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Biology

Metabólica Rotulagem de Leucina rico Repita Kinases 1 e 2 com Radioactive Fosfato

Published: September 18, 2013 doi: 10.3791/50523
Automatic Translation
1, 1, 1
1Laboratory for Neurobiology and Gene Therapy, Department of Neurosciences, KU Leuven and Leuven Institute for Neuroscience and Disease (LIND)

Summary

Leucina repetição rica quinases 1 e 2 (e LRRK1 LRRK2) são proteínas de vários domínios que codificam tanto GTPase e domínios cinase e que são fosforiladas em células. Aqui, apresentamos um protocolo para rotular LRRK1 e LRRK2 em células com 32 P-ortofosfato, proporcionando assim um meio para medir seus níveis gerais de fosforilação celular.

Abstract

Leucina repetição rica quinases 1 e 2 (e LRRK1 LRRK2) são parálogos que partilham uma organização do domínio semelhante, incluindo um domínio de serina-treonina cinase, um complexo de Ras de proteínas de domínio (ROC), um C-terminal do domínio ROC (CR), e repetições de anquirina-como no N-terminal rica em leucina e. As funções celulares precisas de LRRK1 e LRRK2 ainda tem de ser esclarecida, no entanto LRRK1 tem sido implicada na sinalização do receptor de tirosina-quinase de 1,2, enquanto LRRK2 está implicada na patogénese da doença de Parkinson 3,4. Neste relatório, apresentamos um protocolo para identificar as proteínas LRRK1 e LRRK2 em células com 32 P-ortofosfato, proporcionando assim um meio para medir os níveis globais de fosforilação destas duas proteínas nas células. Em resumo, proteínas marcadas com afinidade LRRK são expressos em células HEK293T, que estão expostos a meio contendo 32 P-ortofosfato. A 32 P-ortofosfato é assimilado pelas células depois de apenas algunshoras de incubação e todas as moléculas na célula contendo fosfatos são, assim, marcado radioactivamente. Através da etiqueta de afinidade (3xflag) as proteínas LRRK são isolados a partir de outros componentes celulares por imunoprecipitação. Os imunoprecipitados são então separados por meio de SDS-PAGE, transferido para membranas de PVDF e análise dos fosfatos incorporados é realizada por auto-radiografia (32 sinal P) e de detecção de western (sinal de proteína) das proteínas sobre as manchas. O protocolo pode ser facilmente adaptado para monitorar a fosforilação de qualquer outra proteína que pode ser expresso em células e isolado por imunoprecipitação.

Introduction

Leucina rico repetição quinases 1 e 2 (LRRK1 e LRRK2) são parálogos vários domínios que partilham uma organização de domínio semelhante. Ambas as proteínas de codificar uma sequência de GTPase semelhante à família Ras de GTPases (Ras de proteínas complexas, ou ROC), bem como um C-terminal do domínio ROC (CR), de forma eficaz classificando ambas as proteínas para a família de proteínas ROCO 5,6. N-terminal do domínio em tandem ROC-COR, ambas as proteínas codificar um domínio de repetição rica em leucina, bem como um domínio de anquirina semelhante, ao passo que apenas LRRK2 codifica um tatu adicional Domein 6-8. C-terminal de ROC-COR, ambas as proteínas partilham um domínio de cinase de serina-treonina, enquanto apenas LRRK2 codifica um domínio WD40 na região C-terminal 8. As funções celulares precisas de LRRK1 e LRRK2 ainda tem de ser esclarecida, no entanto LRRK1 tem sido implicada na sinalização do receptor de tirosina-quinase de 1,2, enquanto que a evidência genética aponta para um papel para LRRK2 na patogénese da doença de Parkinson 3,4.

9-11. Embora LRRK1 locais de fosforilação celular ainda tem de ser mapeada, evidências a partir de estudos utilizando coloração fosfoproteína de manchas de proteína LRRK1 imunoprecipitada a partir de células COS7 sugere que a proteína LRRK1 é fosforilado nas células 12.

Este documento fornece um protocolo básico para ensaio geral do nível de fosforilação LRRK1 e LRRK2 em linhagens de células usando marcação metabólica com 32 P-ortofosfato. A estratégia global é simples. Afinidade marcado LRRK proteins são expressos em células HEK293T, que estão expostos a meio contendo 32 P-ortofosfato. A 32 P-ortofosfato é assimilada pelas células depois de apenas algumas horas de incubação e todas as moléculas na célula contendo fosfatos são, assim, marcado radioactivamente. O marcador de afinidade (3xflag) é então usado para isolar as proteínas LRRK de outros componentes celulares por imunoprecipitação. Os imunoprecipitados são então separados por meio de SDS-PAGE, transferido para membranas de PVDF e análise dos fosfatos incorporados é realizada por auto-radiografia (32 sinal P) e de detecção de western (sinal de proteína) das proteínas sobre as manchas.

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Protocol

O presente protocolo utiliza radioativo 32 ortofosfato marcado com P de seguir fosforilação celular de LRRK2. É importante ter em mente que todas as operações com reagentes radioativos deve ser realizada através de medidas de protecção adequadas para minimizar a exposição da radiação radioativa para o operador e para o ambiente. Compostos contendo isótopos que emitem radiação ionizante pode ser prejudicial para a saúde humana e licenciamento rigoroso e regulamentos em um controle de nível institucional e nacional o seu uso. Os experimentos deste protocolo foram realizados após o treinamento no uso da radiação de fonte aberta na Katholieke Universiteit Leuven (Leuven KU) e seguir as orientações de boas práticas de laboratório previstos pelo departamento de saúde, segurança e meio ambiente na universidade. Vários passos em nosso protocolo são amplamente utilizados, tais como cultura de células, SDS-PAGE, Western blot e dado aqui estão detalhes do protocolo aplicada em nosso laboratório. Éhould-se notar que as condições experimentais precisos variar de laboratório para laboratório; medidas, portanto, específicas para garantir tratamento adequado de material radioativo deve ser adaptada a cada novo ambiente de laboratório.

O uso de radiação de fonte aberta está sujeita à aprovação regulatória antes eo organismo regulador responsável por radiação open source em pesquisas de laboratório varia de país para país. Os usuários devem consultar o seu agente de segurança de radiação institucional, a fim de garantir que os procedimentos estão em conformidade com as normas e regulamentos locais. Informações sobre os órgãos reguladores podem ser encontrados: na Bélgica, a Agência Federal de Controle Nuclear ( http://www.fanc.fgov.be , o site em francês ou holandês), no Reino Unido, o Health and Safety Executive ( http: / / www.hse.gov.uk / radiação / ionizante / index.htm ), nos Estados Unidos, o NucComissão Reguladora lear ( http://www.nrc.gov/materials/miau/regs-guides-comm.html ), no Canadá, a Comissão Canadense de Segurança Nuclear ( http://nuclearsafety.gc.ca/eng/ ) e na Alemanha Das Bundesamt für Strahlenschutz ( http://www.bfs.de/de/bfs ). Precauções de segurança relevantes para este protocolo ter sido observado no texto, destacados com o símbolo trifólio radioativo ( Rad Símbolo ).

1. Rotulagem metabólica das células

  1. Preparar as células para rotulagem.
    1. Linhas de células de cultura de acordo com HEK293T condições de cultura padrão (37 ° C, 5% CO 2) em DMEM com 8% de soro fetal de vitelo e gentamicina.
    2. Expandir células suficientemente paraobter pelo menos 1 x 10 6 células por amostra para testar.
    3. Tripsinizar as células e prato para fora em 6 placas de poços (35 mm de diâmetro) em 10 6 células / poço.
    4. 24 horas após o plaqueamento para fora das células, expressar a proteína 3xflag-LRRK2 via transfecção ou lentiviral vetor transdução mediada.
      1. Para a transfecção, por exemplo mistura de 4 ug de ADN (pCHMWS-3xflag-LRRK2 plasmídeo 13-15 ou pCHMWS-3xflag-LRRK1 plasmídeo 15) e 8 mL de polietilenoimina linear (PEI linear, de 1 mg / ml) em 80 mL de DMEM (sem adições ). Deixa-se complexo de 15-30 min, em seguida, adicionar complexo de células, misturando bem na presente médio.
      2. Para vetor mediada transdução lentiviral, diluir lentiviral vetor codificação 3xflag-LRRK1 ou -2 (LV-3xflag-LRRK1, LV-3xflag-LRRK2, como regra geral, a transdução com o dobro de unidades de transdução, ou seja, número de partículas de vetores funcionais, de lentivector como existem células) para o meio de cultura. A descrição do produto ião de VE-3xflag-LRRK1 / 2 foi anteriormente descrito 15.
    5. Quando as células são 80-100% confluentes (aproximadamente 48 horas após a transfecção ou transdução), lavar as células com pré-aquecido (37 ° C) de DMEM sem fosfatos.
  2. Células etiqueta com 32 P-orto-fosfato.
    1. Tenha em mente os princípios gerais de segurança quando se trabalha com radiação.
      1. Rad Símbolo Realize todas as operações com 32 P em uma área designada radiação.
      2. Rad Símbolo Equipamento de protecção individual adequado deve ser usado - sob procedimento operacional padrão em nosso laboratório que incluem jaleco, luvas duplas e óculos de proteção.
      3. g "src =" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> Todos os trabalhos com 32 P deve ser protegido contra a usuários por 6 telas mm Perspex para minimizar a exposição.
      4. Rad Símbolo Dispositivos de monitorização individual deve sempre ser usado - dentro KUL todo usuário certificado radiação open source usa um crachá filme anexado ao bolso do peito do casaco de laboratório para monitorar a exposição à radiação durante as experiências.
      5. Rad Símbolo Todas as superfícies experimentais devem ser avaliados para a radioactividade, antes e após o uso com um contador Geiger.
      6. Rad Símbolo Todos os materiais de consumo potencialmente contaminados devem ser eliminados em estrita observância às diretrizes institucionais para raeliminação de resíduos dioactive.
    2. Sob um fluxo laminar, preparar um tubo Falcon com 2,1 ml de DMEM sem fosfatos (pré-aquecido a 37 ° C) por 6 cavidades da placa de células à etiqueta.
      1. Por exemplo, para células de etiquetas em todos os poços de uma placa de 6 poços, preparar 12,6 ml de meio (6 x = 2.1). Isto é para proporcionar 2 ml de meio a ser utilizado por 6 cavidades bem placa de células com um excesso de 5% em volume.
    3. Rad Símbolo Prepare o banco no qual as experiências com radiação ionizante será executada. O espaço de trabalho é coberto por um tapete de derramamento na qual uma camada protectora de material absorvente é colocada. No caso de você estiver usando uma camisa com uma superfície impermeável, coloque-o com o lado absorvente para cima.
    4. Rad Símbolo Também prevêum frasco Perspex no espaço de trabalho e colocar o tubo de meio livre de fosfato na mesma.
    5. Rad Símbolo Leve o recipiente forrado de chumbo, com o frasco de 32 ortofosfato P marcado fora da geladeira e trazê-lo para o banco radioatividade. Monitorar o recipiente para a contaminação radioactiva externa usando um contador Geiger.
    6. Rad Símbolo Dilui-se 32 P-ortofosfato marcado para o tubo de DMEM sem fosfatos, a uma concentração de 24 ^ Ci / ml.
      1. Nota: a 2 ml por placa de 6 poços bem de células, o que corresponde a 5 uCi 32 P-ortofosfato marcado / cm 2 de células cultivadas.
      2. Rad Símbolo Mantero tubo no frasco Perspex.
    7. Rad Símbolo Fechar o recipiente com o restante do 32 P-ortofosfato marcado e substitua no frigorífico.
    8. Rad Símbolo Retire as placas de 6 poços com células a serem rotulados da incubadora e lugar no banco de radioatividade.
    9. Rad Símbolo Remover o sobrenadante médio e descarte. Adicionar 2 ml de meio isento de fosfato contendo 32 P-ortofosfato marcado / poço.
    10. Rad Símbolo Coloque as placas de cultura em uma caixa de perspex, em seguida, monitorar o recipiente for contaminação radioactiva externa usando um contador Geiger.
    11. Rad Símbolo Transfira a caixa de perspex com células de uma incubadora de célula eucariótica dedicada a marcação metabólica isotópica.
    12. Rad Símbolo Incubar durante 1-20 hr a 37 ° C em 5% de CO 2.
      1. Em geral, um tempo de integração de 3 horas ou mais é aconselhável. O tempo de incubação ideal pode ser avaliada através de experimentos do curso de tempo para cada proteína específica se o desejar.
    13. Rad Símbolo Opcional: o tratamento de células com o composto.
      1. Em experiências com tratamento com o composto (tal como um inibidor de quinase), uma etapa de tratamento com o composto é incluído após uma emitial tempo de incubação sem composto para permitir a etiquetagem. Após o tempo de incubação desejado, a caixa de Perspex contendo as placas de cultura são removidas da incubadora e trazido para o banco de radioactividade.
      2. Rad Símbolo Etiquetagem meio é removido e substituído por meio isento de fosfato de pré-aquecido em que o composto é diluído para a concentração desejada. Descartar meio num tubo de 50 mL para a recolha de resíduos, que é colocada no frasco de perspex.
      3. Rad Símbolo As células são substituídas na caixa perspex e colocadas na incubadora de células durante o tempo de contacto desejado.
  3. Rad Símbolo Colete lisados ​​de labecélulas levaram.
    1. Rad Símbolo Remova o meio a partir de células e descarte para dentro do tubo de recolha de resíduos, que é colocada no frasco de perspex.
    2. Rad Símbolo Enxaguar as células 2x com gelo TBS gelado (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4, 2 ml / lavagem), descartando solução de lavagem para um tubo de recolha de lixo colocado no frasco de perspex.
    3. Rad Símbolo Adicionar 0,5 mL de gelo frio de tampão de lise de imunoprecipitação (IP) a cada poço e recolher lisado por pipetagem para cima e para baixo ligado a fim de desapertar todas as células sofreram lise.
      1. Prepare o volume requerido de tampão de lise de IP (0,5 ml / amostra, mais 5% de excesso), antes do tempo, a adição do cocktail de inibidores de protease e fosfatasecocktail inibidor fresco imediatamente antes da utilização.
      2. A composição do tampão de lise é de Tris 20 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, Triton a 1%, glicerol 10%, cocktail inibidor de protease e inibidores de fosfatase coquetel.
    4. Rad Símbolo Transferir o lisado para um tubo de microcentrífuga e incubar em gelo durante pelo menos 10 min.
    5. Rad Símbolo Centrifugar os lisados ​​em uma microcentrífuga a> 5000 g durante 10 min.
    6. Rad Símbolo Descarte de resíduos radioactivos nos caixotes do lixo dedicados que são armazenados atrás de escudos Perspex.

2. Analisar Rotulagem de proteínas de interesse

  1. Rad Símbolo Isolar proteína de interesse por imunopurificação (IP).
    1. Rad Símbolo Transfira os microtubos com lisados ​​centrifugadas volta ao gelo e pipetar o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga contendo 10 mL de volume do leito de esferas de agarose equilibrada flag-M2.
      1. Prepare os tubos com equilibrada contas de agarose flag-M2 antes do tempo.
      2. Para isso, pipetar um volume de flag-M2 lama agarose correspondente a 10 mL de volume do leito por amostra, mais um excesso de 5%.
        1. Geralmente, um volume de leito de 10 ul de contas corresponde a 20 lama ul. Consulte a folha de dados do produto para obter mais detalhes.
      3. Equilibrar as esferas por lavagem 3x em 10 volumes (relativamente ao volume de leito) de tampão de lise de IP.
      4. Distribuir contas equilibradas uniformemente em 10 mL de volume do leito / tubo em tantos tubos, pois há amostras. Rotular os tubos com um identificador para cada amostra.
    2. Rad Símbolo Transfira os microtubos para tubos de 50 ml (cerca de 6 microcentrifuge tubes/50 tubo ml) marcado com um símbolo trifólio radioativo e manter em gelo.
    3. Rad Símbolo Amostras de transferência para um dispositivo rotativo por trás de um escudo Perspex na área designada de uma sala fria para final sobre a extremidade mistura a 4 ° C por 1-20 horas.
    4. Rad Símbolo Transferir as amostras para um espaço de trabalho designada em gelo.
    5. 50523rad1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> Girar a proteína ligada contas de agarose flag-M2 em uma microcentrífuga (1.000 x g, 1 min) e descartar o sobrenadante para um tubo de coleta de resíduos.
    6. Rad Símbolo Lave as proteína ligada bandeira-M2-agarose por ressuspensão em 1 ml de tampão de lavagem IP.
      1. Composição do tampão de lavagem de IP: Tris 25 mM pH 7,5, NaCl 400 mM, Triton a 1%. Recomenda-se também incluir inibidores de protease e fosfatase no tampão de lavagem para proteínas sensíveis a degradação por proteases de co-purificação ou a desfosforilação de fosfatases de co-purificação.
      2. Rad Símbolo Girar as proteínas obrigado flag-M2-agarose em uma microcentrífuga (1.000 xg, 1 min) e descartar o sobrenadante para um coleta resíduostubo ção.
      3. Rad Símbolo Repita o 3x etapa de lavagem.
    7. Rad Símbolo Após as lavagens, voltar a suspender as pérolas em 1 ml de tampão de lavagem de IP (25 mM Tris pH 7,5, MgCl2 10 mM, ditiotreitol (DTT) 2 mM, Triton a 0,02%, beta-glicerofosfato 5 mM, Na 3 VO 4 a 0,1 mM).
    8. Rad Símbolo Girar as proteínas ligadas contas de agarose flag-M2 em uma microcentrífuga (1.000 xg, 1 min) e descartar o sobrenadante para um tubo de coleta de resíduos. Remova todo o excesso de buffer.
    9. Rad Símbolo Contas Ressuspender em 40 & mu; l de tampão de amostra de SDS carga IP (mM Tris-HCl pH 160 6,8, SDS a 2%, DTT 0,2 M, glicerol 40%, azul de bromofenol a 2 mg / ml).
      1. As amostras podem ser analisadas imediatamente ou armazenado em um congelador de -20 ° C para posterior análise.
        1. Rad Símbolo Para o armazenamento de amostras a -20 ° C amostras, colocar em suportes de tubos ou caixas em uma caixa de perspex em um símbolo de trevo congelador rotulado radioativo dedicado para armazenamento de amostras radioativas.
    10. Rad Símbolo Descarte de resíduos radioactivos nos caixotes do lixo dedicados que são armazenados atrás de escudos Perspex.
  2. Rad Símbolo Resolver amostras IP via SDS-PAGE e blot para membrana de PVDF.
    1. Rad Símbolo Amostras de calor em tampão de carga a 95 ° C durante 2 min e centrifuga-se durante 1 min a> 1000 x g para sedimentar as pérolas.
    2. Rad Símbolo Prepare o módulo de electroforese em gel de proteínas no banco radioactividade por trás de um ecrã de Perspex.
    3. Rad Símbolo Carregar as amostras para um tris-acetato 3-8% de gel SDS-PAGE.
      1. Este tipo de gel é adequado para a resolução de elevado peso molecular (HMW) de proteínas. Outros tipos de gel podem também ser adequados, tais como 4-20% Bis-Tricina ou gel de Tris-glicina 4-20% de gel.
      2. Incluem um marcador de peso molecular, que é adequado para distinguir os tamanhos das proteínas HMW.
      4. <li> Rad Símbolo Realizar electroforese a 150 V durante 1 hora.
    4. Rad Símbolo Após a electroforese, o gel sobre o revestimento de plástico e transferir o gel para um recipiente com um tampão de transferência de Western Blot.
      1. Composição do tampão de transferência de Western Blot: Tris 50 mM, glicina 40 mM, SDS a 0,04%, metanol 20%.
      2. Rad Símbolo Corte as partes do gel, que se destacam como os separadores bem e parte inferior do gel, que se destaca.
    5. Preparar um fluoreto de polivinilideno (PVDF) por membrana de gel por meio de imersão em metanol, durante 1 minuto, em seguida, colocar em tampão de transferência.
      1. As membranas são cortadas para as s tamanho ame como o gel acrescido de uma margem de 3 mm.
    6. Coloque um módulo de transferência semi-seco no banco de radioatividade e retire a tampa e placa de eletrodo superior.
    7. Rad Símbolo Prepare o sanduíche absorvente sobre a superfície do módulo de transferência semi-seco.
      1. Molhe um extra grosso (2,5 mm de espessura, 7,5 cm de largura x 10) absorvente filtro em tampão de transferência e lugar na placa inferior do módulo blotting.
      2. Rad Símbolo Colocar a membrana de PVDF pré-molhado no filtro blotting.
      3. Rad Símbolo Com cuidado, coloque o gel sobre a membrana PVDF e remover as bolhas de ar.
      4. 523/50523rad1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> Preencher o sanduíche blot molhando um filtro de mancha extra grosso em tampão de transferência e coloque sobre a placa inferior do módulo de mata-borrão. Remova todo o ar bolhas eventualmente presentes no sanduíche borrar.
        Por favor note que a descrição dada aqui é compatível com o sistema de trans-blot SD BioRad onde os eléctrodos são de tal modo que as proteínas migram para baixo sobre a membrana. Outros sistemas de blotting também são compatíveis com estes passos, com pequenas adaptações, tais como aqueles eventualmente necessário para ter em conta outra direcção absorvente ou, no caso de hibridação do tanque, os resíduos líquidos extra para ser descartado da mesma maneira que o tampão de electroforese acima.
    8. Rad Símbolo Remova todo o excesso de tampão com um papel absorvente e coloque a placa superior ea tampa do semi-d ry borrando módulo.
    9. Rad Símbolo Proteínas de transferência em 15 V para 1-2 horas.
    10. Rad Símbolo Durante este tempo, limpar o módulo de electroforese.
      1. Rad Símbolo Descarte de resíduos radioactivos nos caixotes do lixo dedicados que são armazenados atrás de escudos Perspex.
      2. Rad Símbolo Lavar o módulo de eletroforese com água destilada (AD) e descartar a água de lavagem de o recipiente de resíduos radioactivos líquidos.
    11. 0523/50523rad1.jpg "/> Após a transferência, retire a membrana de PVDF com proteínas riscado do módulo blotting.
    12. Rad Símbolo Opcional: realizar uma coloração Ponceau S de proteínas secas para visualizar proteínas.
      1. Rad Símbolo Transferir a mancha a um vaso de incubação mancha superficial contendo solução Ponceau S e incubar durante 5 min.
      2. Rad Símbolo Lavar 2x rapidamente em AD.
    13. Rad Símbolo Seca-se a membrana.
  3. / Files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> Executar auto-radiografia.
    1. Rad Símbolo Expor a membrana a uma placa de fosforescência para 1-5 dias.
    2. Rad Símbolo Leia o 32P fora da placa fosforescência exposto usando um scanner de fosforescência Tempestade 840 ou equivalente e salvar a imagem como um tiff alta resolução.
  4. Rad Símbolo Detectar os níveis de proteína por meio de imunodetecção.
    1. Rad Símbolo Reidratar as membranas mergulhando-as brevemente em metanol, em seguida, transferir para um recipiente de incubação blot rasa com PBS. Rad Símbolo Bloquear as membranas em PBS-T (PBS com 0,1% de Triton) contendo 5% de leite.
    2. Rad Símbolo Incubar as manchas com o anticorpo anti-LRRK2 13,16 ou anticorpo anti bandeira eo processo ainda mais com as etapas de lavagem apropriadas e incubação do anticorpo secundário.
    3. Rad Símbolo Realizar a detecção de quimiluminescência para confirmar os níveis de proteína relativos de LRRK2.
  5. Quantificar a incorporação de 32 P em LRRK2.
    1. Realizar análise densitométrica das bandas nas autoradiogramas blot e imuno utilizando software apropriado, como software ImageJ, um programa gratuito disponível no Instit Nacionalutes do site Saúde ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ).
    2. Calcular os níveis de incorporação de fosfato, como o rácio entre o sinal auto-radiográfico sobre o nível de imunorreactividade.

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Representative Results

A fim de comparar os níveis globais de fosforilação de LRRK1 e LRRK2 nas células, 3xflag marcado LRRK1 e LRRK2 foram expressos em células HEK293T 15. As células foram cultivadas em placas de 6 poços e marcado com 32 P e analisados ​​como descrito acima no texto do protocolo. Figura 1 mostra os resultados representativos para a marcação metabólica das LRRK1 e LRRK2 em células HEK293T. Incorporação de fosfato radioactivo é observada tanto para LRRK1 e LRRK2. Após a quantificação dos níveis de 32 P normalizadas para os níveis de proteína como medido pela análise densitométrica da imunodetecção com o anticorpo anti-flag, verificou-se que LRRK1 teve um nível médio de fosforilação que é menor do que LRRK2 sob as condições testadas, embora a significância estatística é não atingiu (P> 0,05).

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Figura 1. Marcação metabólica de LRRK1 e LRRK2. A. LRRK1 LRRK2 e expresso em células HEK293T foram metabolicamente marcadas com 32 P tal como descrito no protocolo e resulta secções. É descrita aqui são autoradiogramas representativos (painel superior) da incorporação de 32 P, bem como Western blot representativos (painel inferior) de LRRK1 e detecção LRRK2 via suas marcas 3xflag. B. Quantificação da marcação metabólica comparativo de LRRK1 e LRRK2 (N = 4).

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Discussion

Este documento fornece um protocolo básico para ensaio geral do nível de fosforilação LRRK1 e LRRK2 em linhagens de células usando marcação metabólica com 32 P-ortofosfato. A estratégia global é simples. Afinidade proteínas marcadas LRRK são expressos em células HEK293T, que são expostos a meio contendo 32 P-ortofosfato. A 32 P-ortofosfato é assimilada pelas células depois de apenas algumas horas de incubação e todas as moléculas na célula contendo fosfatos são, assim, marcado radioactivamente. O marcador de afinidade (3xflag) é então usado para isolar as proteínas LRRK de outros componentes celulares por imunoprecipitação. Os imunoprecipitados são então separados por meio de SDS-PAGE, transferido para membranas de PVDF e análise dos fosfatos incorporados é realizada por auto-radiografia (32 sinal P) e de detecção de Western (sinal de proteína) das proteínas sobre as manchas. Este protocolo deve ser distinguido do protocolo para medir au LRRK2tophosphorylation 17 em que a marcação de LRRK1 ou LRRK2 é realizada em culturas de células, em vez de numa reacção de fosforilação in vitro com proteínas purificadas.

Deve notar-se que o protocolo detalhado aqui apresentados podem ser ajustados para acomodar várias variações, dependendo das necessidades experimentais. Por exemplo, tal como a rotulagem é eficiente na maioria das linhas celulares de laboratório comuns, este protocolo não se restringe ao uso da linha celular HEK293T. Além disso, outros marcadores de afinidade pode ser usado como uma alternativa para 3xflag, tais como HA, myc, V5, GFP ou outras marcações 18 que múltiplos marcadores podem ser utilizados para LRRK1 eficientemente imunoprecipitado ou LRRK2. No caso de um anticorpo específico para a proteína está disponível para a proteína que é adequado para a imunoprecipitação, como é o caso para LRRK2 11, isto pode ser implementado assim. Com um anticorpo específico para a proteína de grau imunoprecipitação, é também possível realizar a marcação metabólica das LRRKproteínas endogenamente expresso em linhas celulares. No caso de LRRK2, vários anticorpos monoclonais foram descritas, que podem imunoprecipitação de LRRK2 endógena 19. Finalmente, o protocolo de marcação metabólica, descrita aqui para LRRK1 LRRK2 e também pode ser adaptada a qualquer outra proteína que pode ser imunoprecipitada a partir de linhas de células utilizando a estratégia geral descrita acima.

Um elemento-chave antes de realizar a marcação metabólica das proteínas em cultura celular é como esta técnica se compara com outros métodos disponíveis para determinar a fosforilação de proteínas celulares. Por exemplo, a fosforilação em locais específicos pode ser monitorizada por imunotransferência utilizando um anticorpo específico de fosfo. Este método segue passos semelhantes aos descritos aqui, com excepção das etapas de rotulagem isotópica, e por esta razão, esta técnica é geralmente favorecida sobre a marcação metabólica com 32 P-ortofosfato, quando ele está disponível. Marcação metabólica com 32 P-ortofosfato fornece um sinal que é representativo do estado geral de fosforilação da proteína, pelo que não podem fornecer informação sobre a fosforilação de locais específicos. Para as proteínas com vários locais de fosforilação, tal como é o caso para LRRK2 10,11, a técnica de marcação metabólica fornece uma avaliação de um passo do nível global de fosforilação que podem determinar com anticorpos fosfo-especificos apenas pendentes múltiplas etapas de imunodetecção. Por exemplo, LRRK2 é altamente fosforilada na sua região entre domínios ANK-LRR, ou seja, os S910/S935/S955/S973 11,20 sítios, bem como em outras regiões 10, incluindo o sítio S1292 recentemente caracterizado 21. A fim de dissecar os papéis de phosphosites individuais, recomenda-se preferir as experiências com anticorpos específicos phosphosite. Por exemplo phosphosite anticorpos específicos têm permitido discernir que os phosphosites S910/S935/S955/S973 são desfosforilard em vários mutantes patogénicos, tais como R1441C / L, Y1699C, I2020T, mas não nos G2019S 11,22, enquanto que as formas mutantes de doenças LRRK2 mostram geralmente níveis mais elevados de fosfo-S1292 21. No entanto, a marcação metabólica são úteis para uma série de outros estudos de fosforilação celular. Marcação metabólica é sempre uma técnica aplicável, por exemplo, em casos de sítios de fosforilação desconhecidos, ou quando-anticorpos fosfo não estão disponíveis ou de baixa sensibilidade. Finalmente, a marcação metabólica permite comparar os níveis globais de fosforilação de proteínas diferentes (como mostrado comparando os níveis de fosforilação celular de LRRK1 e LRRK2, figura 1), um comparador, que é difícil de fazer com anticorpos específicos de phosphosite dadas as diferenças na sensibilidade de um anticorpo para outro .

Em conclusão, o presente protocolo permite a avaliação eficiente dos níveis de fosforilação de proteínas totais LRRK em células. O protocolo pode ser facilmente adaptada para monitorarfosforilação de qualquer outra proteína que pode ser expresso em células e isolado por imunoprecipitação. O uso deste protocolo é recomendado quando anticorpos específicos para phosphosite não estão disponíveis para a proteína em estudo ou como um passo em sua validação. Este protocolo é especialmente útil quando o objectivo é experimental para comparar fosforilação global de duas ou mais proteínas diferentes, tais comparações, através de marcação metabólica não são influenciados por diferenças na sensibilidade de detecção de fosforilação de uma proteína para outra. Especificamente para LRRK1 e LRRK2, esta técnica pode ser utilizada para monitorizar as alterações comparativamente actividade dependentes da fosforilação de LRRK1 e LRRK2, dado que tais alterações tenham começado a ser descrito para LRRK2 11,13,23, enquanto LRRK1 regulação da fosforilação é mal compreendida.

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Disclosures

Autores têm nada a revelar.

Acknowledgments

Também somos gratos à Fundação Michael J. Fox apoiar este estudo. Agradecemos à Fundação de Pesquisa - Flandres FWO (projeto FWO G.0666.09, companheirismo pesquisador sênior para JMT), o projeto Neuro-TARGET navegação fluvial SBO/80020, a KU Leuven (OT/08/052A e IOF-KP/07 / 001) por seu apoio. Esta pesquisa também foi apoiado em parte pelo Fundo Druwé-Eerdekens geridos pela Fundação Rei Balduíno para JMT.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphorus-32 Radionuclide, 1 mCi, buffer disodiumphosphate in 1 ml water Perkin Elmer NEX011001MC
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (D-MEM) (1X), liquid (high glucose) Invitrogen 11971-025 This medium contains no phosphates
Anti Flag M2 affiinty gel Sigma A2220 For an equivalent product with red colored gel (useful to more easily visualize the beads), use cat. No. F2426.
Extra thick blotting filter Bio-Rad 1703965
Ponceau S solution Sigma P7170

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Metabólica Rotulagem de Leucina rico Repita Kinases 1 e 2 com Radioactive Fosfato
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Taymans, J. M., Gao, F., Baekelandt, V. Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate. J. Vis. Exp. (79), e50523, doi:10.3791/50523 (2013).

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