Summary
Лейцин богатых повторные киназы 1 и 2 (LRRK1 и LRRK2) являются многодоменные белки, которые кодируют как GTPase и киназные домены и которые фосфорилируется в клетках. Здесь мы приводим протокол маркировать LRRK1 и LRRK2 в клетках с 32 P ортофосфата, тем самым предоставляя средства для измерения их общий уровень сотовой phophorylation.
Abstract
Лейцин богатых повторные киназы 1 и 2 (LRRK1 и LRRK2) являются паралоги, которые разделяют подобную организацию домена, в том числе серин-треонин домена киназы, в Ras из комплексной области белков (РПЦ), С-терминала РПЦ домена (COR), и лейцин-богатый и анкириновых, как повторяется на N-конце. Точные сотовой роли LRRK1 и LRRK2 до сих пор не выяснены, однако LRRK1 был вовлечен в тирозинкиназы рецептора сигнализации 1,2, в то время как LRRK2 вовлечен в патогенез болезни Паркинсона 3,4. В этом отчете мы приводим протокол маркировать белки LRRK1 и LRRK2 в клетках с 32 P ортофосфата, тем самым предоставляя средства для измерения общего уровня фосфорилирования этих 2 белков в клетках. Короче говоря, близость отмеченных LRRK белки экспрессируются в HEK293T клеток, которые подвергаются среде, содержащей 32 P-ортофосфат. 32 Р-ортофосфат усваивается клетками после лишь немногиеч инкубации и все молекулы в ячейке, содержащей фосфаты тем самым радиоактивно метили. Через аффинной метки (3xflag) в LRRK белки изолированы от других клеточных компонентов путем иммунопреципитации. Иммунопреципитаты затем разделяют с помощью SDS-PAGE, переносили на мембраны ПВДФ и анализа объединенных фосфатов производится авторадиографией (32 P сигнала) и западной обнаружения (сигнал белок) белков на клякс. Протокол может быть легко адаптированы дл контрол фосфорилирование любой другой белок, который может быть выражено в клетках и изолированных с помощью иммунопреципитации.
Introduction
Лейцин богатых повторные киназы 1 и 2 (LRRK1 и LRRK2) являются многодоменные паралоги, которые разделяют подобную организацию домена. Оба белка кодирования последовательность GTPase сродни семьи Рас из GTPases (Ras сложных белков, или РПЦ), а также С-концу РПЦ домена (COR), эффективно классификации оба белка в семье 5,6 ROCO белка. N-терминал доменного тандеме РПЦ-COR, оба белка кодировать лейцин-богатый повтор домен, а также в анкириновых-подобный домен, в то время как только LRRK2 кодирует дополнительный броненосца Domein 6-8. С-конец РПЦ-COR, оба белка поделиться домен киназы серин-треонин в то время как только LRRK2 кодирует домен WD40 в С-концевой области 8. Точные сотовые роли LRRK1 и LRRK2 до сих пор не выяснены, однако LRRK1 был вовлечен в тирозинкиназы рецептора сигнализации 1,2, в то время как генетическая данные указывают на роли LRRK2 в патогенезе болезни Паркинсона 3,4.
9-11. Хотя LRRK1 сотовой сайты фосфорилирования до сих пор не отображается, данные исследований с использованием фосфопротеин окрашивание блотов иммунопреципитации белка LRRK1 от COS7 клеток показывает, что LRRK1 белок фосфорилируется в клетках 12.
Эта статья обеспечивает базовый протокол для опробования общий уровень фосфорилирования LRRK1 и LRRK2 в клеточных линиях с использованием метаболического маркировку с 32 P-ортофосфатом. Общая стратегия очень проста. Affinity отмеченных LRRK PROTEмодули выражены в HEK293T клеток, которые подвергаются среде, содержащей 32 P-ортофосфат. 32 Р-ортофосфат усваивается клетками только после нескольких часов инкубации и всех молекул в ячейке, содержащей фосфаты тем самым радиоактивно метили. Аффинная метка (3xflag) используется для изоляции LRRK белки из других клеточных компонентов путем иммунопреципитации. Иммунопреципитаты затем разделяют с помощью SDS-PAGE, переносили на мембраны ПВДФ и анализа объединенных фосфатов производится авторадиографией (32 P сигнала) и западной обнаружения (сигнал белок) белков на клякс.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Настоящий протокол использует радиоактивный 32 P-меченых ортофосфат следовать сотовой фосфорилирования LRRK2. Важно иметь в виду, что все операции с радиоактивными реагентами должны быть выполнены с использованием соответствующих защитных мер для минимизации воздействия радиоактивного излучения на оператора и окружающей среды. Соединения, содержащие изотопы, излучающие ионизирующее излучение может быть вредным для здоровья человека и строгой лицензирования и правил в институциональной и национального контроля над уровнем их использования. Эксперименты в этом протоколе были проведены после обучения в использовании с открытым исходным кодом излучения на Католического университета Левена (КУ Левен) и следуя хорошие руководящие принципы лабораторной практике, предоставляемые отделом здоровья, безопасности и окружающей среды в университете. Несколько шагов в нашем протоколе широко используются, например, клеточных культур, SDS-PAGE, вестерн-блоттинга и с учетом вот детали протокола как это применяется в нашей лаборатории. Он сhould отметить, что точные экспериментальные условия различаются в зависимости от лаборатории к лаборатории, поэтому конкретные меры по обеспечению надлежащего обращения радиоактивных материалов должны быть адаптированы к каждой новой лабораторных условиях.
Использование с открытым исходным кодом излучения подлежит предварительному утверждению регламента и регулирующий орган отвечает за открытым исходным кодом излучения в лабораторных исследованиях варьируется от страны к стране. Пользователи должны проконсультироваться со своим институциональной офицера радиационной безопасности для того, чтобы гарантировать, что процедура соответствовать местным правилам и положениям. Информация о регулирующих органов можно найти: в Бельгии, Федерального агентства по ядерному контролю ( http://www.fanc.fgov.be , сайт на французском или голландском), в Соединенном Королевстве, здравоохранения и безопасности ( HTTP: / / www.hse.gov.uk / излучение / ионизирующего / index.htm ), в Соединенных Штатах NucКомиссия Лир регулированию ( http://www.nrc.gov/materials/miau/regs-guides-comm.html ), в Канаде Канадская комиссия по ядерной безопасности ( http://nuclearsafety.gc.ca/eng/ ), и в Германии Das Ведомства für Strahlenschutz ( http://www.bfs.de/de/bfs ). Меры предосторожности, относящиеся к этому протоколу были отмечены в тексте, выделены радиоактивных символ трилистника ( ).
1. Метаболический Маркировка клеток
- Подготовка клетки для маркировки.
- Линии Культура HEK293T клеток в соответствии со стандартными условиями культивирования (37 ° С, 5% СО 2) в DMEM с 8% эмбриональной телячьей сыворотки и гентамицина.
- Развернуть клетки достаточно, чтобыполучения по меньшей мере 1 × 10 6 клеток на образец для тестирования.
- Trypsinize клетки и пластины из в 6-луночные планшеты (диаметр 35 мм) на 10 6 клеток / лунку.
- 24 часа в сутки после посева из клетки, выразить 3xflag-LRRK2 белок через трансфекции или лентивирусный вектора опосредованной трансдукции.
- Для трансфекции смешивать в образце 4 мкг ДНК (pCHMWS-3xflag-LRRK2 плазмида 13-15 или pCHMWS-3xflag-LRRK1 плазмида 15) и 8 мкл линейного полиэтиленимина (PEI линейный, 1 мг / мл) в 80 мкл DMEM (без добавок ). Позвольте комплекса в течение 15-30 мин, затем добавить комплекс в клетки путем смешивания хорошо в средней настоящее время.
- Для лентивирусным вектора опосредованной трансдукции, развести лентивирусов вектор, кодирующий 3xflag-LRRK1 или -2 (LV-3xflag-LRRK1, LV-3xflag-LRRK2, как правило, преобразовывать в два раза больше единиц преобразующих, т.е. число функциональных векторных частиц, из lentivector как есть клетки) в культуральную среду. Описание продукта ион LV-3xflag-LRRK1 / 2, была описана ранее 15.
- Когда клетки 80-100% сливной (около 48 ч после трансфекции или трансдукции), промыть клетки с предварительно нагретого (37 ° C) DMEM без фосфатов.
- Этикетка клетки с 32 P-орто-фосфата.
- Имейте в виду общие принципы безопасности при работе с излучением.
- Все операции с 32 P в назначенный район излучения.
- Подходит индивидуальной защиты следует носить - под стандартной процедурой в нашей лаборатории они включают халат, двойные перчатки и защитные очки.
- г "Первоначально" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> Вся работа с 32 Р должны быть защищены от пользователей на 6 экранах мм Perspex сведения к минимуму воздействия.
- Средства личной мониторинга должны всегда использоваться - в Куала Лумпур сертифицированы пользователь с открытым исходным кодом излучение носит фильм значок, прикрепленный к нагрудном кармане халата для контроля радиационного облучения в ходе экспериментов.
- Все экспериментальные поверхности должны быть осмотрены на предмет радиоактивности до и после использования с счетчиком Гейгера.
- Все потенциально зараженные расходные следует утилизировать в строгом соответствии с ведомственным руководящим принципам для РАdioactive утилизации отходов.
- Под ламинарного потока, подготовить трубки сокола с 2,1 мл DMEM без фосфатов (нагретого до 37 ° С) в 6-луночный планшет клеток к этикетке.
- Например, для обозначения клеток в каждую лунку 6-луночного планшета, готовят 12,6 мл среды (= 6 х 2,1). Это необходимо для обеспечения 2 мл среды для использования в 6-луночный планшет скважины клеток с 5% избытком объема.
- Подготовьте скамейку, на которой будет выполняться эксперименты с ионизирующим излучением. Рабочее пространство покрыта разлива мата, на котором защитный вкладыш из впитывающего материала помещают. В случае, если вы используете лайнер с одним водонепроницаемой поверхности, поместите его с поглощающей стороной вверх.
- Также предусматриваетсябаночка плексигласа на рабочее место и место трубку фосфатного среде без в нем.
- Возьмите картонных контейнерах ведущую с флакона 32 P с надписью ортофосфатом из холодильника и довести его до радиоактивности скамейке. Монитор контейнер для внешнего радиоактивного загрязнения, используя счетчик Гейгера.
- Развести 32 P помечены ортофосфат в трубку DMEM без фосфатов в концентрации 24 мкКи / мл.
- Примечание: в 2 мл в 6-луночный планшет хорошо клеток, что соответствует 5 мкКи 32 P с надписью ортофосфатной / см 2 культивируемых клеток.
- Держатьтрубка в банке плексигласа.
- Закройте контейнер с оставшейся части 32 P помечены ортофосфатом и заменить в холодильнике.
- Удалить 6-луночных с клетками, которые будут помечены из инкубатора и место на радиоактивности скамейке.
- Удалить среднего супернатант и выбросьте. Добавить 2 мл фосфатного среде без содержащие 32 Р помечены ортофосфат / хорошо.
- Поместите культуру, живущую в коробку из плексигласа затем отслеживать контейнер FOг внешний радиоактивное загрязнение с помощью счетчика Гейгера.
- Перевести коробку Perspex с клетками в эукариотической инкубаторе клетки, посвященной изотопного обмена веществ маркировки.
- Инкубировать в течение 1-20 ч при 37 ° С в 5% CO 2.
- В общем, время включение 3 часов или более рекомендуется. Оптимальное время инкубации могут быть оценены через время курса экспериментов для каждого конкретного белка как хотелось бы.
- Дополнительно: лечить клетки с соединением.
- В экспериментах с обработки соединением (например, ингибитора киназы), шаг соединение лечение входит в систему послеitial время инкубации без соединения, чтобы позволить для маркировки. По истечении заданного времени инкубации, коробка Perspex содержащий культуральные планшеты удаляются из инкубатора и доведены до радиоактивности скамье.
- Маркировка среду удаляют и заменяют нагретого фосфатов среды в котором соединение разбавляют в нужной концентрации. Откажитесь среду в 50 мл трубки для сбора отходов, которая помещается в банку плексигласа.
- Клетки заменен в поле Perspex и помещают в клетки инкубаторе в течение требуемого времени контакта.
- Имейте в виду общие принципы безопасности при работе с излучением.
- Сбор лизаты Лабыво главе клетки.
- Удалите среду от клеток и выбросить в сбора отходов трубку, которая помещается в банку плексигласа.
- Промыть клетки 2x ледяной TBS (трис 50 мМ, NaCl 150 мМ, рН 7,4, 2 мл / полоскания), отбрасывая промывочный раствор в сбора отходов трубки, помещенной в банке Perspex.
- Добавить 0,5 мл охлажденного льдом иммунопреципитации (IP) лизирующего буфера в каждую лунку и собирать лизата с помощью пипетки лизата вверх и вниз для того, чтобы ослабить все лизированных клеток.
- Подготовьте необходимый объем IP буфера для лизиса (0,5 мл / образца плюс 5% избыток) загодя, добавив коктейль ингибиторов протеаз и фосфатазыингибитор коктейль свежей непосредственно перед использованием.
- Состав буфера для лизиса является 20 мМ Трис, рН 7,5, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1% Тритон, глицерин 10%, коктейль ингибиторов протеаз и ингибиторы фосфатазы коктейль.
- Передача лизата в микроцентрифужных трубки и инкубировать на льду в течение по крайней мере 10 мин.
- Центрифуга лизатов в микроцентрифуге при> 5000 мкг в течение 10 мин.
- Утилизация радиоактивных отходов в специальных мусорных баков, которые хранятся за Perspex щитов.
2. Анализ маркировки интерес белков
- Изолировать интерес белок по иммуноочистки (IP).
- Передача микроцентрифужных пробирок с центрифугированных лизатов обратно в лед и супернатант пипеткой в микроцентрифужных трубки, содержащей 10 мкл объем слоя равновесного флаг-M2 агарозных гранулах.
- Подготовьте трубы с уравновешенной флаг-М2 агарозы загодя.
- Для этого, пипетки объем флаг-M2 агарозном суспензии, соответствующей 10 мкл объем слоя в образце плюс 5% избытком.
- Как правило, объем слоя 10 мкл из бисера соответствует 20 мкл суспензии. Обратитесь к спецификации продукта для более подробной информации.
- Равновесие бусинки промывкой 3 раза в 10 томах (по отношению к объему слоя) от IP буфере для лизиса.
- Распределить уравновешенные бусы равномерно в 10 мкл объем слоя / трубки на столько труб, есть образцы. Пометьте пробирки с идентификатором для каждого образца.
- Перенесите микроцентрифужных пробирок 50 мл пробирки (около 6 микроцентрифуги tubes/50 мл трубки), меченных радиоактивным символом трилистника и держать на льду.
- Образцы Переезд в поворотным устройством за щитом Perspex в назначенный район холодном помещении для конца над конце смешивания при температуре 4 ° С в течение 1-20 часов.
- Перенесите образцы по указанному рабочего пространства на льду.
- 50523rad1highres.jpg "Первоначально" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> Спин вниз белок связан флаг-M2 агарозном бисером в микроцентрифуге (1000 XG, 1 мин) и отбросить супернатант в сбора отходов трубки.
- Вымойте белок связан флаг-M2 агарозном бисером ресуспендированием в 1 мл IP промывочного буфера.
- Состав IP промывочного буфера: Трис 25 мМ, рН 7,5, NaCl 400 мМ, Тритон 1%. Рекомендуется также включают протеазы и ингибиторы фосфатазы в буфере для стирки белков, чувствительных к деградации путем совместного очистки протеазы или дефосфорилирования путем совместной очистки фосфатаз.
- Спином вниз белок связан флаг-M2 агарозном бисером в микроцентрифуге (1000 XG, 1 мин) и отбросить супернатант в коллективных отходовТион трубки.
- Повторите мыть шаг 3 раза.
- После промывок, ресуспендируют бисером в 1 мл IP полоскания буфера (Трис 25 мМ рН 7,5, MgCl 2 10 мм, дитиотреитол (DTT) 2 мм, Тритон 0,02%, бета-глицерофосфат 5 мМ, Na 3 VO 4 0,1 мм).
- Спином вниз белок связан флаг-M2 агарозном бисером в микроцентрифуге (1000 XG, 1 мин) и отбросить супернатант в сбора отходов трубки. Удалите все излишки буфера.
- Ресуспендируют бусины в 40 и ми; л IP образец SDS загрузочного буфера (Трис-HCl 160 мМ рН 6,8, 2% SDS, 0,2 М DTT, 40% глицерин, бромфеноловый синий 2 мг / мл).
- Образцы могут быть проанализированы немедленно или хранить в -20 ° C морозильнике в течение скрытых анализа.
- Для хранения образцов при -20 образцов ° С, место в держателей труб или коробки в коробке Perspex в радиоактивных символ трилистника с надписью морозильник, выделенной для хранения радиоактивных образцов.
- Образцы могут быть проанализированы немедленно или хранить в -20 ° C морозильнике в течение скрытых анализа.
- Утилизация радиоактивных отходов в специальных мусорных баков, которые хранятся за Perspex щитов.
- Передача микроцентрифужных пробирок с центрифугированных лизатов обратно в лед и супернатант пипеткой в микроцентрифужных трубки, содержащей 10 мкл объем слоя равновесного флаг-M2 агарозных гранулах.
- Решить образцы IP через SDS-PAGE и Блот до PVDF мембраны.
- Образцы тепла в загрузочном буфере до 95 ° С в течение 2 мин и центрифуги в течение 1 мин при> 1000 мкг для осаждения бусы.
- Подготовьте гель модуль электрофореза белка на радиоактивности скамейке позади экрана плексигласа.
- Образцы загружают на 3-8% Трис-ацетат гели через SDS-PAGE.
- Этот тип гель подходит для решения высокой молекулярной массой (ВММ) белков. Другие типы гель может быть также подходит, например, 4-20% Bis-трицин гель или трис-глицина 4-20% гели.
- Включить маркер молекулярной массы, который пригоден различить размеры HMW протеинов.
<литий> Выполнение электрофореза при 150 V в течение 1 часа.
- После электрофореза удалить гель из пластиковый корпус и передать гель в контейнер с Западной блоттинга буфера передачи.
- Состав вестерн-блоттинга буфера передачи: Трис 50 ммоль, Глицин 40 мм, SDS 0,04%, метанол 20%.
- Отрезанные части геля, которые торчат такие как сепараторов скважины и нижней части геля, который торчит.
- Подготовка один из поливинилиденфторида (ПВДФ) мембрана в гель путем погружения в метаноле в течение 1 мин, а затем поместить в буфере для переноса.
- Мембраны сократить к с Ame размера, что и геля плюс маржа в 3 мм.
- Наведите полусухого модуль блоттинга на радиоактивности скамейке и снимите крышку и верхнюю электродную пластину.
- Подготовьте промокательной бутерброд на поверхности полусухого блоттинга модуля.
- Влажный дополнительный толстый (2,5 мм толщиной, 7,5 х 10 см большой) блоттинга фильтр в буфере передачи и место на нижней пластине модуля блоттинга.
- Поместите предварительно мокрой PVDF мембрану на блоттинга фильтра.
- Осторожно поместите гель на PVDF мембрану и удалить пузырьки воздуха.
- 523/50523rad1highres.jpg "Первоначально" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> Завершить бутерброд блот путем смачивания дополнительный толстый блоттинга фильтр в буфере для переноса и место на нижней пластине промокательной модуля. Удалить весь воздух пузырьки в конечном итоге, присутствующие в промокательной бутерброд.
Пожалуйста, обратите внимание, что описание дано здесь совместим с транс-блот системы SD BioRad где электроды таким образом, что белки мигрировать вниз на мембрану. Другие промокательной системы также совместимы с этих шагов с незначительными изменениями, такими как те, в конце концов нужно учитывать еще один промокательной направление или, в случае бака блоттинга, дополнительной жидких отходов, которые будут утилизировать таким же образом, как буфер для электрофореза выше.
- Удалите все излишки буфера с фильтровальной бумагой, и поместить верхнюю пластину и крышку полу-д ры промокательной модуль.
- Трансфер белки при 15 V в течение 1-2 часов.
- В течение этого времени очистки модуль электрофореза.
- Утилизация радиоактивных отходов в специальных мусорных баков, которые хранятся за Perspex щитов.
- Промойте модуль электрофореза с дистиллированной водой (AD) и меняйте воду для промывания в радиоактивной жидкости контейнер для отходов.
- 0523/50523rad1.jpg "/> После передачи, снимите PVDF мембрану с BLOTTED белков из модуля блоттинга.
- Дополнительно: выполнить Ponceau S окрашивание BLOTTED белков для визуализации белков.
- Перенести кляксу на мелкой блот инкубации сосуд, содержащий решение Ponceau S и выдержать в течение 5 мин.
- Промойте 2 раза быстрее в нашей эры.
- Сушат мембрану.
- Expose мембрану к фосфоресценции пластины в течение 1-5 дней.
- Читайте Р32 прочь открытой фосфоресценции пластины с помощью Шторм 840 фосфоресценции сканер или эквивалент и сохранить изображение в качестве высокого разрешения TIFF.
- Увлажняет мембран, опуская их кратко в метанол, а затем перенести в неглубокой блот инкубационного судна с PBS. Блок мембран в PBS-T (PBS с 0,1% Triton), содержащего 5% молока.
- Выполните денситометрическую анализ по полосам на клякс авторадиограмм и иммунореактивности с использованием соответствующего программного обеспечения, таких как программное обеспечение ImageJ, бесплатная программа, доступной на Национальной InstitУтес из веб-сайта здравоохранения ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ).
- Рассчитать уровни фосфата включения как отношение авторадиографического сигнала над уровнем иммунореактивности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для того чтобы сравнить общий уровень фосфорилирования LRRK1 и LRRK2 в клетках, 3xflag отмеченных LRRK1 и LRRK2 были выражены в HEK293T клеток 15. Клетки культивировали в 6-луночные планшеты и метили 32 Р и анализировали, как описано выше в тексте протокола. Рисунок 1 показывает репрезентативные результаты для метаболического маркировки LRRK1 и LRRK2 в HEK293T клеток. Радиоактивный фосфат включение наблюдается для обоих LRRK1 и LRRK2. После количественной оценки уровней 32Р нормализованных до уровней белка, измеренную денситометрическим анализом иммунологического с анти-антителом флага, было обнаружено, что LRRK1 имели средний уровень фосфорилирования, которая ниже, чем LRRK2 в условиях испытанных, хотя статистическая значимость не достиг (р> 0,05).
1.jpg "/>
Рисунок 1. Метаболический маркировка LRRK1 и LRRK2. А. LRRK1 и LRRK2 выражены в HEK293T клетки метаболически метили 32 Р, как описано в протоколе и приводит секции. Изображенные здесь являются представительными авторадиограммы (верхняя панель) из 32 P включения, а также представительства Вестернблоты (нижняя панель) из LRRK1 и обнаружения LRRK2 через их тегов 3xflag. B. Количественное определение сравнительного метаболического маркировки LRRK1 и LRRK2 (N = 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эта статья обеспечивает базовый протокол для опробования общий уровень фосфорилирования LRRK1 и LRRK2 в клеточных линиях с использованием метаболического маркировку с 32 P-ортофосфатом. Общая стратегия очень проста. Affinity отмеченных LRRK белки экспрессируются в HEK293T клеток, которые подвергаются среде, содержащей 32 P-ортофосфат. 32 Р-ортофосфат усваивается клетками только после нескольких часов инкубации и всех молекул в ячейке, содержащей фосфаты тем самым радиоактивно метили. Аффинная метка (3xflag) используется для изоляции LRRK белки из других клеточных компонентов путем иммунопреципитации. Иммунопреципитаты затем разделяют с помощью SDS-PAGE, переносили на мембраны ПВДФ и анализа объединенных фосфатов производится авторадиографией (32 P сигнала) и Западной обнаружения (сигнал белок) белков на клякс. Этот протокол следует отличать от протокола для измерения LRRK2 а.е.tophosphorylation 17 в этой маркировки LRRK1 или LRRK2 выполняется в клеточной культуре, а не в реакции фосфорилирования в пробирке с очищенными белками.
Следует отметить, что подробное протокол, представленные здесь можно регулировать, чтобы приспособить для нескольких вариантах в зависимости от экспериментальных потребностей. Например, как маркировка является эффективным в большинстве общих линий лабораторных клеток, этот протокол не ограничивается использованием HEK293T клеточной линии. Кроме того, другие метки сродства могут быть использованы в качестве альтернативы 3xflag, например, HA, Myc, V5, GFP или другие метки 18, как множественные метки могут использоваться эффективно Иммунопреципитат LRRK1 или LRRK2. В случае, если антитела белок конкретных доступен для белка, который подходит для иммунопреципитации, как это имеет место для LRRK2 11, это может быть осуществлено также. С протеин-специфические антитела иммунопреципитация класса, это также возможно выполнить метаболизма маркировки LRRKбелки эндогенно экспрессированного в клеточных линиях. В случае LRRK2, несколько моноклональные антитела были описаны которые могут иммунопреципитации эндогенного LRRK2 19. Наконец, метаболический протокол маркировки, описанные здесь LRRK1 и LRRK2 также могут быть адаптированы к любой другой белок, который может быть иммунопреципитации из клеточных линий с использованием общей стратегии, описанной выше.
Ключевым фактором перед выполнением обмена веществ маркировки белков в культуре клеток, как этот метод можно сравнить с другими доступными методами для определения клеточного фосфорилирования белка. Например, фосфорилирование в определенных местах можно контролировать с помощью иммуноблоттинга с использованием фосфо-специфических антител. Этот метод следует аналогичные шаги тем, что описаны здесь, за исключением изотопных шагов маркировки, и по этой причине, этот метод часто отдается предпочтение по сравнению метаболического маркировки с 32 P-ортофосфатом когда она будет доступна. Метаболический маркировки с 32 Р-ортофосфат обеспечивает сигнал, который является представителем общего состояния фосфорилирования белка, поэтому он не может предоставить информацию о фосфорилирования специфических сайтах. Для белков с нескольких сайтов фосфорилирования, как это имеет место для LRRK2 10,11, метаболический метод маркировки обеспечивает оценку одностадийный общего уровня фосфорилирования, который может констатировали с фосфо-специфических антител только в ожидании несколько этапов иммунологического. Например, LRRK2 сильно фосфорилируется в АНК-LRR междоменного области, т.е. S910/S935/S955/S973 11,20 сайтов, а также в других регионах 10 в том числе недавно отличающийся сайт S1292 21. Для того, чтобы рассекать из роли отдельных phosphosites, рекомендуется отдавать предпочтение эксперименты с phosphosite специфических антител. Например phosphosite специфические антитела позволили различить, что phosphosites S910/S935/S955/S973 являются дефосфорилироватьд в нескольких патогенных мутантов, таких как R1441C / G, Y1699C, I2020T, но не в G2019S 11,22, в то время как болезнь LRRK2 мутантные формы в целом показывают более высокие уровни фосфо-S1292 21. Тем не менее, метаболический маркировка полезны для ряда других исследований клеточного фосфорилирования. Метаболический маркировка всегда применимо техника, например, в случаях неизвестных сайтов фосфорилирования, или когда фосфо-антитела не доступны или низкой чувствительности. Наконец, метаболический маркировка позволяет сравнивать общий уровень фосфорилирования различных белков (как показано здесь сравнения клеточном уровнях фосфорилирования LRRK1 и LRRK2, рисунке 1), сравнение, которое сложно сделать с помощью phosphosite-специфических антител, приведенных различия в чувствительности от одного антитела к другому .
В заключение, настоящее протокол позволяет эффективно оценку общего уровня фосфорилирования LRRK белков в клетках. Протокол может быть легко адаптированы дл контролфосфорилирование любой другой белок, который может быть выражено в клетках и изолированных с помощью иммунопреципитации. Использование этого протокола рекомендуется при phosphosite-специфические антитела не доступны для белка в исследовании или в качестве шага на пути их проверки. Этот протокол особенно полезно, когда экспериментальный цель состоит в том, чтобы сравнивать общую фосфорилирование 2 или более различных белков в качестве таких сравнений метаболического через маркировки не смещены различиями в чувствительности обнаружения фосфорилирования белка от одного к другому. Специально для LRRK1 и LRRK2, этот метод может быть использован для сравнительно контролировать деятельность зависимые изменения в фосфорилирования LRRK1 и LRRK2, учитывая, что такие изменения которые начали быть описано для LRRK2 11,13,23, в то время как регулирование фосфорилирования LRRK1 еще плохо изучены.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Мы также благодарны Майкл Дж. Фокс Фонд в поддержку этого исследования. Мы благодарим исследовательский фонд - Фландрия FWO (проект FWO G.0666.09, старший научный сотрудник общение на JMT), проект Нейро-TARGET ВВТ SBO/80020, Ку-Левен (OT/08/052A и IOF-KP/07 / 001) за их поддержку. Это исследование было также частично поддержана Фондом Druwé-Eerdekens управляемых Фонд короля Бодуэна в JMT.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Phosphorus-32 Radionuclide, 1 mCi, buffer disodiumphosphate in 1 ml water | Perkin Elmer | NEX011001MC | |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (D-MEM) (1X), liquid (high glucose) | Invitrogen | 11971-025 | This medium contains no phosphates |
Anti Flag M2 affiinty gel | Sigma | A2220 | For an equivalent product with red colored gel (useful to more easily visualize the beads), use cat. No. F2426. |
Extra thick blotting filter | Bio-Rad | 1703965 | |
Ponceau S solution | Sigma | P7170 |
References
- Hanafusa, H. Leucine-rich repeat kinase LRRK1 regulates endosomal trafficking of the EGF receptor. Nat Commun. 2, 158 (2011).
- Titz, B., et al. The proximal signaling network of the BCR-ABL1 oncogene shows a modular organization. Oncogene. 29, 5895-5910 (2010).
- Cookson, M. R. The role of leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) in Parkinson's disease. Nat Rev Neurosci. 11, 791-797 (2010).
- Taymans, J. M., Cookson, M. Mechanisms of dominant parkinsonism; the toxic triangle of LRRK2, alpha-synuclein and tau. Bioessays. 32, 227-235 (2010).
- Lewis, P. A. The function of ROCO proteins in health and disease. Biol Cell. 101, 183-191 (2009).
- Marin, I., van Egmond, W. N., van Haastert, P. J. The Roco protein family: a functional perspective. FASEB J. 22, 3103-3110 (2008).
- Marin, I. The Parkinson disease gene LRRK2: evolutionary and structural insights. Mol.Biol.Evol. 23, 2423-2433 (2006).
- Marin, I. Ancient origin of the Parkinson disease gene LRRK2. J Mol Evol. 67, 41-50 (2008).
- Lobbestael, E., Baekelandt, V., Taymans, J. M. Phosphorylation of LRRK2: from kinase to substrate. Biochem Soc Trans. 40, 1102-1110 (2012).
- Gloeckner, C. J., et al. Phosphopeptide Analysis Reveals Two Discrete Clusters of Phosphorylation in the N-Terminus and the Roc Domain of the Parkinson-Disease Associated Protein Kinase LRRK2. J Proteome Res. 9, 1738-1745 (2010).
- Nichols, R. J., et al. 14-3-3 binding to LRRK2 is disrupted by multiple Parkinson's disease-associated mutations and regulates cytoplasmic localization. Biochem J. 430, 393-404 (2010).
- Greggio, E., et al. Mutations in LRRK2/dardarin associated with Parkinson disease are more toxic than equivalent mutations in the homologous kinase LRRK1. J.Neurochem. 102, 93-102 (2007).
- Taymans, J. M. LRRK2 Kinase Activity Is Dependent on LRRK2 GTP Binding Capacity but Independent of LRRK2 GTP Binding. PLoS One. 6, 23207-23 (2011).
- Daniëls, V. Insight into the mode of action of the LRRK2 Y1699C pathogenic mutant. J Neurochem. 116, 304-315 (2011).
- Civiero, L. Biochemical characterization of highly purified leucine-rich repeat kinases 1 and 2 demonstrates formation of homodimers. PLoS One. 7, e43472 (2012).
- Taymans, J. M., Van den Haute, C., Baekelandt, V. Distribution of PINK1 and LRRK2 in rat and mouse brain. J.Neurochem. 98, 951-961 (2006).
- Lewis, P. A. Assaying the kinase activity of LRRK2 in vitro. J Vis Exp. , (2012).
- Lobbestael, E. Immunohistochemical detection of transgene expression in the brain using small epitope tags. BMC Biotechnol. 10, 16 (2010).
- Davies, P., et al. Comprehensive Characterization and Optimization of Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) Monoclonal Antibodies. Biochem J. , (2013).
- West, A. B. Parkinson's disease-associated mutations in LRRK2 link enhanced GTP-binding and kinase activities to neuronal toxicity. Hum.Mol.Genet. 16, 223-232 (2007).
- Sheng, Z., et al. Ser1292 autophosphorylation is an indicator of LRRK2 kinase activity and contributes to the cellular effects of PD mutations. Sci Transl Med. 4, 164ra161 (2012).
- Li, X., et al. Phosphorylation-dependent 14-3-3 binding to LRRK2 is impaired by common mutations of familial Parkinson's disease. PLoS One. 6, e17153 (2011).
- Dzamko, N., et al. Inhibition of LRRK2 kinase activity leads to dephosphorylation of Ser(910)/Ser(935), disruption of 14-3-3 binding and altered cytoplasmic localization. Biochem J. 430 (910), 405-413 (2010).