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Biology

Metabolische Markierung von Leucin Rich-Repeat-Kinasen 1 und 2 mit radioaktivem Phosphat

Published: September 18, 2013 doi: 10.3791/50523
Automatic Translation
1, 1, 1
1Laboratory for Neurobiology and Gene Therapy, Department of Neurosciences, KU Leuven and Leuven Institute for Neuroscience and Disease (LIND)

Summary

Leucin-reichen Repeat-Kinasen 1 und 2 (LRRK1 und LRRK2) sind Multidomänen-Proteine, die sowohl GTPase und Kinase-Domänen kodieren, und die in Zellen phosphoryliert sind. Hier präsentieren wir ein Protokoll zur LRRK1 und LRRK2 in Zellen mit 32 P-Orthophosphat zu kennzeichnen, wodurch ein Mittel, um ihre Gesamtzell Phosphorylierung zu messen bietet.

Abstract

Leucin-reichen Repeat-Kinasen 1 und 2 (LRRK1 und LRRK2) Paraloge, die eine ähnliche Domänenorganisation zu teilen, die eine Serin-Threonin-Kinasedomäne, einem Ras komplexer Proteine ​​Domain (ROC), einer C-terminalen Domäne des ROC (COR), und Leucin-reichen und Ankyrin-Repeats, wie am N-Terminus. Die genaue Rolle der zellulären LRRK1 und LRRK2 müssen noch aufgeklärt werden, aber LRRK1 in Tyrosinkinase-Rezeptor-Signal 1,2 gebracht worden, während LRRK2 in der Pathogenese von Parkinson-Krankheit 3,4 gebracht. In diesem Bericht stellen wir ein Protokoll, um die LRRK1 und LRRK2-Proteine ​​in Zellen, die mit 32 P-Orthophosphat zu kennzeichnen, wodurch ein Mittel, um die Gesamt Phosphorylierung dieser 2-Proteine ​​in Zellen zu messen bietet. Kurz, getaggt Affinität LRRK Proteine ​​in HEK293T Zellen, die Medium mit 32 P-Orthophosphat ausgesetzt sind, zum Ausdruck gebracht. Die 32 P-Orthophosphat von den Zellen assimiliert nach wenigenStunden Inkubation und alle Moleküle in der Zelle, die Phosphate sind dabei radioaktiv markiert. Über die Affinitätsmarkierung (3xflag) die LRRK Proteine ​​von anderen zellulären Komponenten durch Immunpräzipitation isoliert. Immunpräzipitate werden dann über SDS-PAGE aufgetrennt, auf PVDF-Membranen und Analyse der enthaltenen Phosphate durch Autoradiographie (32 P-Signal) und Western-Detektion (Protein-Signal) der Proteine ​​auf den Blots durchgeführt. Das Protokoll kann leicht angepasst werden, um die Phosphorylierung von einem anderen Protein, das in Zellen exprimiert wird und durch Immunpräzipitation isoliert werden kann, zu überwachen.

Introduction

Leucin rich repeat-Kinasen 1 und 2 (LRRK1 und LRRK2) sind Multidomänen-Paralogen, die eine ähnliche Domäne Organisation teilen. Beide Proteine ​​kodieren, eine GTPase Sequenz ähnlich der Ras-Familie von GTPasen (Ras komplexer Proteine ​​oder ROC) sowie einen C-terminalen Domäne des ROC (COR), effektiv Klassifizieren beide Proteine ​​an den Proteinfamilie ROCO 5,6. N-Terminus der ROC-COR Domain Tandem, beide Proteine ​​kodieren ein Leucin-reichen Repeat-Domäne sowie eine Ankyrin-ähnlichen Domäne, während nur LRRK2 kodiert eine zusätzliche Gürteltier domein 6-8. C-Terminus der ROC-COR, beide Proteine ​​teilen eine Serin-Threonin-Kinase-Domäne, während nur LRRK2 kodiert ein WD40-Domäne in der C-terminalen Region 8. Die genaue Rolle der zellulären LRRK1 und LRRK2 müssen noch aufgeklärt werden, aber LRRK1 in Tyrosinkinase-Rezeptor-Signal 1,2 gebracht worden, während die genetische Beweise deuten auf eine Rolle von LRRK2 in der Pathogenese von Parkinson-Krankheit 3,4.

9-11 gezeigt. Obwohl LRRK1 zellulären Phosphorylierungsstellen noch nicht abgebildet werden, Beweise aus Studien mit Phosphoprotein-Färbung von Blots von immun LRRK1 Protein aus COS7-Zellen legt nahe, dass LRRK1 Protein in Zellen phosphoryliert 12.

Dieses Papier stellt eine Basisprotokoll zum Testen von allgemeinen Phosphorylierung von LRRK2 LRRK1 und in Zelllinien unter Verwendung metabolische Markierung mit 32 P-Orthophosphat. Die Gesamtstrategie ist einfach. Affinity getaggt LRRK proteIns in HEK293T-Zellen, die einem Medium, das 32 ​​P-Orthophosphat ausgesetzt sind ausgedrückt. Die 32 P-Orthophosphat durch die Zellen bereits nach wenigen Stunden Inkubation und alle Moleküle in der Zelle, die Phosphate assimiliert werden dabei radioaktiv markiert. Der Affinitäts-Tag (3xflag) wird dann verwendet, um die LRRK Proteine ​​von anderen zellulären Komponenten durch Immunpräzipitation isoliert werden. Immunpräzipitate werden dann über SDS-PAGE aufgetrennt, auf PVDF-Membranen und Analyse der enthaltenen Phosphate durch Autoradiographie (32 P-Signal) und Western-Detektion (Protein-Signal) der Proteine ​​auf den Blots durchgeführt.

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Protocol

Die vorliegende Protokoll verwendet radioaktiven 32 P-markierten Orthophosphat, um zelluläre Phosphorylierung von LRRK2 folgen. Es ist wichtig, im Auge zu behalten, dass alle Operationen mit radioaktiven Reagenzien sollte unter Verwendung geeigneter Schutzmaßnahmen, um die Exposition von radioaktiver Strahlung an den Betreiber und die Umwelt zu minimieren, durchgeführt werden. Verbindungen, die Isotope, die ionisierende Strahlung aussenden können sich schädlich auf die menschliche Gesundheit und strengen Genehmigungs-und Verwaltungsvorschriften auf institutioneller und nationaler Ebene Kontrolle ihrer Verwendung. Die Experimente in diesem Protokoll wurden folgende Ausbildungs ​​in Open-Source-Strahlung Einsatz bei Katholieke Universiteit Leuven (KU Leuven) und nach den Richtlinien der guten Laborpraxis durch die Gesundheit, Sicherheit und Umweltabteilung an der Universität vorgesehen durchgeführt. Mehrere Schritte in unserem Protokoll sind weit wie Zellkulturen, SDS-PAGE, Western-Blotting eingesetzt und sind hier gegebenen Einzelheiten des Protokolls in unserem Labor angewendet. Es isthould darauf hingewiesen, dass genauen experimentellen Bedingungen variieren von Labor zu Labor werden, daher spezifische Maßnahmen, um die ordnungsgemäße Umgang mit radioaktivem Material zu gewährleisten, sollte auf jeden neuen Laborumgebung angepasst werden.

Die Verwendung von Open-Source-Strahlung ist die vorherige behördliche Genehmigung und die Regulierungsbehörde für Open-Source-Strahlung in der Laborforschung zuständig, ist von Land zu Land. Benutzer sollten mit ihren institutionellen Strahlenschutzbeauftragten, um zu gewährleisten, dass Verfahren, um lokale Regeln und Vorschriften entsprechen konsultieren. Informationen zu Aufsichtsbehörden gefunden werden kann: in Belgien, der Bundesagentur für Nuklearkontrolle ( http://www.fanc.fgov.be , Website in Französisch oder Niederländisch), im Vereinigten Königreich, die Health and Safety Executive ( http: / / www.hse.gov.uk / Strahlung / ionisierende / index.htm ), in den Vereinigten Staaten die NucLear Regulatory Commission ( http://www.nrc.gov/materials/miau/regs-guides-comm.html ), in Kanada die kanadische Kommission für nukleare Sicherheit ( http://nuclearsafety.gc.ca/eng/ ) und in Deutschland Das Bundesamt für Strahlenschutz ( http://www.bfs.de/de/bfs ). Sicherheitsmaßnahmen relevant zu dieser Protokoll haben im Text erwähnt worden ist, markiert mit dem radioaktiven Strahlensymbol ( Rad Symbol ).

1. Metabolische Markierung von Zellen

  1. Vorbereitung der Zellen für die Kennzeichnung.
    1. Kultur HEK293T-Zelllinien gemß Standardkulturbedingungen (37 ° C, 5% CO 2) in DMEM mit 8% fötalem Kälberserum und Gentamycin.
    2. Erweitern Zellen ausreichenderhalten von mindestens 1 x 10 6 Zellen pro Probe zu prüfen.
    3. Trypsinieren Zellen und Platte aus in 6-Well-Platten (35 mm Durchmesser) bei 10 6 Zellen / well.
    4. 24 Stunden nach Ausplattieren Zellen-, Express-3xflag LRRK2 Protein über Transfektion oder lentiviralen Vektor vermittelte Transduktion.
      1. Für die Transfektion mischen pro Probe 4 ug DNA (pCHMWS-3xflag LRRK2-Plasmid 13-15 oder pCHMWS-3xflag-LRRK1 Plasmid 15) und 8 ul von linearen Polyethylenimin (PEI linear, 1 mg / ml) in 80 ul DMEM (ohne Zusätze ). Lassen Sie komplexe 15-30 min dann fügen komplex, um Zellen durch Mischen gut in Medium vorhanden.
      2. Für Lentivirusvektor vermittelte Transduktion, verdünnte Lentivirusvektor Codierung 3xflag-LRRK1 oder -2 (LV-3xflag-LRRK1, LV-3xflag-LRRK2, als Faustregel gilt, transduzieren mit doppelt so vielen Wandlereinheiten, dh Anzahl der funktionellen Vektorpartikel, der lentivector wie es Zellen) in das Kulturmedium. Eine Beschreibung des Produkts Ion der LV-3xflag-LRRK1 / 2 wurde bereits beschrieben 15.
    5. Wenn Zellen 80-100% konfluent (ungefähr 48 h nach der Transfektion oder Transduktion) gründlich Zellen mit vorgewärmtem (37 ° C) DMEM ohne Phosphate.
  2. Etikett Zellen mit 32 P-Orthophosphat.
    1. Beachten Sie die allgemeinen Grundsätze der Sicherheit bei der Arbeit mit Strahlung.
      1. Rad Symbol Führen Sie alle Operationen mit 32 P in einer bestimmten Strahlungsbereich.
      2. Rad Symbol Geeignete persönliche Schutzausrüstung getragen werden sollten - unter Standard-Betriebsverfahren in unserem Labor Dazu gehören Laborkittel, Doppel-Handschuhen und Schutzbrille.
      3. g "src =" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> Alle Arbeiten mit 32 P sollte von den Benutzern von 6 mm Plexiglas-Bildschirme abgeschirmt werden, um die Exposition zu minimieren.
      4. Rad Symbol Persönliche Überwachungsgeräte sollte immer verwendet werden - innerhalb KUL alle zertifizierten Open-Source-Strahlung Benutzer einen Film Abzeichen auf der Brusttasche des Laborkittel, die Strahlenbelastung während der Experimente überwachen befestigt trägt.
      5. Rad Symbol Alle Versuchsflächen sollten für Radioaktivität vor und nach Gebrauch mit einem Geigerzähler geprüft werden.
      6. Rad Symbol Alle potenziell kontaminierte Verbrauchsmaterialien sollte streng nach den Richtlinien des Instituts für ra entsorgt werdenaktiver Abfallbeseitigung.
    2. Unter einer laminaren Strömung, bereiten ein Falcon-Röhrchen mit 2,1 ml DMEM ohne Phosphate (auf 37 ° C vorgewärmt) pro 6-Well-Platte von Zellen zu beschriften.
      1. Zum Beispiel, um Label Zellen in allen Vertiefungen einer 6-Well-Platte, bereiten 12,6 ml Medium (= 6 x 2.1). Dies ist es, für die 2 ml Medium pro Platte mit 6 Vertiefungen und von Zellen mit einem 5% igen Überschuss des Volumens verwendet werden.
    3. Rad Symbol Vorbereitung der Bank, bei der die Experimente mit ionisierender Strahlung durchgeführt. Der Arbeitsraum wird durch eine Überlaufmatte, auf der eine Schutzfolie aus einem absorbierenden Material bedeckt ist, angeordnet. Falls Sie einen Liner mit einer wasserdichten Oberfläche, legen Sie sie mit dem Absorptions Seite nach oben.
    4. Rad Symbol Auch bieten füreine Plexiglasbehälter auf der Arbeitsfläche und legen Sie den Schlauch von Phosphat-freiem Medium in sie.
    5. Rad Symbol Die Führung ausgekleideten Behälter mit dem Fläschchen von 32 P-markierten Orthophosphat aus dem Kühlschrank und bringen es auf die Radioaktivität Bank. Überwachen Sie den Behälter für radioaktive Kontamination von außen mit einem Geigerzähler.
    6. Rad Symbol Verdünnt mit 32 P markiertem Orthophosphat in das Rohr von DMEM ohne Phosphate in einer Konzentration von 24 &mgr; Ci / ml.
      1. Hinweis: bei 2 ml pro 6-well-Platte gut von Zellen entspricht dies 5 Ci 32 P-markierten Ortho / cm 2 kultivierten Zellen.
      2. Rad Symbol Haltendas Rohr in der Plexiglas-Glas.
    7. Rad Symbol Der Behälter ist mit dem Rest der 32 P-Orthophosphat markiert und in den Kühlschrank zu ersetzen.
    8. Rad Symbol Die 6-Well-Platten mit Zellen aus dem Inkubator und auf der Radioaktivität Bank beschriftet werden.
    9. Rad Symbol Mediumüberstand entfernen und entsorgen. 2 ml der Phosphat-freiem Medium mit 32 P markiert Ortho / gut.
    10. Rad Symbol Legen Sie die Kulturplatten in eine Plexiglas-Box dann den Behälter fo überwachenr radioaktive Kontamination von außen mit einem Geigerzähler.
    11. Rad Symbol Übertragen Sie die Plexiglas-Box mit Zellen einer eukaryotischen Zelle Inkubator Isotopen metabolische Markierung gewidmet.
    12. Rad Symbol Inkubation für 1-20 Stunden bei 37 ° C in 5% CO 2.
      1. Im allgemeinen wird eine Einarbeitungszeit von 3 h oder mehr empfohlen. Die optimale Inkubationszeit kann durch Zeitverlaufsexperimente für jedes spezifische Protein nach Wunsch zu beurteilen.
    13. Rad Symbol Optional: Behandlung von Zellen mit Verbindung.
      1. In Experimenten mit Verbindungsbehandlung (wie ein Kinase-Inhibitor), eine Verbindung nach einem Behandlungsschritt in enthaltenentbindet den Inkubationszeit ohne Verbindung, um die Kennzeichnung zu ermöglichen. Nach der gewünschten Inkubationszeit werden die Perspex-Box die Kulturplatten aus dem Inkubator entfernt und die Radioaktivität Bank gebracht.
      2. Rad Symbol Markierungsmedium von vorgewärmtem phosphatfreie Medium in dem die Verbindung in der gewünschten Konzentration verdünnt ist, ersetzt. Entsorgen Medium in einer 50 ml Tube für die Abfallsammlung, die in der Plexiglasgefäß gegeben wird.
      3. Rad Symbol Zellen werden in der Perspex-Box ersetzt und in der Zelle Inkubator für die gewünschte Kontaktzeit gesetzt.
  3. Rad Symbol Sammeln Lysaten von labeführte Zellen.
    1. Rad Symbol Entfernen Medium von Zellen und entsorgen in den Abfallsammelröhrchen, die in der Plexiglasgefäß gegeben wird.
    2. Rad Symbol Spülen Sie Zellen 2x mit eiskaltem TBS (Tris 50 mM, 150 mM NaCl, pH 7,4, 2 ml / Spülung), Verwerfen Spüllösung in einem Abfallsammelrohr in der Plexiglasgefäß gegeben.
    3. Rad Symbol 0,5 ml eiskaltem Immunpräzipitation (IP) Lyse-Puffer in jede Vertiefung und sammeln Lysat durch Pipettieren Lysat nach oben und unten, um alle Zellen lysiert lockern.
      1. Vorbereitung der erforderlichen Menge von IP-Lysispuffer (0,5 ml / Probe plus 5% Überschuß) vor der Zeit, indem der Protease-Inhibitor-Cocktail und PhosphataseInhibitor-Cocktail frisch kurz vor der Verwendung.
      2. Die Zusammensetzung des Lysepuffers ist 20 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton, 10% Glycerin, Protease-Inhibitor-Cocktail-und Phosphatase-Inhibitor-Cocktail.
    4. Rad Symbol Transfer des Lysats in ein Mikrozentrifugenrohr und Inkubation auf Eis für mindestens 10 min.
    5. Rad Symbol Zentrifugieren Sie die Lysate in einer Mikrozentrifuge bei> 5000 g für 10 min.
    6. Rad Symbol Entsorgung radioaktiver Abfälle in speziellen Abfallbehälter, die hinter Plexiglas Schilde gespeichert sind.

2. Analysieren Markierung von Proteinen in der Nähe

  1. Rad Symbol Isolieren des Proteins von Interesse Immun (IP).
    1. Rad Symbol Übertragen Sie die Mikrozentrifugenröhrchen mit Lysate zentrifugiert wieder auf Eis und Pipette den Überstand in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit 10 ul Bettvolumen von äquilibriertem Flag-M2-Agarose-Perlen.
      1. Bereiten Sie die Rohre mit äquilibriertem Flag-M2-Agarose-Perlen vor der Zeit.
      2. Dazu pipettieren ein Volumen von Flag-M2-Agarose Gülle entsprechend 10 ul Bettvolumen pro Probe plus 5% Überschuss.
        1. Generell entspricht ein 10 ul Bettvolumen von Perlen zu 20 ul Gülle. Finden Sie in der Artikeldatenblatt für weitere Details.
      3. Äquilibrieren die Perlen durch Spülen 3x in 10 Volumen (bezogen auf Schüttvolumen) von IP-Lyse-Puffer.
      4. Verteilen äquilibriert Perlen gleichmäßig auf 10 ul Bettvolumen / Rohr in so viele Rohre, da es Proben. Beschriften Sie die Röhrchen mit einer Kennung für jede Probe.
    2. Rad Symbol Übertragen Sie die Reaktionsgefäße bis 50-ml-Röhrchen (ca. 6 Mikro tubes/50 ml Tube) mit einer radioaktiven Strahlensymbol gekennzeichnet und auf Eis zu halten.
    3. Rad Symbol Übertragungs Proben auf eine Drehvorrichtung hinter einer Plexiglasabschirmung in dem bestimmten Bereich eines kalten Raum über Kopf Mischen bei 4 ° C für 1-20 Stunden.
    4. Rad Symbol Übertragen Sie die Proben zu einem bestimmten Arbeitsbereich auf Eis.
    5. 50523rad1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> Spin down das Protein gebunden Flag-M2-Agarose-Perlen in einer Mikrozentrifuge (1000 g, 1 min) und den Überstand verwerfen in einem Abfallsammelröhrchen.
    6. Rad Symbol Waschen Sie die Protein gebunden Flag-M2-Agarose-Perlen durch Resuspendieren in 1 ml IP-Waschpuffer.
      1. Zusammensetzung der IP-Waschpuffer: 25 mM Tris pH 7,5, NaCl 400 mM, Triton 1%. Es wird empfohlen, auch Protease-und Phosphatase-Inhibitoren in der Waschpuffer für Proteine ​​empfindlich gegen Abbau durch Co-Reinigung von Proteasen oder Dephosphorylierung durch Co-Reinigung von Phosphatasen.
      2. Rad Symbol Spin down die Protein gebunden Flag-M2-Agarose-Perlen in einer Mikrozentrifuge (1000 g, 1 min) und den Überstand verwerfen in einen Abfallsammlungtion Röhre.
      3. Rad Symbol Wiederholen Sie den Waschschritt 3x.
    7. Rad Symbol Nach den Waschschritten Dynabeads in 1 ml IP Spülung Puffer (Tris 25 mM pH 7,5, MgCl 2 10 mM, Dithiothreitol (DTT), 2 mM, Triton 0,02%, beta-Glycerophosphat 5 mM Na 3 VO 4 0.1 mM).
    8. Rad Symbol Spin down das Protein gebunden Flag-M2-Agarose-Perlen in einer Mikrozentrifuge (1000 g, 1 min) und den Überstand verwerfen in einem Abfallsammelröhrchen. Entfernen Sie alle überschüssigen Puffer.
    9. Rad Symbol Resuspendieren Perlen in 40 & mu; l IP-Probe SDS-Ladepuffer (Tris-HCl 160 mM, pH 6,8, 2% SDS, 0,2 M DTT, 40% Glycerin, Bromphenolblau 2 mg / ml).
      1. Proben können sofort analysiert oder in einem -20 ° C Gefrierschrank für Hinter Analyse gespeichert werden.
        1. Rad Symbol Für die Lagerung von Proben bei -20 ° C, Ort Proben in Rohrhalter oder Kisten in einer Plexiglas-Box in einer radioaktiven Strahlensymbol gekennzeichnet Gefrierschrank für die Lagerung von radioaktiven Proben gewidmet.
    10. Rad Symbol Entsorgung radioaktiver Abfälle in speziellen Abfallbehälter, die hinter Plexiglas Schilde gespeichert sind.
  2. Rad Symbol Resolve IP Proben über SDS-PAGE und blot auf eine PVDF-Membran.
    1. Rad Symbol Wärme Proben in Ladepuffer auf 95 º C für 2 min und zentrifugieren für 1 min bei> 1.000 × g, um die Kügelchen zu pelletieren.
    2. Rad Symbol Bereiten Sie die Protein-Gel-Elektrophorese-Modul auf der Radioaktivität einer Bank hinter Plexiglas-Bildschirm.
    3. Rad Symbol Laden Sie die Proben auf einem 3-8% Tris-Acetat-SDS-PAGE-Gelen.
      1. Diese Art von Gel zur Lösung mit hohem Molekulargewicht (HMW)-Proteinen geeignet. Andere Typen Gel kann auch geeignet sein, wie einem 4-20% Bis-Tris-Tricin-Gel oder-Glycin 4-20% Gelen.
      2. Fügen Sie eine Molekulargewichtsmarker, die sich auf Größen von HMW-Proteine ​​zu erkennen ist.
      4. <li> Rad Symbol Führen Elektrophorese bei 150 V für 1 Stunde.
    4. Rad Symbol Nach der Elektrophorese, entfernen Sie das Gel aus dem Kunststoffgehäuse und übertragen das Gel in einen Behälter mit Western-Blot-Transferpuffer.
      1. Zusammensetzung der Western-Blot-Transferpuffer: 50 mM Tris, 40 mM Glycin, 0,04% SDS, 20% Methanol.
      2. Rad Symbol Abgeschnittenen Teile des Gels, die herausragen, wie die gut Separatoren und unteren Teil des Gels, der herausragt.
    5. Bereiten Sie eine Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membran pro Gel durch Eintauchen in Methanol für 1 min, dann in Transferpuffer.
      1. Die Membranen werden zu den s geschnitten ame Größe wie das Gel zuzüglich einer Marge von 3 mm.
    6. Legen Sie eine semi-Dry-Blotting-Modul auf der Radioaktivität Bank und nehmen Sie die Abdeckung und die obere Elektrodenplatte.
    7. Rad Symbol Bereiten Sie die Blotting-Sandwich auf der Oberfläche des Halbtrocken-Blotting-Modul.
      1. Befeuchten Sie einen extra dicken (2,5 mm, 7,5 x 10 cm groß) Löschfilter in Transferpuffer und auf Bodenplatte der Blotting-Modul.
      2. Rad Symbol Setzen Sie den Pre-wet PVDF-Membran auf der Blotting-Filter.
      3. Rad Symbol Legen Sie das Gel auf die PVDF-Membran, und entfernen Sie alle Luftblasen.
      4. 523/50523rad1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> Füllen Sie das Blot-Sandwich durch Benetzung einen extra dicken Blot-Filter in Transferpuffer und auf der Bodenplatte des Löschmoduls. Entfernen Sie alle Luft Blasen schließlich in der Blotting-Sandwich vor.
        Bitte beachten Sie, dass die Beschreibung hier angegeben werden, mit dem BioRad Trans-Blot SD-System, bei dem Elektroden, so dass Proteine ​​wandern nach unten auf die Membran sind kompatibel. Andere Löschsysteme sind auch mit diesen Schritten mit geringfügigen Anpassungen wie jene eventuell benötigt, um eine weitere Berücksichtigung Blotting Richtung erfolgen oder, im Fall der Tank-Blotting, zusätzliche Flüssigkeit die Abfälle in der gleichen Weise wie der Elektrophoresepuffer oben angeordnet sein kompatibel.
    8. Rad Symbol Entfernen Sie alle überschüssigen Puffer mit einem saugfähigen Gewebe und setzen Sie die Deckplatte und die Abdeckung des semi-d ry Blotting-Modul.
    9. Rad Symbol Transferproteine ​​bei 15 V für 1-2 Stunden.
    10. Rad Symbol Während dieser Zeit reinigen die Elektrophorese-Modul.
      1. Rad Symbol Entsorgung radioaktiver Abfälle in speziellen Abfallbehälter, die hinter Plexiglas Schilde gespeichert sind.
      2. Rad Symbol Spülen Sie die Elektrophorese-Modul mit destilliertem Wasser (AD) und entsorgen das Spülwasser in der flüssigen radioaktiven Abfallbehälter.
    11. 0523/50523rad1.jpg "/> Nach der Übertragung, entfernen Sie die PVDF-Membran mit geblotteten Proteine ​​aus dem Blot-Modul.
    12. Rad Symbol Optional: führen Sie eine Ponceau S-Färbung von Proteinen ausgelöscht, um Proteine ​​zu visualisieren.
      1. Rad Symbol Übertragen Sie die Blot in eine flache-Inkubation Gefäß mit Ponceau S-Lösung und Inkubation für 5 min.
      2. Rad Symbol Spülen Sie 2x schnell in AD.
    13. Rad Symbol Trocknen der Membran.
  3. / Files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> Führen Autoradiographie.
    1. Rad Symbol Setzen Sie die Membran auf eine Phosphoreszenz Platte für 1-5 Tage.
    2. Rad Symbol Lesen Sie die 32P aus der exponierten Phosphoreszenz Platte mit einem Sturm 840 Phosphoreszenz Scanner oder gleichwertig und speichern Sie das Bild als hochauflösende TIFF.
  4. Rad Symbol Erkennen Protein-Ebene über Immundetektion.
    1. Rad Symbol Rehydrate die Membranen durch Eintauchen kurz in Methanol, dann auf einem flachen Gefäß-Inkubation mit PBS übertragen. Rad Symbol Blockieren die Membranen in PBS-T (PBS mit 0,1% Triton) mit 5% Milch.
    2. Rad Symbol Inkubation der Blots mit Anti-LRRK2 13,16 Antikörper oder Anti-Flag-Antikörper und Verfahren weiter mit geeigneten Waschschritte und sekundären Antikörper-Inkubation.
    3. Rad Symbol Führen Chemilumineszenzdetektion, um die relativen Proteinmengen von LRRK2 bestätigen.
  5. Quantifizieren Einbau von 32 P in LRRK2.
    1. Führen densitometrische Analyse der Banden auf dem Blot Autoradiogramme und Immunreaktivität mit der entsprechenden Software wie ImageJ-Software, ein Freeware-Programm auf der National Instit verfügbarnuten für Gesundheits-Website ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ).
    2. Berechnen Phosphatspiegel Einarbeitung als das Verhältnis des autoradiographischen Signals über die Immunreaktivität Ebene.

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Representative Results

Um die Gesamt Phosphorylierung von LRRK1 und LRRK2 in Zellen zu vergleichen, getaggt 3xflag LRRK1 und LRRK2 wurden in HEK293T-Zellen 15 ausgedrückt. Zellen wurden in 6-Well-Platten und mit 32 P markiert und analysiert, wie oben in dem Protokoll Text beschrieben. Abbildung 1 zeigt repräsentative Ergebnisse für die metabolische Markierung von LRRK1 und LRRK2 in HEK293T-Zellen. Radioaktiven Phosphateinbau wird sowohl LRRK1 und LRRK2 beobachtet. Nach Quantifizierung der 32 Ebenen P normiert auf die Proteinmengen, wie durch densitometrische Analyse des Immunnachweis mit Anti-FLAG-Antikörpers gemessen wird, wurde gefunden, daß LRRK1 hatte eine durchschnittliche Phosphorylierung, die niedriger als LRRK2 unter den getesteten Bedingungen ist, obwohl statistische Signifikanz nicht erreicht ist (P> 0,05).

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Abbildung 1. Metabolische Markierung von LRRK1 und LRRK2. A. LRRK1 und LRRK2 in HEK293T-Zellen exprimiert wurden metabolisch mit 32 P markiert, wie in dem Protokoll beschrieben und ergibt Abschnitte. Dargestellt sind hier repräsentative Autoradiogramme (oben) der 32 P Einbau sowie Vertreter Western-Blots (unten) von LRRK1 und LRRK2 Nachweis über ihre 3xflag Tags. B. Quantifizierung des Vergleichs metabolische Markierung von LRRK1 und LRRK2 (N = 4).

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Discussion

Dieses Papier stellt eine Basisprotokoll zum Testen von allgemeinen Phosphorylierung von LRRK2 LRRK1 und in Zelllinien unter Verwendung metabolische Markierung mit 32 P-Orthophosphat. Die Gesamtstrategie ist einfach. LRRK affinitätsmarkierten Proteine ​​in HEK293T-Zellen, die einem Medium mit 32 P-Orthophosphat ausgesetzt sind, ausgedrückt. Die 32 P-Orthophosphat durch die Zellen bereits nach wenigen Stunden Inkubation und alle Moleküle in der Zelle, die Phosphate assimiliert werden dabei radioaktiv markiert. Der Affinitäts-Tag (3xflag) wird dann verwendet, um die LRRK Proteine ​​von anderen zellulären Komponenten durch Immunpräzipitation isoliert werden. Immunpräzipitate werden dann über SDS-PAGE aufgetrennt, auf PVDF-Membranen und Analyse der enthaltenen Phosphate durch Autoradiographie (32 P-Signal) und Western-Detektion (Protein-Signal) der Proteine ​​auf den Blots durchgeführt. Dieses Protokoll ist vom Protokoll unterschieden werden, um LRRK2 au messentophosphorylation 17, die Kennzeichnung von LRRK2 LRRK1 oder in Zellkultur nicht in einem in vitro Phosphorylierungsreaktion mit gereinigten Proteinen durchgeführt.

Es sei darauf hingewiesen, dass die detaillierte Protokoll hier dargestellten angepasst werden, um für mehrere Variationen je nach experimentellen Anforderungen gerecht werden. Beispielsweise als Kennzeichnung ist effizient in den meisten üblichen Laborzelllinien, dieses Protokoll nicht auf die Verwendung des HEK293T-Zelllinie beschränkt. Es können auch andere Affinitäts-Tags als Alternative zu 3xflag verwendet werden, wie zB HA, myc, V5, GFP oder andere Tags 18 als mehrere Tags können verwendet werden, um effizient Immunopräzipitat LRRK1 oder LRRK2 werden. Bei einem Protein-spezifischen Antikörper für das Protein, das geeignet ist für die Immunpräzipitation Verfügung, wie es der Fall für LRRK2 11 kann diese auch umgesetzt werden. Immunpräzipitation mit einem Grad Protein-spezifischen Antikörper ist es auch möglich, die metabolische Markierung von LRRK durchProteine ​​endogen in Zelllinien exprimiert. Im Fall von LRRK2 haben mehrere monoklonale Antikörper beschrieben, die Dose Immunpräzipitation von endogenen LRRK2 19. Schließlich kann die metabolische Markierung Protokoll für LRRK1 LRRK2 und hier beschrieben sind, auch auf einem anderen Protein, das aus Zelllinien unter Verwendung des oben beschriebenen allgemeinen Strategie immunpräzipitiert werden kann angepasst werden.

Eine wichtige Überlegung, bevor metabolische Markierung von Proteinen in der Zellkultur ist, wie diese Technik im Vergleich zu anderen verfügbaren Methoden, um zelluläre Protein-Phosphorylierung zu bestimmen. Zum Beispiel kann die Phosphorylierung an spezifischen Stellen durch Immunoblotting unter Verwendung eines Phospho-spezifische Antikörper überwacht werden. Dieses Verfahren folgende Schritte ähnlich den hier beschriebenen, außer der Isotopenmarkierungsschritte, und aus diesem Grund ist diese Technik oft über metabolische Markierung bevorzugt mit 32 P-Orthophosphat, wenn es verfügbar ist. Metabolische Markierung mit 32 P-Ortho liefert ein Signal, das repräsentativ für die Gesamt Phosphorylierungszustand des Proteins ist deshalb kann es keine Informationen über die Phosphorylierung von spezifischen Stellen. Für Proteine ​​mit mehreren Phosphorylierungsstellen, wie es der Fall bei 10,11 LRRK2 ist, bietet die metabolische Markierungstechnik eine Ein-Schritt-Bewertung der Gesamt Phosphorylierung, die mit phospho-spezifische Antikörper Immundetektion nur angemeldete mehrere Schritte ermittelt werden können. Zum Beispiel ist LRRK2 hochphosphorylierte in seiner ANK-LRR Interdomain-Region, dh die S910/S935/S955/S973 11,20 Standorten sowie in anderen Regionen 10, einschließlich des kürzlich gekennzeichnet S1292 Website 21. Um sezieren die Rollen der einzelnen PhosphoSites, empfiehlt es sich, Experimente mit spezifischen Antikörpern phosphosite bevorzugen. Zum Beispiel phosphosite spezifischen Antikörpern erlaubt haben, zu erkennen, dass die S910/S935/S955/S973 PhosphoSites sind dephosphorylierend in mehreren pathogenen Mutanten, wie R1441C / G, Y1699C, I2020T, aber nicht in den G2019S 11,22, während LRRK2 Krankheit mutierte Formen zeigen in der Regel höher Phospho-S1292 21 Ebenen. Jedoch sind metabolische Markierung nützlich für eine Reihe von anderen Untersuchungen der zellulären Phosphorylierung. Metabolische Markierung ist immer eine anwendbare Technik zum Beispiel in Fällen von unbekannten Phosphorylierungsstellen oder wenn Phospho-Antikörper sind nicht verfügbar oder niedriger Empfindlichkeit. Schließlich ermöglicht die metabolische Markierung Vergleichen Gesamt Phosphorylierung verschiedener Proteine ​​(hier als Vergleich zellulären Phosphorylierung von LRRK1 und LRRK2, gezeigt in 1), ein Vergleich, Herausforderung ist, mit phosphosite-spezifische Antikörper gegeben Unterschiede in der Empfindlichkeit von einem Antikörper zu einem anderen zu tun .

Zusammenfassend ermöglicht die vorliegende Protokoll effiziente Bewertung des Gesamt Phosphorylierung von Proteinen in Zellen LRRK. Das Protokoll kann leicht angepasst werden, um zu überwachenPhosphorylierung von einem anderen Protein, das in Zellen exprimiert wird und durch Immunpräzipitation isoliert werden. Die Nutzung dieser Protokoll wird empfohlen, wenn phosphosite-spezifische Antikörper sind in der Studie oder als einen Schritt in ihrer Validierung nicht für das Protein zur Verfügung. Dieses Protokoll ist besonders nützlich, wenn die experimentelle Gesamtziel ist es, die Phosphorylierung von 2 oder mehr verschiedene Proteine ​​als solche Vergleiche durch metabolische Markierung vergleichen nicht durch Unterschiede in der Empfindlichkeit der Detektion der Phosphorylierung von einem Protein zu einem anderen vorgespannt ist. Speziell für LRRK1 und LRRK2, kann diese Technik verwendet, um die Aktivität abhängige Veränderungen in der Phosphorylierung von LRRK1 und LRRK2, falls solche Änderungen haben begonnen, beschrieben für LRRK2 11,13,23, während LRRK1 Phosphorylierung Regelung vergleichsweise schlecht verstanden überwachen.

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Disclosures

Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Wir sind auch dankbar, dass der Michael J. Fox Foundation unterstützt diese Studie. Wir danken der Forschungsgemeinschaft - FWO Flandern (FWO Projekt G.0666.09, Senior Researcher Stipendium für JMT), die Binnenschifffahrt SBO/80020 Projekt Neuro-TARGET, die KU Leuven (OT/08/052A und IOF-KP/07 / 001) für ihre Unterstützung. Diese Forschung wurde zum Teil auch von den Fonds-Druwé Eerdekens von der König-Baudouin-Stiftung verwaltet JMT unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphorus-32 Radionuclide, 1 mCi, buffer disodiumphosphate in 1 ml water Perkin Elmer NEX011001MC
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (D-MEM) (1X), liquid (high glucose) Invitrogen 11971-025 This medium contains no phosphates
Anti Flag M2 affiinty gel Sigma A2220 For an equivalent product with red colored gel (useful to more easily visualize the beads), use cat. No. F2426.
Extra thick blotting filter Bio-Rad 1703965
Ponceau S solution Sigma P7170

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Cellular Biology Ausgabe 79 Biologie (allgemein) Biochemie Biotechnologie (allgemein) LRRK1 LRRK2 Stoffwechsel-Kennzeichnung 32P Orthophosphat Immunpräzipitation Autoradiographie
Metabolische Markierung von Leucin Rich-Repeat-Kinasen 1 und 2 mit radioaktivem Phosphat
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Taymans, J. M., Gao, F., Baekelandt, V. Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate. J. Vis. Exp. (79), e50523, doi:10.3791/50523 (2013).

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