens 'GV3101 suşlarında rastlanmaktadır. Streak tek bir plaka başına şekil değiştirme ve, 48 saat boyunca 30 ° ° C de büyür.
  2. Benzer bir şekilde, çizgi ve LB, Agar, ilgili sayısız GV3101 5 en bölgesinin MagnICON Vektörel Çizimler yataklık suşları 'modülü (pICH15879), nin 3' GFP ile veya DsRed (PiCh-GFP veya PiCh-DsRed) bölgesinin söz konusu hedef gen ihtiva eden modülünü yüklemekte ve İntegraz (pCH14011 sahip) giderek büyümeye karbenisilin (100 ug / ml), ihtiva eden plakalar için mükemmeldir.
  3. LB Agar plağı ilgili sayısız, bir tek bir koloni Şu kaynaktan, YENB medya, 3 ml (% 0.75 Bacto maya özü,% 0,8 'i Besin Elementi Broth,, İN NaOH, ile 7.5' pH değeri ayarlamak) içine geminiviral Vektörel Çizimler yataklık GV3101 suşları inoküle edin +, kanamisin (100 İsim: ug / ml) bölgesindeki , bir 15 ml lik yuvarlak-alt kültür tüp, ° C olarak 30 okuyun sıvı kültürü büyümekbir 300 rpm dönme oranı ile bir gecede bir çalkalayıcı.
  4. Benzer bir şekilde, inoküle ve 30 okuyun, çalkalayıcı gece boyunca otelinin YENB ortamı + karbenisilin (100 ug / ml), otelinin MagnICON Vektörel Çizimler barındıran GV3101 suşları ° ° C. büyümek
  5. , Bir Spektrofotometre ayarlandıktan ve uygun antibiyotikler ile YENB medya bölgesinin 10 mi bölgesindeki 0.025 'bölgesinin bir başlangıç ​​OD 600 ile birlikte, bir yeni bir kültür için alt-kültürlenmiştir biçimde duyulabilmesi için gerekli ses seviyesi (V alt) hesaplamak almak için aşağıdaki şu formülü kullanınız ile birlikte her bir sıvı kültür için uygun şekilde ölçü ve kayıt OD 600 ile değerleri, .
    V sub (mi) = (10 mi) x (0.025) daha kötü / OD 600 ile
  6. Için gecede kültür Devri V alt (ml) (10 - V alt) her bir suş için uygun antibiyotik ile YENB medya ml. , Yeni kültürü 30 okuyun bir gecede bir 250 rpm Eksende Dönme oran na sahip bir çalkalayıcı ° C de OD 600 değeri var 1.7-2.0 bölgesinin olan erim içinde bulunmaktadır e kadar. Büyütün
  7. Ölçün ve kayıt OD her bir sıvı kültür için 600 değerleri ve kalk için aşağıdaki formülü kullanınher bir suş için 0.12 bölgesinin, bir yarıyıl sonu OD 600 vermek üzere infiltrasyon tamponu bölgesinin to 50 ml 'otelinin seyreltilerek kullanılır için en gerekli hacim (V inf) içeren dizine ulate.
    V Inf (mi) = (50 mi) x (0,12 inç) / OD 600 ile
  8. Transferi, türbindeki V bir mikrosantrifüj tüp bulundunuz, her kültürün bölgesinin Inf (ml) ve 2 dakika Ülke: boyunca 12.000 xg'de okuyun santrifüj edenler tarafından hücreleri aşağı doğru döndürün, yüzer tabakanın kaldırmak ve daha sonra (10 mM MES, pH = 5.5 10 ml 'infiltrasyon tampon içinde hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin; 10 mM MgSO 4) kısaca vorteks tarafından.
  9. Mix pBYGFP + pREP110 + p19 hücreleri yeniden süspanse, 2 dakika süreyle 12.000 xg'de hücreleri aşağı spin, ve infiltrasyon tampon 50 ml toplam tekrar süspansiyon haline getirin. Bu, Agrobacteria'nın bir kombinasyon, GFP bölgesinin geminiviral ekspresyon için olduğunu.
  10. Benzer şekilde,, Agrobacterium hücrelerin aşağıdaki kombinasyonları karıştırın aşağı spin ve infiltrasyon tampon 50 ml bunları tekrar süspansiyon haline getirin. Bunlar şunlardır (1) pBYDsRed + pREP110 DsRed bir geminiviral ifadesi, (2) pBYGFP + pBYDsRed + pREP110 için + p19GFP ve DsRed, (3) pREp110, GFP bölgesinin MagnICON ekspresyonu, (5) Şunun için geminiviral ekspresyon bölgesinin negatif kontrol olarak B + syf 19, (4) PiCh GFP +-pICH15879 + pCH14011 PiCh-DsRed + pICH15879 + bölgesinin eş-ekspresyonu geminiviral + için syf 19 MagnICON DsRed ifade, ve MagnICON ifade için negatif kontrol olarak (6) pICH15879 + pCH14011 için pCH14011.

Vakum İnfiltrasyon için 2.2 Hazırlık

  1. Inoküle edin ve kültür, her GV3101, bir to 50 ml 'otoklavlanmış şişeye otelinin uygun antibiyotikler ile YENB medya bölgesinin 15 mi içine geminiviral Vektörel Çizimler ya da MagnICON Vektörel Çizimler ihtiva eden şekil değiştirme ve büyümek gibi bir gecede yukarıda bulunan şırınga infiltrasyon için tarif edildiği.
  2. Bir spektrofotometre ve uygun antibiyotik ile YENB medya 250 ml içinde 0.025 bir başlangıç ​​OD 600 ile bir yeni bir kültür için alt kültürlenmeli için gerekli hacmi (V alt) hesaplamak için aşağıdaki formülü kullanınız ile her bir sıvı kültür için ölçün ve kayıt OD 600 değerleri .
    V alt 600 ile
  3. Transferi V için gecede kültür alt (ml) (250 - V alt) her bir suş için uygun antibiyotik ile bir 1 L otoklavlanmış şişesi içinde YENB medya ml ve bir gece boyunca yukarıdaki gibi şırınga infiltrasyon için açıklanan yeni bir kültür büyür.
  4. Ölçün ve kayıt OD her bir sıvı kültür için 600 değerleri ve her bir suş için 0.12 bir son OD 600 vermek için infiltrasyon tampon 3 L içinde seyreltilerek kullanılır gerekli hacmi (V inf) hesaplamak için aşağıdaki formülü kullanın.
    V Inf (mi) = (3000 ml) x (0,12 inç) / OD 600 ile
  5. Pelet ve şırınga bulunduğu infiltrasyon için tarif edildiği ve şırınga bulunduğu infiltrasyon için tarif edildiği her kombinasyonu için bir göre olan yeniden süspanse kültürler kaynaşır olduğu gibi infiltrasyon tamponu içinde, her kültürün bölgesinin Pastör pipetiyle V Inf (ml) eklenmiştir. Repellet karışık Agrobacteria'nın hücreleri ve infiltrasyon tamponu 3 L 'si otelinin onları tekrar süspansiyon haline getirin.

3.1 Şırınga Sızma

  1. Dört 6-hafta eski N. seçin 5'te ile birlikte benthamiana bitki her bir bırakır. Her bitkinin bölgesinin En iyi adlı işletmeye sayma olanlar önce Herhangi üç yaprak çıkar A. bölgesinin kombinasyonları bölgesinin tek bir tıklamayla tamamen infiltre edilmelidir doyurmaya infiltrasyon tamponu içinde suşları Hüseyin Avni ÖKTEM. Dördüncü yaprak olacak nokta-sızmış geminiviral ifade için tüm dört gerginlik kombinasyonları veya MagnICON ifade için her üç kombinasyonları ile. Her bir bitki üzerinde son yaprak negatif kontrollerin kombinasyonları ile infiltre edilecektir.
  2. Yaprak arka yüzünde (Şekil 2A) üzerindeki epidermiste bir iğne ile bir küçük bir nick oluşturun. Dikkat: infiltrasyon karışımdaki edildiği gibi Agrobacterium hücrelerin yaprağın diğer tarafına ponksiyon geçecek gibi, her iki tarafın yoluyla yaprak delmek için olarak çok zor çizmemeye emin olun.
  3. Yaprak ön tarafında sağlam bir tutun alın ve nazik uygularkenbir elin başparmak ile nick için karşı basınç, bir iğne (Şekil 2B) olmadan bir şırınga ile nick içine infiltrasyon tampon içinde Agrobacterium karışımları enjekte. Not: Agrobacterium karışımın yaprak en hücreler arası alanı girer olarak, infiltre alanı (Şekil 2C) gözle görülür bir şekilde koyu yeşile döner.
  4. Koyu yeşil bir daire genişletmek için durana kadar nick içine Agrobacterium karışımlar enjekte etmek için devam edin. Tüm yaprak sızmış ve bütün yaprak ilk üç yaprak ve son yaprak için daha koyu yeşil döner edilir kadar başka bir nick ve adımları tekrarlayın 3.1.2-3.1.4 oluşturun.
  5. Her bitkinin dördüncü yaprak için, Tüm dört (geminiviral vektör) ya da üç (MagnICON vektör) kombinasyonları içine sızmış edilecektir. Agrobacterium suşların her bir kombinasyon için bir tane nick yapmak, ve bir kombinasyonu ile her nick sızmak.
  6. Infiltrasyon sonra, büyüme oda ve monitör için bitkiler geri hareket2-15 gün sonrası infiltrasyon (dpi) arasında tor protein ekspresyonu.

3.2 Vakum Sızma

  1. Bir vakum desikatörde ve küvet için Agrobacterium suşları içeren transferi 3 L infiltrasyonu tampon içine bir küvet yerleştirin. , Bir Vacuubrand diyafram vakum pompası (Şekil 3A) için en desikatöre iletişime geç.
  2. Desikatöre plaka (Şekil 3B) üzerinde baş aşağı bir bitki yerleştirin ve tüm yaprak ve kök sistemi küvet tepesine dinlenme plaka ile infiltrasyon tampon içine batık kadar bitki ile plaka daha düşük. Kenarı boyunca desikatöre O-ring yerleştirin ve odası (Şekil 3C) üzerindeki desikatöre kapak koymak.
  3. Vakum pompası açın ve vakum 100 mbar ulaştığında zamanlama başlar. Yavaş yavaş sular altında bitki dokusu bölgesinin interstisyel boşluk içine Agrobacteria'nın bölgesinin girişinde izin vermek için 100 İsim: mbar az 1 dakika Ülke: sonra, kurutma cihazı ile ilgili en serbest bırakma valfi açık. Bu adımı bir Additi yılında tekrarlayıniyi infiltrasyon sağlamak için Önal zaman.
  4. Infiltrasyon sonra, desikatöre en bitki dışarı almak ve dik konuma onu geri koymak. 2-15 dpi arasındaki büyüme oda ve monitör protein ekspresyonu için bitkiler geri hareket ettirin.

4. Floresan Protein Algılama ve Fotoğrafçılık

  1. Karanlık bir odada içine dpi, hareket bitkiler 2 başlayarak ve bir el-tutulan UV lamba ile infiltre yaprakların arka tarafında UV ışığı parlaklık.
  2. GFP veya DsRed en kırmızı floresan en yeşil floresan gözlemlemek. DsRed kısa dalga UV ışığı altında daha güçlü iken GFP, uzun dalga UV ışığı ile bir güçlü bir sinyal kapalı verir.
  3. Hiçbir flaş ile bir normal bir dijital kamera ile floresan yaprakların foto ¤ raf çekin.
  4. Gözlem ya da fotoğraf sonra büyüme odasına bitkiler geri hareket ettirin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

1. Şırınga İnfiltrasyon tarafından Floresan Proteinlerin İfade

Geminiviral ve MagnICON - - N. iki farklı yapıbozuma bitki viral vektörler tarafından - GFP ve DsRed - bitki doku içine Agrobacterium şırınga infiltrasyonu etkinliğini göstermek için, biz iki floresan proteinleri ifadesi test benthamiana. N. için tamamen Agrobacteria'nın ihtiva eden geminiviral Vektörel Çizimler ile birlikte infiltre edildi benthamiana yaprakları, GFP ifade gibi erken bir 2 olarak dpi adlı işletmeye başlayarak UV ışığı altında,, tüm yaprak alanı den fazla gözlenen ve 4 dpi'ye kadar (Şekil 4C) ile okuyun tepe noktası birikimi ulaşılmıştır. Geminiviral Vektörel çizim edenler tarafından Bu, erken bir, GFP İfade, diğer yeniden birleştirici proteinlerin 14,16,18,19 bölgesinin önceki çalısma sonuçları ile tutarlı bir olduğunu. Bunun aksine, MagnICON Vektörel çizim-ihtiva eden, Agrobacterium kombinasyonlar yalnızca 5'te dpi sonra,, GFP bir flüoresans gösterdi; ve maksimum noktasına ulaşır ulaşmaz accumulati ile infiltre yapraklarını7 dpi (Şekil 4D) de üzerinde. Mesafede Resim yeşil renkte bir floresan pREP110 bölgesinin negatif kontrol, Agrobacterium bunların karışımları ile infiltre yaprakları adlı işletmeye gözlendi + syf 19 (Şekil 4B) ya da pICH15879 floresans adlı işletmeye bir arka plan floresan bölgesinin bir sonucu değil, GFP geninin bulundunuz spesifik idi ve was olduğunu belirten + pCH14011 (veri yeri gösterilmiştir değil,), yaprakları. Zirveye birikimi anda, MagnICON vektör-dile getirilen GFP floresan daha önce diğer rekombinant proteinler 8,18 için elde edilen sonuçları 'e benzer geminiviral vektör (Şekil 4C ve 4D), göre daha daha yoğun olduğunu. Temporal ifade desen ve DsRed bölgesinin göreli floresan yoğunluğu, GFP (veri yeri gösterilmiştir değil,) bölgesinin edilene 'e benzer vardır. Hiçbir büyük nekroz GFP yapıları (Şekil 4A) ile infiltre yapraklar üzerinde gözlenmiştir. Benzer sonuçlar,, aynı zamanda ne floresan Proteinler, bitkisel ile Paketli Me yüksek ölçüde toksik olup olduğunu belirten, DsRed-ortaya koyan bitkiler, were dikkat etmek içinlls. Ancak, nick sitesinde yerel nekroz gözlenen ve onlar fotoğraflarda "delik" (Şekil 4) olarak ortaya çıktı edildi. Her iki floresan proteinler şırınga nokta-infiltrasyonu ile geminiviral vektörler yoluyla aynı yaprak üzerinde ifade edildi Ne zaman, onlar infiltre edildi nokta (Şekil 5) içinde kendi beklenen floresan renk ile tespit edildi. İlginç bir şekilde, GFP bölgesinin eş-infiltrasyonu ve DsRed (Şekil 5) sarımsı bir floresans otelinin ile sonuçlanmıştır. DsRed floresans bölgesinin yoğunluğu, en aynı yaprak ilgili sayısız, GFP bölgesinin olduğunu göre daha daha zayıf olduğu ortaya çıktı. Ancak, bu DsRed en daha zayıf ifadesi yansıtmıyor olabilir, ama UV ışığı tarafından DsRed daha az-daha-en uygun uyarma oldukça nedeniyle. Genel olarak, bizim sonuçları şırınga infiltrasyonu verimli bir şekilde rekombinant gen-taşıyan bitki yaprakları içine Agrobacterium tanıttı ve bizim hedef proteinlerin sağlam ekspresyonu sağladığını göstermektedir. Buna ek olarak, biz bu yöntem, inşa etme esnekliği fiyatları karşılaştırın olduğunu göstermiştirity ikisinden biri bir hedef proteinin maksimal birikimi için tüm yaprakları sızmak için ya da ifade ve ifade desen karşılaştırmak için birden fazla vektörler ile birden fazla protein hedefleri nokta-sızmak için.

2. Vakum İnfiltrasyon edenler tarafından Floresan Proteinleri bölgesinin İfade

Vakum infiltrasyon, aynı zamanda tesisi geçici ifade sistemleri, edenler tarafından yeniden birleştirici proteinlerin bölgesinin büyük bir-ölçekli üretimi için ikinci el edilebilir, bir ölçeklenebilir bir agroinfiltration yöntem geliştirmek için muayene edilmiştir. Bizim sonuçlarımız, temporal ekspresyon, GFP bölgesinin desen ya da geminiviral ve MagnICON Vektörel Çizimler edenler tarafından DsRed infiltrasyonu yöntem, bölgesinin değişikliği edenler tarafından değiştirilmiş ve şırınga infiltrasyon bölgesinin edilene 'e benzer kaldı değildir edildi olduğunu işaret etmektedir. Bir bitki bölgesinin bütün bir sürgün vakum infiltrasyonu sırasında infiltrasyon karışım, otelinin batık olduğunu şöyle de, flöresanmm, süzdürülmüş bitkilerin bölgesinin tüm yaprakları için, GFP (Şekil 6) Şunun için gözlendi. Şırınga infiltrasyonu ile karşılaştırıldığında, bu daha sağlamdır ve yapabilirsiniz acçok daha kısa bir zaman çerçevesi ile her bir bitkinin hieve infiltrasyonu. Örneğin için, bu şırınga-sızmak bir tüm 6-haftalık eski N. için yetenekli bir öğrenci 15 dakika sürer benthamiana bitki. Bunun aksine, çay da aynı bitki bitirmek için ve birden fazla bitkiler de aynı anda infiltre olabilir başlatma ve çalıştırma adlı işletmeye vakum tarafından yapılmış 3 dakika Ülke: otelinin sızmış edilebilir.

Şekil 1
Şekil 1,. N. 0 (Yok A) 'okuyun turba, pelet ve bir büyüme tepsiler ile birlikte benthamiana bitki büyüme.: Wild-tip bitkiler ile, 2 adet (B)', aralanda, tohumlandırın sonra, 4 (C) ve 6 (D) hafta idi.

Şekil 2,
Şekil 2. N. Şırınga infiltrasyonu benthamiana yapraklarıAgrobacterium tumefaciens ile. A. GV3101 süzün GFP-ifade MagnICON Vektörel Çizimler yataklık tumefaciens 'infiltrasyon tamponu içinde yeniden süspansiyon haline getirildi ve ona bir iğne olmadan bir şırınga içine loaded edildi. Bir nick bir 6-hafta eski bitki yaprak (A) arkasında tarafında bir iğne ile oluşturuldu. , Şırınga bölgesinin açılması, nick değiştirememelerinden (B) ve infiltrasyon tampon içinde Agrobacteria'nın nick değiştirememelerinden (° C) cihaz aracılığıyla yaprak bölgesinin interselüler boşluklarda içine enjekte edildi karşı bir konuma sahip edildi.

Şekil 3,
Şekil 3,. N. Vakum infiltrasyonu benthamiana Agrobacterium tumefaciens ile bırakır. A. ve Strain GV3101 hedef protein-eksprese eden Vektörel Çizimler ihtiva eden tumefaciens 'infiltrasyonu otelinin yeniden süspansiyon haline getirildi edildin tampon ve bir 3 L küvet sunulmak üzere yükle. Küvet alan kalıp da daha sonra, bir vakum pompası (A) 'önce bağlanmış olan bir vakum kurutma cihazı içine yerleştirildi. A 6-hafta eski bitki desikatöre plaka (B) üzerine baş aşağı yerleştirildi. , Plaka en haznesi (° C) üstüne yerleştirilmiş konusu olduğu gibi tüm yaprağı ve kök sistem daha sonra, su havuzu içine sular altında kaldı. Agroinfiltration 1 dk için iki kez 100 mbar de bir vakum uygulayarak ve serbest tarafından sağlandı. daha büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 4,
Şekil 4. Şırınga içinde GFP İfade yaprakları agroinfiltrated. Tüm N. benthamiana yaprakları A. suşu GV3101 ile infiltre edildi , bir geminiviral (A ve C) ya da MagnICON vect otelinin GFP geninin yataklık tumefaciens 'ya da (D) gösterilir. Negatif kontrol yaprakları bu GFP geni (B) içermeyen Agrobacterium suşları ile infiltre edildi. Yapraklar 4 dpi (AC) veya 7 dpi (D) de beyaz ışık (A) veya UV ışığı (BD) altında fotoğrafları çekildi.

Şekil 5,
Şekil 5,. GFP İfade ve şırınga içinde DsRed nokta-agroinfiltrated yaprakları. N. benthamiana yaprakları GV3101 DsRed GFP,, ya da geminiviral vektörler içinde GFP ve DsRed genleri her iki barındıran ile nokta-infiltre idi. Bir negatif kontrol nokta pREP110 + p19 ile infiltre edildi. Yapraklar 4 dpi az UV ışık altında fotoğrafları çekildi.

Şekil 6,
6 Şekil. Vakum agroinfil bölgesindeki, GFP bölgesinin İfadetrated yaprakları. N. benthamiana yaprakları GV3101 MagnICON vektörler en GFP gen barındıran ile infiltre edildi. Yapraklar 7 dpi az UV ışık altında fotoğrafları çekildi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protein bazlı ilaç için artan talepleri tüm dünyada sağlam, ölçeklenebilir, düşük maliyetli ve güvenli yeni üretim platformları gerektirir. Bitkiler ilaç protein üretimi için en umut verici alternatif üretim sistemlerinden biri olarak göstermiştir. Son yıllarda, yıkılıp virüs esaslı vektörler geliştirilmesine büyük ölçüde hız ve bitki ekspresyon sistemleri 2,10 verimi artırır bitkilerdeki protein, geçici ifade sağladı. Daha da geçici ifade sisteminin programı optimize etmek için, biz bitki doku içine hedef-gen içeren Agrobacterium tanıtmak için basit ama etkili ve ölçeklenebilir bir yaklaşım göstermektedir. Sonuçlarımız, bitkinin yaprakları ve iki floresan proteinleri, GFP ve DsRed sağlam üretime Agrobacterium etkin giriş sonuçlandı şırınga ya da vakum ile ya da bu agroinfiltration göstermektedir.

Efficie sağlamaknt agroinfiltration ve Protein üretimi için, aşağıdaki kritik parametrelerin dikkatle kontrol edilmelidir. Bu parametreler sapmalar düşük agroinfiltration verimlilik ve dönüş, düşük hedef protein ekspresyonu neden olabilir.

1. Bitki gelişim aşamasında ve sağlık. Laboratuarlar arasında bu yöntem, en olası değişken infiltrasyon için bitki malzemedir. Bitkiler fenotipik benzer görünse de, onların gelişim aşamasında ve fizyolojik durumu önemli ölçüde rekombinant proteinleri ifade kendi yetkinlik etkiler. Bitki büyüme ve protein ekspresyon düzeyleri üzerine etkileri belirli parametreler sıcaklık, nem, ışık şiddeti, gübre temini, bitki aşılama yaş ve yaprak sızma sonra hedef protein en fazla birikimi için gerekli zaman içerir. Bitkiler sürekli olarak günlük su ve gübre eşit miktarda almalıdır. Bitki büyüme koşullarında küçük değişiklikler büyük ölçüde nihai Siz değişebilirbitki ve rekombinant protein ifade etme yeteneği arasında örn. Daha önceki çalışmalarda doğal ışık altında yetiştirilen bitkiler daha fazla yaprak biyokütle vermiştir olduğunu gösterir, ancak protein verimi yapay ışık 4 altında yetiştirilen bu çok daha azdır. Bu nedenle, yapay ışık ile bitki büyümesi için tercih edilen bir yöntemdir. Sonuçlarımız da gösteriyor ki 25 bir 16 saat ışık / 8 saat karanlık döngüsü ± 0.5 ° C N. büyümeye en uygun durumdur Bu yapay aydınlatma 4 altında benthamiana bitkiler. Biz biyokütle verimi yeterli olduğu halde floresan proteinleri yüksek seviyelerde üreten genel olarak bu koşullar altında 6 haftalık bitkiler GFP ve DsRed ekspresyon için uygun yaş olduğunu da göstermiştir. 6-hafta daha yaşlı bitkiler fazla biyokütle üretmek ancak sızma odasına 4 sığmayacak kadar uzun. Buna ek olarak, çiçekler olumsuz rekombinant protein ekspresyonu 4 etkileyen, büyüme 6 hafta sonra gelişmeye başlar. Sonuç olarak, 6 haftalık bitkiler optimal L içerenbiyokütle verimi, protein birikimi ve agroinfiltration kolaylığı kombine ihtiyacı dengeler EAF materyal.

2. Büyüme ve Agrobacterium infiltrasyonu konsantrasyonu. Bu yöntem bir diğer önemli nokta büyüme ve A. sızma konsantrasyon kontrol edilmesidir gibi OD 600 ile ölçülen tumefaciens. A. Her bir kültür ve alt adımda, suş tumefaciens için yetiştirilmesi gerekir, ancak belirlenen OD 600 üzerinde. Biz A. birden fazla konsantrasyonları inceledik değil N. son infiltrasyon için tumefaciens'in benthamiana 4 bırakır. Düşük Agrobacterium konsantrasyonu düşük protein ekspresyonunu, bitkiler içine hedef genlerin yeterli teslimat neden olur. Agrobacterium infiltrasyonu konsantrasyonu çok yüksek ise, diğer taraftan, bu infiltre dokusunda aşırı duyarlı bir yanıtı tetikler ve nekroz 20 yol açar. Bizim ronu ç lar OD 600 = 0.12 Agrobacterium doku nekrozuna ve hücre ölümüne neden olmadan gen yapısı, en fazla teslimat için ihtiyaç dengeler olduğunu göstermiştir. Agrobacterium istenen OD 600 yoğunluğu dengeli kültür ortamı, sıcaklık ve kültür süresi ile elde edilebilir.

3. Vakum infiltrasyon için, belirlenen vakum basıncı ve sızma süresi takip etmek önemlidir. Sonuçlarımız, Agrobacterium infiltrasyonu karışımının bir 3 L su havuzu yaklaşık 30 bitki sızmak için kullanılabileceğini göstermektedir. 30'dan fazla bitki infiltre gerekiyorsa, Agrobacterium infiltrasyon karışımı yeni bir parti temin edilmesi gerekmektedir.

4. Bu çalışmada sunulan özel parametreler N. kullanarak proteinlerin ifade için optimize edilmiştir Belirli koşullar altında yetiştirilen benthamiana bitkiler yıkılıp virüs esaslı vektörler, yukarıda tarif edildiği. Daha önce tartışıldığı üzere, TBu yöntemdeki kontrol etmek için de en zor parametre bitki malzemedir. Bitki ve burada tarif edilen ve her durumda 4,8,14,18,21-23 mükemmel sonuçlar elde infiltrasyon işlemi kullanılarak aşılar ve terapötik proteinler çeşitli ifade etmişlerdir. Bu sonuçlar, geliştirdik koşulları protein ifadesi için uygun olduğunu gösterdi. Ancak, farklı ev sahibi bitki türlerinin, ifade vektörleri, ya da farklı N Benthamiana büyüme koşulları infiltrasyon için kullanıldı, bu yöntem her parametre deneyleri ile yeniden optimize edilmesi gerekir.

Genel olarak, şırınga ve vakum ile agroinfiltration rekombinant proteinlerin geçici ifade için bitki Agrobacterium taşıyan hedef geni takdim etmek için basit ama etkili bir yöntem olduğunu göstermiştir. Her iki yöntem de araştırma ve üretim amacına bağlı olarak kendilerine özgü avantajları var. Şırınga sızma, gerektirmeyen basites Agrobacterium kültür ve sadece küçük miktarlarda pahalı pompa ve vakum odaları gerek yoktur. Bu raporda gösterildiği gibi, bu bir hedef gen ile bütün yaprak sızmak ya da bir yaprak üzerinde birden fazla hedef genleri tanıtmak nokta sızma kullanmak ya da esnekliğe sahiptir. Bütün yaprak infiltrasyonu yöntem, biyokimyasal karakterizasyonu, saflaştırma ve klinik öncesi fonksiyonel çalışmalar için 1 yeniden birleştirici proteinin küçük laboratuar ölçekli ifadesi için kullanılabilir. Bunun tersine, nokta infiltrasyonu bitkiler kendi verim, ifade kinetikleri ve toksisite Karşılaştırma bir yaprak üzerinde birden fazla protein hedeflerini ifade etmek için kullanılabilir. Aynı zamanda, GFP gibi bir raportör protein ifadesi karşılaştırmak için kullanılan ya da aynı yaprak üzerindeki farklı bir ifade vektörleri ile tahrik DsRed edilebilir. Sonuç olarak, protein birikimi ve bunların ifade kinetikleri sürüş farklı vektör yeteneğini karakterize edilebilir. Şırınga sızma sadeliği de bir sağlaruygun aracı lise ve biyoteknoloji ve genetik mühendisliği konusunda lisans öğrencilerinin ve yetiştirmek.

Şırınga infiltrasyonu ile karşılaştırıldığında, vakum infiltrasyonu vakum pompaları ve odaları ve Agrobacterium kültürlerin büyük hacimli yatırım gerektirir. Sadece birkaç bitki sızmış gerektiğinde Bu nedenle, tercih edilen bir yöntem değildir. Ancak, şırınga infiltrasyonu ile uyumlu olamaz ölçeklenebilirlik sağlar. Daha sağlam ve kısa bir süre içinde bitkilerin çok sayıda sızmak olabilir. Bu raporda sunulan ölçek ile, bir Faz I insan klinik deneme 4 için yeterli ilaç protein saflaştırılmış gram düzeyde üretebiliriz. Ayrıca, bu süreç bitkilerden ilaç proteinlerin ticari üretimi için daha ölçekli kadar olabilir. Örneğin, süreçler N. üç ton sızmak vakum dizayn edilmektedir saatte benthamiana bitkilerBir ölçek büyütme operasyonu 24. Vakum infiltrasyon bir diğer avantajı da şırınga infiltrasyon için uygun değildir bitki türleri agroinfiltrate için kullanılabilir olmasıdır.

Özet olarak, şırınga ve vakum infiltrasyon kombinasyonu araştırmacılar, biyoteknoloji ve eğitimcilerin bitkilerde rekombinant proteinlerin geçici ekspresyonu için basit, etkili ve sağlam ve ölçeklenebilir bir yöntem sağlar. Büyük ölçüde ilaç proteinlerin geliştirme ve üretim kolaylaştırmak ve fen eğitimi teşvik edecektir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar herhangi bir mali çıkarlarının rakip var.

Acknowledgments

Biz R. Güneş ve katkılarından dolayı Chen'in Laboratuvarı diğer öğrencilere malzeme üretimi bitki teşekkür ederim. Ayrıca Teknoloji ve Yenilik (CTI) ve College lisans araştırma verdiği destek için Dr D. Yeşil teşekkür ederim. Bu araştırma S. Chen NIH hibe U01 AI075549 ve 1R21AI101329 ve S. Chen için Arizona Devlet Üniversitesi CTI bir SSE hibe ile kısmen desteklenmiştir. K. Leuzinger, M. Dent, J. Hurtado, ve J. Stahnke SSE hibe ile desteklenen lisans öğrencileridir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
GFP Invitrogen V353-20 www.invitrogen.com See reference: Lico and Chen, et al 2008
DsRed Clontech 632152 www.clontech.com See reference: Baird and Zacharias, et al 2000
MagnICON Vector Icon Genetics n/a www.icongenetics.com See reference: giritch and Marillonnet, et al 2006
Geminiviral Vector Author’s Lab n/a See reference: Chen and He, et al 2011
N. benthamiana Author’s Lab n/a herbalistics.com.au
Agrobacterium tumefaciens strain gv3101 Author’s Lab n/a See reference: Lai and Chen 2012
LB Agar Carbenicillin-100, plates Sigma L0418 www.sigmaaldrich.com
LB Agar Kanamycin-50, plates Sigma L0543 www.sigmaaldrich.com
Magnesium sulfate hepa hydrate Sigma M2773-500 g www.sigmaaldrich.com
Bacto-Tryptone Fisher 73049-73-7 www.fishersci.com
Bacto Yeast Extract Becton, Dickinson CO. REF 212750 www.bd.com
Difco Nutrient Broth Becton, Dickinson CO. REF 234000 www.bd.com
MES hydrate Buffer Sigma M8250-1kg www.sigmaaldrich.com
Carbenicillin Sigma C1613-1ML www.sigmaaldrich.com
Kanamycin Sigma 70560-51-9 www.sigmaaldrich.com
Sodium Hydroxide Sigma 221465 www.sigmaaldrich.com
Jack’s Fertilizer Hummert International Jul-25 www.hummert.com
Equipment
Vacuubrand MD4 Vacuum Pump Fisher 13-878-113 www.fishersci.com
Vacuum Air Regulator Valve Fisher NC9386590 www.fishersci.com
Desiccator 12 1/8" with O ring Fisher 08-594-15C www.fishersci.com
3 L Tub Rubber-Maid n/a Rubbermaid Servn’ Saver Bowl, 10-cup will work
plate/shelf 230ML Fisher NC9489269 www.fishersci.com
Peat Pellet Hummert International 14-2370-1 www.hummert.com
Propagation Tray Dome hydrofarm 132052 www.hydroponics.net
Propagaiton Tray hydrofarm 138758 www.hydroponics.net
Virbo Hand Seeder Gro-Mor INC n/a www.gro-morent.com
Flora Cart 4 shelf Hummert International 65-6924-1 www.hummert.com
15 ml Round Bottom Culture Tubes Sigma CLS430172-500EA http://www.sigmaaldrich.com
Spectrophotometer Bio-Rad 170-2525 www.bio-rad.com
Spectrophotometer Cuvettes Bio-Rad 223-9950 www.bio-rad.com
Microcentrifuge Tubes USA Scientific 1415-2500 www.usascientific.com
Benchtop Centrifuge Bio-Rad 166-0602EDU www.bio-rad.com
Incubator/Shaker Eppendorf Excella E25 www.eppendorf.com
Ultraviolet Light Model#: UVGL-25 UVP 95-0021-12 www.uvp.com

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chen, Q. Transgenic Horticultural Crops: Challenges and Opportunities - Essays by Experts. Mou, B., Scorza, R. , Taylor & Francis. 86-126 (2011).
  2. Chen, Q., Lai, H. Plant-derived virus-like particles as vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9, 26-49 (2013).
  3. Landry, N., et al. Preclinical and clinical development of plant-made virus-like particle vaccine against avian H5N1 influenza. PLoS One. 5, e15559 (2010).
  4. Lai, H., Chen, Q. Bioprocessing of plant-derived virus-like particles of Norwalk virus capsid protein under current Good Manufacture Practice regulations. Plant Cell Reports. 31, 573-584 (2012).
  5. Chen, Q. Expression and Purification of Pharmaceutical Proteins in Plants. Biological Engineering. 1, 291-321 (2008).
  6. Chen, Q. Turning a new leaf. European Biopharm. Rev. 2, 64-68 (2011).
  7. Chen, Q., et al. New Generation Vaccines. Levine, M. M. , Informa Healthcare USA, Inc. 306-315 (2009).
  8. Lai, H., et al. Monoclonal antibody produced in plants efficiently treats West Nile virus infection in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 2419-2424 (2010).
  9. Buswell, S., Medina-Bolivar, F., Chen, Q., Van Cott, K., Zhang, C. Expression of porcine prorelaxin in transgenic tobacco. Annals of the New York Academy of Sciences. 1041, 77-81 (2005).
  10. Lico, C., Chen, Q., Santi, L. Viral vectors for production of recombinant proteins in plants. J. Cell. Physiol. 216, 366-377 (2008).
  11. Chen, Q., He, J., Phoolcharoen, W., Mason, H. S. Geminiviral vectors based on bean yellow dwarf virus for production of vaccine antigens and monoclonal antibodies in plants. Hum. Vaccin. 7, 331-338 (2011).
  12. Tsien, R. Y. The Green Fluorescent Protein. Annual Review of Biochemistry. 67, 509-544 (1998).
  13. Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97, 11984-11989 (2000).
  14. Lai, H., He, J., Engle, M., Diamond, M. S., Chen, Q. Robust production of virus-like particles and monoclonal antibodies with geminiviral replicon vectors in lettuce. Plant Biotechnology Journal. 10, 95-104 (2012).
  15. Giritch, A., et al. Rapid high-yield expression of full-size IgG antibodies in plants coinfected with noncompeting viral vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 14701-14706 (2006).
  16. Huang, Z., Chen, Q., Hjelm, B., Arntzen, C., Mason, H. A DNA replicon system for rapid high-level production of virus-like particles in plants. Biotechnol. Bioeng. 103, 706-714 (2009).
  17. Santi, L., et al. An efficient plant viral expression system generating orally immunogenic Norwalk virus-like particles. Vaccine. 26, 1846-1854 (2008).
  18. He, J., Lai, H., Brock, C., Chen, Q. A Novel System for Rapid and Cost-Effective Production of Detection and Diagnostic Reagents of West Nile Virus in Plants. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 1-10 (2012).
  19. Huang, Z., et al. High-level rapid production of full-size monoclonal antibodies in plants by a single-vector DNA replicon system. Biotechnol. Bioeng. 106, 9-17 (2010).
  20. Kuta, D., Tripathi, L. Agrobacterium-induced hypersensitive necrotic reaction in plant cells: a resistance response against Agrobacterium-mediated DNA transfer. African Journal of Biotechnology. 4, 752-757 (2005).
  21. Phoolcharoen, W., et al. Expression of an immunogenic Ebola immune complex in Nicotiana benthamiana. Plant Biotechnology Journal. 9, 807-816 (2011).
  22. Phoolcharoen, W., et al. A nonreplicating subunit vaccine protects mice against lethal Ebola virus challenge. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 20695-20700 (2011).
  23. Herbst-Kralovetz, M., Mason, H. S., Chen, Q. Norwalk virus-like particles as vaccines. Expert Rev. Vaccines. 9, 299-307 (2010).
  24. Chen, Q., et al. Agroinfiltration as an effective and scalable strategy of gene delivery for production of pharmaceutical proteins. Adv. Tech. Biol. Med. 1, 103 (2013).

Tags

Bitki Biyoloji Sayı 77 Genetik Moleküler Biyoloji Hücresel Biyoloji Viroloji Biyomühendislik Bitki Monoklonal Virüsler Antikorlar, Yeşil Floresan Proteinler Bitki Proteinler Rekombinant Proteinler Aşılar Sentetik Virüs-gibi Parçacık Gen Transferi Teknikleri Gen Ekspresyonu Agroinfiltration bitki infiltrasyon bitki yapımı ilaç şırınga agroinfiltration vakum agroinfiltration monoklonal antikor, GFP DsRed geminiviral vektörler görüntüleme bitki modeli
Rekombinant Proteinlerin Yüksek-düzey Geçici İfade için Bitkiler Verimli Agroinfiltration
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Leuzinger, K., Dent, M., Hurtado,More

Leuzinger, K., Dent, M., Hurtado, J., Stahnke, J., Lai, H., Zhou, X., Chen, Q. Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins. J. Vis. Exp. (77), e50521, doi:10.3791/50521 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter