Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Published: July 17, 2013 doi: 10.3791/50522
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 4, 2, 2
1Department of Orthopaedic Surgery and Traumatology, Ghent University Hospital, 2Department of Radiation Oncology and Experimental Cancer Research, Ghent University, 3Department of Virology, Parasitology, and Immunology, Ghent University, 4Pathlicon

Summary

Abstract

Sarkoma tüm yeni tedavilerin geliştirilmesi engel, doğada heterojen bir çok nadir görülen bir hastalıktır. Sarkom hasta bu hastalık için bir tekrarlanabilir ve düşük maliyetli kısenotransplant modeli gelişmekte olan cari faiz açıklayan, tabakalaşma sonra kişiselleştirilmiş tıp için ideal adaylardır. Civciv chorioallantoic membran türe özgü kısıtlama olmaksızın aşılı doku ve hücrelerin sürdürülmesi yeteneğine sahip doğal bir bağışıklık sistemi zayıf ev sahipliği yapmaktadır. Buna ek olarak, kolayca, erişilebilir manipüle ve optik ve floresan stereomikroskobi kullanarak görüntülü. Histoloji daha heterotipik hücresel etkileşimlerin detaylı analiz sağlar.

Bu protokol, detaylı şekilde açıklanmaktadır taze sarkomu türevli tümör dokuları, bunların tek hücre süspansiyonları, ve kalıcı ve geçici floresan etiketli Kurulan sarkoma hücre çizgileri (Saos-2 ve SW1353) ile korioallantoik membran aşılama ovo. Civciv hayatta kalma sıçanes% 75 kadar vardır. Modeli greft-(canlılığı, Ki67 proliferasyon indeksi, nekroz, infiltrasyon) ve ev sahibi (fibroblast infiltrasyonu, vasküler yapıdaki) davranışlarını incelemek için kullanılır. Tek hücre süspansiyonları aşılama lokalize için, ECM jel etkisiz altına malzemelere göre önemli avantajlar sağlamaktadır. Ki67 proliferasyon CAM yüzeyinden hücre mesafe ve CAM, terapötik ürünlerin eklenmesi için bir zaman dilimi belirlenmesi ikincisi uygulama süresi ile ilgilidir.

Introduction

Sarkomu tedavisi direnci 1,2 nedeniyle yüksek mortalite ile bağ dokularının bir nadir bir tümördür. Hasta hayatta ilerleme, düşük yıllık insidansı, onların geniş çeşitlilik ve sarkom hücreleri in vitro 3,4 kültür zor olduğu bildirilmektedir gerçeği ile engellenmektedir.

Klinik öncesi tedavi değerlendirmesi için kültür hücrelerinin kullanılması in vitro yeni, görünüşte aktif molekülleri her zaman klinik ortamda sonuçları yansıtmamaktadır ortaya koymuştur. Ayrıca, gen ifadesi diziler ortaya genom sapmaları her zaman 5-7 hasta tümör davranış özellikleri ile ilişkili değildir. Bu sorunları denemek ve çözmek için, kişiye özel tıp ksenogreft modelleri 8-12 için artan arama yansıtılır önem, kazanmıştır.

In vivo deney, bir C arasındaki karmaşık etkileşimi yansıtan avantajına sahiptirkanser proliferasyonu ve invazyonu 13 için gerekli ancer hücreleri ve solid tümörlerde konak doku ortamında,. Şu anda sarkomu 14,15 için bir tekrarlanabilir xenograft model olarak Chorio-alantoik Membran testi (CAM-testi) kullanımını incelemek. Bu deney, yaygın tümör anjiyojenezi 16,17 çalışma için kullanılmıştır. Diğer çalışmalarda farklı protokoller 18,19 göre büyüme ya da anjiyogenez belirgin bir fark gözlenmiştir ise literatürde, ancak biz, bu tahlil için farklı protokoller bulduk.

Bu yazıda tümör greft, tümör kaynaklı tek hücre süspansiyonları ve köklü sarkomu hücre kültürleri kullanarak hücre davranışı üzerindeki CAM-testinin koşulları değişen etkisini araştırmak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Genel bir bakış için Şekil 1'e bakınız

Tümör malzeme

1. Tümör Örnekleri elde ve hazırlanması

Hasta malzeme kullanımı için, Etik Kurul onayı gereklidir ve aydınlatılmış onam hasta elde edilecek vardır.

  1. Müdahale sırasında hasat temsilcisi malzeme (en az 1 cm 3), biyopsi veya sarkom bir rezeksiyon ya. Biyopsi uygun sitesi dinamik kontrastlı MR kullanılarak tanımlanır.
  2. DMEM 1,000 ünite penisilin ve 1 mg / ml streptomisin ile takviye içeren steril bir cam şişe içinde hemen malzeme yerleştirin.
  3. Laboratuara - hemen flakon (90 dakika 30) taşıyın.

Tüm aşağıdaki işlemleri laminer akış altında yapılmaktadır.

  1. Steril bir Petri kabı içine flakon içeriğini dökün.
  2. Maksimum 1 m küçük parçalar halinde tümör örnek koymakm 3 steril bir neşter kullanılarak. Bu doku daha fazla işlem zarar eğilimi gibi tüm kalsifiye parçaları çıkarın.
  3. Rasgele CAM uygulama için 10 tümör greft almak.

2. Tümör türetilmiş tek hücre süspansiyonlarının hazırlanması

Yaklaşık süresi: 3 saat

  1. Numunenin geri kalan doku tartılır.
  2. 2 - dissociator bir tüp içinde doku, 4 g, birden fazla boru, kalan tüm tümör dokusu sindirimi için gerekli olabilir.
  3. 2 sindirimi için, - doku, 4 g, 2.5 ml kollajenaz 2 çözeltisi (500 U / ml RPMI 1640) içinde ve 2.5 ml DNase çözeltisi (22 KU / ml RPMI 1640) ekleyin.
  4. Dissociator h_tumor protokolüne göre doku işlem. Tüp 30 dakika hafifçe sarsıldı ise bu 37 inkübasyon 2 kür ° CO 2 inkübatör C içerir.
  5. 150 mikron hücre süzgecinden kalan süspansiyon filtre.
  6. 5 mi için 1000 rpm'de lizat santrifüjn.
  7. Süpernatantı.
  8. Normal süspansiyonu ile inkübasyon 10 dakika sağlayan, eritrosit lizis tamponu (Elb) 10 ml pelletini.

Not: eritrosit lizis tamponu ile aşağıda belirtildiği gibi imal edilmiştir: 0.037 g EDTA, 0.99 g K 2 HPO 4, 1000 ml su ile 8.29 g NH4CI ekleme, bir 0.22 mikron filtre basınç altında, 7.3 pH değerini ayarlamak için 10 N NaOH kullanmak filtre. 4 ° C'de saklayın

  1. , Reaksiyonu durdurmak için kültür ortamı (DMEM,% 10 fetal sığır serumu, 100 U / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin ile takviye edilmiş) 25 ml ilave edilir.
  2. 5 dakika boyunca 1000 rpm'de süspansiyon santrifüj. Pelet rengi hemen beyaz olmalıdır.
  3. Süpernatantı.
  4. Pelet orta 5 ml ilave edilir. 70 mikron hücre süzgecinden süspansiyon filtre.
  5. Otomatik bir hücre sayacı vasıtasıyla canlı hücre / ml sayısını.

3. Cancer Hücre Hatları

SAOS2 osteosarkom hücreleri (ATCC numarası: HTB-85) gelişmiş yeşil floresan proteini ifade üreticinin protokolüne uygun olarak Hücre Hattı Nucleofector Seti V kullanılarak pEGFP-C1 vektörü ile elektroporasyon işleminden geçirildi. Stabil hücre hatları oluşturmak için, transfekte edilmiş hücreler önceki oluşturulmuş protokol 20 paralel olarak 4 hafta boyunca G418 (1 mg / ml) içinde seçildi. Buna ek olarak ayırma, üreticinin talimatlarına göre, floresan aktive hücre sınıflandırma (FACS) ile gerçekleştirildi.

SW1353 kondrosarkom hücre hattı (ATCC numarası: HTB-94) alınan hücreler veya yeni hazırlanmış bir tümör tek hücre süspansiyonları, kırmızı bir floresan lipofilik membran lekesi kullanılarak etiketlenmiştir.

  1. Çözeltisi; Tripsin (% 0.5 ağırlık / hacim) etilendiamintetraasetik asit (% 0.2 ağırlık / hacim EDTA) kullanılarak klasik bir şekilde kültür şişelerinde hücreleri çıkarmak.
  2. 1000 rpm'de 5 dakika boyunca hücre süspansiyonu santrifüj edilir.
  3. Supern çıkarınatant.
  4. Serumsuz ortamda ve 5 ul DiI (Vybrant Kırmızı) / 10 6 hücre 1 ml ilave edilir.
  5. Alüminyum folyo ile şişe sarın ve 37 10 dakika ° C için CO 2 inkübatör koydu
  6. 1000 rpm'de 5 dakika boyunca tekrar santrifüje ve supernatant çıkarın.

Chorioallantoic membran tahlilinde

1. Yumurta Kuluçka

  1. Yumurta% 95 döllenme garanti altına alan bir yerel ticari kuluçkahane gelen döllenmiş yumurta gereklidir.
  2. Döllenmiş yumurta 10 gün oda sıcaklığında saklanabilir.

Not: kuluçka başlamadan önce, kir, tüy ve dışkı dikkatle yerine yumuşak bir yüzey yapısı daha kaba var kağıt havlu ile kuru silme ile mekanik olarak yumurta kabuğu kaldırılır. % 70 denatüre etanol ya da başka herhangi bir temizlik maddesi ile yumurta silme önemli piliç embriyoları hayatta kalma oranını azaltır.

  1. Incub içinde yumurta koymakBir tarafta ator, üst yüzey işaretleme. Yumurta inkübatör koymak edildiği gün embriyonik gelişim gün 0 belirlenmiştir.
  2. 37.8 ° C'de inkübasyon sıcaklığı, ve% 47 nem ayarlayın. Otomatik döndürme seçeneği kapalı olduğundan emin olun.

2. Yumurta Açılışı

Süre: 25 yumurta ± 60 dk

Geliştirme 3. günde, yumurta laminer hava akımı altında açılır. Membran kabuk sopa eğilimi, CAM zarar daha da gelişim aşamasında sonuçlara yumurta açılması. Bir kızılötesi lamba işlem sırasında yumurta sıcak tutmak için kullanılır. Kısırlık geliştirmek için, el eldiven kullanılmasını tavsiye ederiz.

  1. Yukarı bakacak şekilde belirgin yüzü, eggcup içinde yumurta yerleştirin.
  2. Yumurta ucunda takılı bir 18 G iğne ile albümin iki ml kaldırarak CAM seviyesini indirin. Iğne birkaç perfore sonra künt iseyumurta kabuğu, iğne değiştirin. Eğer değilse, çok fazla kuvvet yumurta sarısı veya kabuğun kırık hasar ile sonuçlanan, sarf edilmesi gerekir. Bazen iğne chalazae, ak en sarısı askıya 2 spiral gruplarından biri tarafından engellendi. Bu blok çözülene kadar yavaşça geri pistonu iterek çözülebilir. Yumurta sarısı şırınga içine çekilir, iğne gibi şırınga değiştirin. Bazen embriyo bu olaydan sonra ölür. Albümin miktarı yetersiz çıkarılırsa kabuk kaldırıldığında, CAM zarar görür.
  3. Pencere kesim sırasında CAM üzerine kabuk parçacıkları dökülmesini önlemek için, kabuk kısmının belirgin üst tarafında bir yarı-geçirgen bir yapışkan film uygulanır.
  4. Yumurta yüzeyinde küçük bir bız ile bir giriş deliği olun.
  5. Steril sivri uçlu cerrahi bir makas kullanarak, kabuk 1 cm 2 bir pencere kesin.
  6. Embriyonun titreşimli kalp ve bitişik damarları inci de görülebiliryumurta sarısı e yüzey. Olmayan döllenmiş yumurta veya ölü embriyolar kaldırmak. Kan damarlarının bir kesintiye yönü ölü embriyo karakterize etmektedir.
  7. Yarı geçirgen bir yapışkan film ile pencere mühür. Kabuk iğnenin sokulması esnasında çatlamaya sürece, ponksiyon karşılamak için gerekli değildir.

3. Aşılama Prosedürü

Süre: hücre hattı başına ± 1 saat

Civciv embriyonik gelişim günde 9, yumurta laminer hava akımı altında aşılanır.

CAM yayılan kanser hücresi değerlendirilmesi inokülasyon esnasında sınırlı bir yüzey için hücrelerin muhafaza gerektirir. Matrigel çok deneysel hücre kültürü koşullarında kullanılan Engelbreth-Holm-Swarm fare sarkom bir hücre dışı matris (ECM), jel. Bu, soğutuldu, bir akışkan, ancak 20 ila getirdiği zaman termal aktif polimerizasyon doyurmaya - 40 ° C, böylece sabit bir jel meydana getirir. SırasındaDeneylerde, Matrigel erime buz içeren bir kutu tutulur.

Not: delikli lamelleri kullanmamayı ısrar ediyorlar. Böylece zar kendisinde hücrelerinin büyümesini potansiyel eğimlendirme plastik disk üzerine bağlanma ve aşılı kanser hücrelerinin büyümesini görülmektedir.

  1. 10 6 cells/100 ul ECM jel konsantrasyonunda soğutulmuş ECM jel bir hücre pelletini. Erime buz üzerinde bu çözüm tutun.
  2. Laminer hava akımı altında steril cerrahi bir çift ile yarı geçirgen zar Tüketim parçası. Yapışkan film tamamen kaldırılır, bu kirlenme nedeniyle embriyonik ölüm daha büyük bir oran ile sonuçlanacaktır.
  3. Epitel hücre tabakası kaldırmak için, steril bir cam çubuk ile hafifçe kabuk penceresinin altındaki CAM doğru dokunun. Steril bir cam çubuk ile CAM dokunmak bir neşter n ° 11, daha beceriklilik ve deneyim gerektirir kullanarak daha az travmatik olduğunu kanıtlamaktadır. Küçük kanamalar oluşabilir.
  4. Birtümör malzeme dding.
  5. Tümör greftler için: bu sıkmadan steril forseps bir çift ile CAM üzerine doku hafifçe düşük tek parça,.
  6. ECM jel işlem için: ECM jel uygulamalar arasında polimerize etmek için, birbirleriyle üstüne, CAM için hücre-ECM jel süspansiyonu 4x 25 ul ekle. Bu şekilde, kanser hücrelerini içeren bir yapışkan plak oluşturulur.
  7. Yarı geçirgen bir yapışkan film ile tekrar kabuk penceresini kapatın.

4. Görüntüleme ve CAM Hasat

Süre: 25 yumurta 2 saat

Civciv embriyonik gelişim günde 16, CAM'lar hasat edilir. Laminer hava akımı altında çalışan gerekli değildir.

  1. Cerrahi bir makas ile pencere büyütmek. Yaralı gemilerin kanama ile sonuçlanan, aksi CAM hasar görür, çok düşük kesmek için emin olun.
  2. Ekle 300 - PBS D 500 ul CAM mezhep üzerine bir pipet ileinoküle malzeme içeren iyon. Herhangi bir flüoresan prob kullanıldığında, bu, membranın sertleştirir olarak, tamponlu formaldehid zarın kesimi kolaylaştıracak, kullanılabilir.
  3. GFP veya DSR filtre ve hiçbir filtre her ikisini de kullanarak bir dijital renkli kamera ile donatılmış bir stereo floresan mikroskop,, ile yumurta CAM bir fotoğrafı olun. Tümör greftler, tüm fotoğrafları filtreleri olmadan yapılır. LED ışıklarla yukarıdan aydınlatma güçlü (Şekil 2) fotoğraf sırasında önerilir.
  4. Etiketli hücreler için kayıt tümör hücre migrasyonu. Tümörlerin sınırları düzensiz ve yıpranmış olabilir. Dağınık hücreler tümör sınırları yakınında mevcut olabilir. Bazı örneklerde, tümör hücrelerinin satır (Şekil 3) gözlenebilir.
  5. Kabuk karşı yalan sınırda steril bir makas ile membran kesin.
  6. PBS D dolu ya da için tamponlu steril bir Petri kabındaki hasat CAM yerleştirinmaldehyde.
  7. Üst yan ve ve filtre olmadan hem CAM alt tarafında, hem de bir fotoğrafı olun.
  8. En az 72 saat boyunca tamponlu formaldehid ile etiketli bir kap içinde membran koyun.
  9. Parafin CAM'lar Embed ve histolojik inceleme için onları hazırlamak. Kesim yüzeyi kasetin alt paralel olmasına dikkat ederek, nodül merkezinde tümör greft kesmek için dikkat edin. Değilse, CAM ve tümör greft arasındaki etkileşimi görünmeyecektir. Aynı strateji ECM jel plaklar için geçerlidir: kesme bıçağı bakan yüzey plak dik olmalıdır.

5. Histolojik Değerlendirme

Gerekirse Hematoksilen-Eozin boyama ve Ki-67 immünhistokimya, daha fazla açıklama için yapıldı. İmmünohistokimya göre otomatik bir slayt yapıcısı kullanılarak, kalınlığı 3.5 mikron arasında, formalinle sabitlenmiş parafine gömülü doku bölümleri üzerinde gerçekleştirilmiştirüreticinin talimatlarına. Ki-67 (klon MIB-1, seyreltme 1/100) bir primer fare monoklonal antikor kullanılmıştır. Isı kaynaklı epitop alma Hücre Klima 1 kullanılarak yapıldı ve görselleştirme Evrensel DAB Algılama Kiti ile sağlandı, üreticinin talimatlarına göre. Doku bölümlerinin Dehidratasyon otomatik bir coverslipper kullanılarak gerçekleştirilmiştir.

SAOS2 ve SW1353 hücre hatları için, Ki67 pozitif ve Ki67-negatif hücre nuclei/100 mikron 2 sayısının üç bölgelerde sayıldı: bir yakın CAM sınırına, birinin merkezinde yüzey ve bir yakın ECM jel plak. Bu işlem her Ki-67 lekeli slayt için 6x tekrarlandı. Çoğalma endeksi sayılan toplam hücre sayısına göre Ki67-pozitif hücrelerin sayısına bölünmesi ile her bir slayt için belirlenmiştir.

Nekroz fadi eşliğinde hücre çekirdeğinde kromatin ince dağılım kaybı, ile tanımlanırfarklı hücre marjlarının ng. Xenografts için, nekroz tam, (genellikle yüzeyde) kısmi veya eksik olarak puanlanır. CAM içine tümör hücrelerinin Sızma CAM mezoderm içinde tümör hücrelerinin gözlem ile tanımlanır ve mevcut veya yok olarak puanlanır.

Üç öğe ana davranış puanlanır. Fibroblast infiltrasyonu uzun hücreleri CAM bırakarak ve tümör greft / plak işgalci olarak tanımlanır ve mevcut veya yok olarak puanlanır. Damar büyümesi çekirdekli civciv eritrositlerin varlığı ile karakterize civciv gemilerin, çoğalan gelişmesini olarak görülebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

CAM değerlendirilmesi

Tümör greft CAM (Şekil 2A) yapışık olur. Hasta malzemeden tek hücre süspansiyonları sık sık kuru, hafif kabarık plak (Şekil 2D) görüntüler. CAM eksizyonu sonra, membran kırışıklıklar (2E ve 2F Şekiller) oluşur oldu.

Ticari bir hücre hattı için plak hücre çoğalması gösteren, zaman içinde daha opak hale gelir. ECM jel farklı hücre hatları CAM üzerinde belirgin bir büyüme paterni vardır. GFP sinyali güçlüyken SAOS2 canlı hücreler gösteren, aşılamadan 7 gün sonra ikinci yüzeyinin belirgin bir artış ile birlikte, bir yayma plak oluşturur. SAOS2 hücrelerin göç CAM gemilere görsel paralel (Şekil 3) olabilir. Herhangi bir filtre kullanıldığında stereomikroskop bakıldığı zaman, kan damarları görülebilir. Zaman hiçbir f tümör hücrelerinin ayırt edilemezilter kullanılır. Bu, bir GFP filtresi takıldığında kan damarları görselleştirmek için mümkün değildir. Kapalı filtre ve açılması ile, göç eden hücrelerin ve kan damarları arasında yakın temas görülebilir. Noktasal kanama plak (Şekil 4, ile görülebilir satır 1 ve 2). SW1353 hücreleri içeren plak yüzeyi bir düşüş gösterir ve (Şekil 4, satır 5 ve 6) hasat sonrası bir kırışık membran ile sonuçlanan, CAM sözleşme eğilimindedir. Floresan prob birçok hücre bölünmeleri sonra seyreltilmiş olur gibi DSR sinyali azalır. Gün 7, kanama sık görülmektedir. Kanama oluşursa, DSR sinyali de azalır.

Vasküler reaksiyon greft veya plak (Şekil 2) çevresindeki kıvrımlı damarlarda gösteren, alt bakışta CAM eksizyon sonra görüntülenebilir. CAM damar reaksiyonu tumorgraft grubu, tek bir hücre süspansiyonu grubu (<görülmektedirGüçlü> Şekil 2C ve 2F) ile ECM jel kontrol grubuyla (Şekil 2G), ama hücre çözeltisi kontrol gruplarında (Şekil 2H). Yeni kıvrımlı damarlarda dallanma (Şekil 2I, ok başları) ve Anastomoz (Şekil 2I, örnek giren görülebilir aynı zamanda kanama küçük alanlar (Şekil 2I, oklar) ortaya çıkar; birbirleriyle yıldızlar). Tümör neovaskülarizasyonu tümör / tümör plak farklı bölgelerde H & E ile slaytlar üzerinde ölçülebilir.

Histolojik kanıtı SAOS2 hücreleri artan kalınlığı ve plak çapının neden ECM jel tam hacmi boyunca, tek bir hücre görünümünü korumak olduğunu göstermektedir. Onlar böylece bir açıklık fermuar gibi endodermal ve CAM ektodermal katmanların arasındaki mesafe (Şekil 5A büyütme, CAM mezodermal tabaka (Şekil 5A, ok) işgal (Şekil 5B, ok), kümelenmiş. Hücre ve hücre kümelerinin sayısı zaman içinde istikrarlı bir artış, ve özellikle plağın yüzeyinde 7. gününden non-proliferatif hücrelerin sayısı artar. SW1353 için, CAM daralma da SAOS2 en H & E slaytlar göre H & E slaytlar üzerinde takdir edilebilir.

Büyüme kendi ektopik sitesi rağmen, biz temel özellikleri ve orijinal sarkomu tümörlerin immünohistokimyasal özellikleri CAM muhafaza olduğunu bulundu. Tümör greft güvenilirlik ve robu gösteren, CAM konak doku sızmış greft gelen civciv fibroblast ve tümör hücreleri tarafından sızmış olur çekirdekli civciv eritrositlerin görünümünü, kanıtladığı Buna ek olarak tümör greft revaskülarize halineCAM testinin stness (Şekil 6, ilave sol alt). Daha detaylı bilgi için biz Sys ve arkadaşları bakın. 14.

Hasat zamanı

Ki67 pozitif ve Ki67-negatif hücrelerin hücre sayımı hücre hatları her ikisi için de gün 4 hücreleri sayısı sürekli bir artış göstermektedir. Bu gün sonra hücrelerin toplam sayısı sabit kalır. Aşılamadan yedi gün sonra, Ki67-pozitif hücreleri ve hücrelerin toplam sayısını azalmaya başlar. Hücre sayısı ile ilgili olarak, üç bölge arasında anlamlı bir ilişki vardır. Bununla birlikte, Ki67 pozitif yakın CAM hücreleri, ve plağın yüzeyinde Ki67-negatif hücrelerin daha büyük bir oranda daha büyük bir oranda (Şekil 4, satır 3, 4, 7 ve 8) görülmektedir.

Proliferasyon indeksi yedi gün aşılama sonrasına kadar nispeten sabit kalır, o da azalmaya başlar geçtiği bildirilmiştir. ProliferatioSW1353 hücre hattı K göstergesi önemli ölçüde daha düşüktür (p <0.05) SAOS2 hücre hattı ile karşılaştırıldığında.

Üç bölge arasında anlamlı bir ilişki olmasına rağmen biz yakın CAM Ki67-pozitif hücrelerin daha büyük bir oran ve Ki67-negatif daha büyük bir oranı gözlemlemek gibi, bu, ECM jel plak her üç bölgede alanları saymak gereklidir plağın yüzeyinde hücreleri (Şekil 7).

Şekil 1
Şekil 1. Protokol genel bakış. daha büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 2, Şekil 2. Fotoğraflar hasat sırasında alınan bir kondrosarkoma bir tumorgraft hasat Üst sıra kaygıları:. A = yerinde, B Petri kabı, C = üst görünümünde Petri kabındaki = düşük görünümü. ECM jel tek bir hücre süspansiyonu hasat orta sıra kaygıları: D = yerinde, E Petri kabındaki = üst görünümü, F = alt görünümü. Alt sıra G = matrigel kontrolü, H = hücre çözümü kontrolü, ben dallanma damarları ve kanama gösteren = alt görünümü. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 3,
Şekil 3,. SAOS2 GFP fotoğraf

Şekil 4,
Şekil 4. Aşılama. Satır 1 (Ölçek çubuğu 2 mm) GFP filtre ile bir stereomikroskopta ile yerinde CAM fotoğrafları gösterir sonra bu rakam 8 gün 1 SAOS2 (4 sıra üst) ve SW1353 hem de fotoğrafları (4 sıra daha düşük) gösterir. Satır 2 (ölçek çubuğu 2 mm) yukarıdan LED ile aydınlatılmış ise stereomikroskopta ile aynı örnekleri gösterir. Satır 3 ve 4 H & E (satır 3, ölçek çubuğu 200 mikron) ve Ki67-lekeli gösterir (satır 4, ölçek çubuğu 200 veya 500 mikron) aynı örnekleri. Serisi 5 (ölçek çubuğu 2 mm) den histolojik görüntüleri DSR filtreli bir stereomikroskopta ile yerinde CAM fotoğrafları gösterir. Satır 6 (lercale bar 2 mm) yukarıdan LED ile aydınlatılmış ise stereomikroskopta ile aynı örnekleri gösterir. Satır 7 ve 8 H & ​​E (satır 7, ölçek çubuğu 200 mikron) ve Ki67-lekeli gösterir (satır 8, ölçek çubuğu 200 ve 500 mikron) Aynı örneklerinden histolojik görüntüleri. daha büyük rakam görmek için buraya tıklayın.

Şekil 5,
Şekil 5,. SAOS2 ve SW1353 tümör hücresi çoğalmasının karşılaştırması. SAOS2 A = B = büyüme SW1353 büyüme.

Şekil 6,
6 Şekil. Düşük çekirdekli civciv eritrosit (HE, 100X) bir yüksek dereceli liposarkom tumorgraft boyunca kılcal görülebilir, ilavebıraktı.

Şekil 7
Şekil 7. Her iki hücre hatları için CAM mesafeye göre zaman içinde + ve Ki67-hücreleri Ki67 gösteren. Bölge CAM karşı A = grafik, bölge C plak = yüzeyi, B bölgesi = arasındaki bölge A ve C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Aşılama ve hasat zamanı

Aşılama yapıldığı gün ECM jel (36 CAM'lar) içinde SAOS2 kullanılarak yapılan ve embriyonik gelişim gün 5 ile 10 arasında değişiyordu zamanlama.

Kuluçka gün önce 9, CAM sürekli biz uygulanan ECM jel destekleyecek kadar büyük değildi. Hasat, tümör hücreleri bazen derin CAM alınan gerekiyordu ve bazı ECM jel örnekleri albümin ya da CAM gevşek yatıyorlardı. Gün 5 ve 6, bu civciv malformasyonlar veya ölümle sonuçlanan, civciv embriyo üzerindeki tümör hücrelerinin koyarak önlemek için zordu. Gün 9, CAM tamamen en yumurta penceresinin altındaki yüzey kaplama, ve ECM jel plaklar hasat anda CAM yapışık kanıtladı. Bu nedenle, embriyonik gelişim gün 9 olmak aşılama için ideal zaman bulundu.

Hasat ideal zaman belirlenmesi için, SAOS2 ve SW1353 respectivel sonra hasat edildiY 1, 2 (SAOS2-GFP için), 4, 5, 6, 7 ve 8 gün sonrası aşılama ya da 10 günlük embriyo gelişimi ile 17 arasında. 12 gün - bu varyasyonlar ardından, CAM uygulamanın bir uzunluk farkı 1 not edildi.

Knighton tümör örnek uygulama 17 şu anda embriyonik gelişim güne göre tümör büyümesi ve tümör revaskülarizasyon belirgin farklılıklar yayınladı. Ki67-pozitif ve Ki67-negatif hücrelerin hücre sayımı hücre hatları boyunca günde 4 hücrelerin toplam sayısı sürekli bir artış göstermiştir. Bu Ausprunk ve ark bulgu ile uyumlu olarak. Revaskülarizasyon için gerekli süre 72 saat alır belirtmiştir 21. Hücreleri ve çoğalması indeksi hesaplama sayısını sayma sonra, ECM jel dağılmış hücreleri aktif aşılama gün sonra 6 kadar gün 4'ten artıyor varsayabiliriz. Plak çapının, hücrelerin toplam sayısı ve endeksine dayalıçoğalması, biz hasat için ideal zaman embriyonik gelişim, ya da yedi gün aşılama sonrası gün 16 olduğunu göstermektedir.

Hücrelerin aktif günde bir kez ya da 4, çoğalan sırasında gerekli olan zaman çerçevesi aşılamadan sonra veya her gün bütün zaman dilimi içinde araştırmacılar ajanların uygulanması için altı gün arasında bir pencere bırakır. Topikal uygulama için, bileşik, kam yüzeyi üzerine uygulanır. Bu yol en sık sadece kabuğu / yapışkan filmi 22,23 açarak nedeniyle CAM için erişilebilirlik, bir kullanılır. IV uygulaması mümkün olmasına rağmen, CAM damar içine iğne eklemek için zorluk kritik bir sınırlama yoktur. Kinaz inhibitörleri, günlük olarak 24 üzerine uygulanan kemoterapi kez deney sırasında. Eklerken Biz, bir bileşik ekleyerek bir kez klasik her 3 haftada bir uygulanır sitostatik ajanlar, sitotoksik ile klinik tedavi eşdeğerdir varsayımındagünlük olarak, bileşik, klinik ortamda kinaz inhibitörlerinin günlük doz yansıtır. Ancak, topikal uygulama hastalarda oral veya IV yönetimi ile karşılaştırıldığında farklı kinetik / metabolizma gösterir aklınızda tutmalısınız.

Teknik ve gelecekteki olası uygulamalar Önemi

Hücre kültürleri klinik öncesi modellerde kullanılan, hücre morfolojisi korunması önem taşımaktadır. Bu kollajen tip I 25 ya da ECM jel 26 ile homojen bir hücre dışı matrislerin kullanımı, daha doğal bir büyüme paterni sağlayan, tümör hücresi ortamı geri yükler.

In vivo deneyler, aksine, in vitro tahlillerde bu tür sulandırmak tümörijenik mikro-27 için gerekli bağışıklık hücrelerinin veya kanser ile ilişkili fibroblast hücreleri infiltre anjiyojenik damar hücreleri, stromal hücreler içermez. CAM assay değerlendirmeye kullanıldığındatumorgrafts iyon, biz tumorgraft 14 tarafından civciv gelen stromal hücrelerin işe yansıtan, tumorgrafts doğru CAM tipik bir 'işgal koni' tarif var.

CAM-tahlil ECM jel ile hücre dışı matris geri ve tümörijenik mikroçevresinin sulandırılacak konak hücreleri sağlayan bir kombinasyon sağlar. CAM ve tumorgraft / plak kolayca erişilebilir olduğu için, bileşiklerin uygulanması kolaydır. Bu şekilde, CAM-tahlil gibi sarkom gibi nadir tümör türlerinin klinik öncesi değerlendirilmesi yönelik yeni ufuklar açabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

SW1353 kondrosarkom hücre hattı hücreleri nazikçe Dr PCW Hogendoorn ve Leiden Üniversitesi, Hollanda Dr J. Bovee tarafından sağlandı. Biz protokol genel profesyonel çizim için J. Mestach ve G. Wagemans mükemmel teknik yardım için, ve G. De Bruyne teşekkür ederim.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Line Nucleofector Kit V Amaxa VCA-1003
collagenase 2 solution (500 U/ml RPMI 1640) Sigma Aldrich C6885
DMEM Invitrogen 41965-039
DMSO Sigma D8418
Dnase solution Sigma Aldrich DN25
G418 Invitrogen 11811031
Matrigel Sigma-Aldrich E1270
mouse primary monoclonal antibody Ki67 Dako Denmark MIB-1
Paraformaldehyde Fluka D76240
PBS Invitrogen 20012019
PBSD Invitrogen 14040083
peGFP-C1 vector Clontech 632470
Penicillin/streptomycin Invitrogen 15140163
RPMI Invitrogen 22409-015
Trypsin-EDTA solution Invitrogen 25300054
Vybrant cell-labeling DiI Lifetechnologies 22885
Countess Automated Cell Counter Invitrogen C10227
digital color camera Leica DFC 340 FX
Digital Egg Incubator Auto Elex Co R-COM 50
FACS BD Biosciences FACSAriaIII
Gentlemacs C-Tube Miltenyi Biotech 130-093-237
Gentlemacs Dissociator Miltenyi Biotech 130-093-235
Gentlemacs Dissociator User Manual containing h_tumor protocol Miltenyi Biotech
Name Company Catalog Number Comments
semipermeable adhesive film (Suprasorb F) Lohmann&Rauscher 20468
stereo fluorescence microscope Leica M205 FA
Tissue-Tek Film automated Coverslipper Sakura 6400
ultraView Universal DAB Detection Kit Ventana Medical Systems Inc 760-500
Ventana Automated Slide Stainer Ventana Medical Systems Benchmark XT

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mankin, H. J., Hornicek, F. I., Rosenberg, A. E., Harmon, D. C., Gebhardt, M. C. Survival data for 648 patients with osteosarcoma treated at one institution. Clinical Orthopaedics and Related Research. 429, 286-291 (2004).
  2. Hoffmann, J., Schmidt-Peter, P., et al. Anticancer drug sensitivity and expression of multidrug resistance markers in early passage human sarcomas. Clinical Cancer Research. 5, 2198-2204 (1999).
  3. Greenlee, R. T., Hill-Harmon, M. B., Murray, T., Thun, M. Cancer statistics, 2001. CA A Cancer Journal for Clinicians. 51, 15-36 (2001).
  4. Gil-Benso, R., Lopez-Gines, C., et al. Establishment and characterisation of a continuous human chondrosarcoma cell line, ch-2879: Comparative histologic and genetic studies with its tumor of origin. Laboratory Investigations. 83, 877-887 (2003).
  5. Taylor, B. S., Barretina, J., et al. Advances in sarcoma genomics and new therpeutic targets. Nature Reviews Cancer. 11, 541-557 (2011).
  6. Skubitz, K. M., D'Adamo, D. R. Sarcoma. Mayo Clinic Proceedings. 82, 1409-1432 (2007).
  7. Nielsen, T. O., West, R. B. Translating gene expression into clinical cara: sarcomas as a paradigm. Journal of Clinical Oncology. 28, 1796-1805 (2010).
  8. Vaira, V., Fedele, G., Pyne, S. Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors. Proceedings of the National Academy of Science USA. 107, 8352-8356 (2010).
  9. DeRose, Y. S., Wang, G., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17, 1514-1520 (2011).
  10. Tentler, J. J., Tan, A. C., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nature Reviews Clinical Oncology. 9, 338-350 (2012).
  11. Bertotti, A., Migliardi, G., et al. A molecularly annotated platform of patient-derived xenografts ("xenopatients") identifies HER2 as an effective therapeutic target in cetuximab-resistant colorectal cancer. Cancer Discovery. 1, 508-523 (2011).
  12. Decaudin, D. Primary human tumor xenografted models ('tumorgrafts') for good management of patients with cancer. Anticancer Drugs. 22, 827-841 (2011).
  13. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
  14. Sys, G., Van Bockstal, M., et al. Tumor grafts derived from sarcoma patients tumor morphology, viability, and invasion potential and indicate disease outcomes in the chick chorioallantoic membrane model. Cancer Letters. 326, 69-78 (2012).
  15. Armstrong, P. B., Quigley, J. P., Sidebottom, E. Transepithelial invasion and intramesenchymal infiltration of the chick embryo chorioallantois by tumor cell lines. Cancer Research. 42, 1826-1837 (1982).
  16. Deryugina, E., Quigly, J. Chick embryo chorioallantoic membrane model systems to study and visualize human tumor cell metastasis. Histochemistry and Cell Biology. 130, 1119-1130 (2008).
  17. Knighton, D., Ausprunk, D., Tapper, D., Folkman, J. Avascular and vascular phases of tumor growth in the chick embryo. British Journal of Cancer. 35, 347-356 (1977).
  18. Dohle, D. S., Pasa, S. D., Gustmann, S., Laub, M., Wissler, J. H., Jennissen, H. P., Dünker, N. Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: how it really works. J. Vis. Exp. (33), e1620 (2009).
  19. Balke, M., Neumann, A., et al. Morphologic characterization of osteosarcoma growth on the chick chorioallantoic membrane. BMC Research Notes. 3, 58 (2010).
  20. Hendrix, A., Maynard, D., et al. Effect of the secretory small GTPase Rab27B on breast cancer growth, invasion, and metastasis. Journal of the National Cancer Institute. 102, 866-880 (2010).
  21. Ausprunk, D., Knighton, D., Folkman, J. Vascularization of normal and neoplastic tissues grafted to the chick chorioallantois: role of host and preexisting graft vessels. American Journal of Pathology. 79, 597-618 (1975).
  22. Lokman, N. A., Elder, A. S. F., Riciardelli, C., Oehler, M. K. Chick Chorioallantoic membrane (CAM) Assay as an in vivo model to study the effect of newly identified molecules on ovarian cancer invasion and metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 13, 9959-9970 (2012).
  23. Vargas, A., Zeisser-Labouèbe, M., Lange, N., Gurny, R., Delie, F. The chick embryo and its chorioallantoic membrane (CAM) for the in vivo evaluation of drug delivery systems. Advanced Drug Delivery Reviews. 59, 1162-1176 (2007).
  24. Hagedorn, M., Javerzat, S., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 102, 1643-1648 (2005).
  25. De Wever, O., Hendrix, A., et al. Modeling and quantification of cancer cell invasion through collagen type I matrices. International Journal of Developmental Biology. 54, 887-896 (2010).
  26. Albini, A., Benelli, R. The chemoinvasion assay: A method to assess tumor and endothelial cell invasion and its modulation. Nature Protocols. 2, 504-511 (2007).
  27. Hanahan, D., Coussens, L. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21, 309-322 (2012).

Tags

Kanser Biyolojisi Sayı 77 Tıp Hücresel Biyoloji Moleküler Biyoloji Biyomedikal Mühendisliği Biyomühendislik Gelişim Biyolojisi Anatomi Fizyoloji Onkoloji Cerrahi Tümörler Yağ Doku Bağ Doku Tümör Kas Doku Sarkoma Hayvan Deney Hücre Kültürü Teknikleri Tümörler Deneysel Tümör Nakli Biyolojik Testi Sarkomlar CAM-testi ksenogreft çoğalması işgal kanser tümör, CAM tahlil klinik teknikler hayvan modeli
<em&gt; Ovo</emSarkoma için bir Xenograftmodel olarak&gt; CAM-testi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sys, G. M. L., Lapeire, L., Stevens, … More

Sys, G. M. L., Lapeire, L., Stevens, N., Favoreel, H., Forsyth, R., Bracke, M., De Wever, O. The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma. J. Vis. Exp. (77), e50522, doi:10.3791/50522 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter