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Biology

Leucine रिच के चयापचय लेबल रेडियोधर्मी फास्फेट के साथ Kinases 1 और 2 दोहराएँ

Published: September 18, 2013 doi: 10.3791/50523
Automatic Translation
1, 1, 1
1Laboratory for Neurobiology and Gene Therapy, Department of Neurosciences, KU Leuven and Leuven Institute for Neuroscience and Disease (LIND)

Summary

Leucine संपन्न दोहराने kinases 1 और 2 (LRRK1 और LRRK2) GTPase और kinase डोमेन दोनों सांकेतिक शब्दों में जो और कोशिकाओं में phosphorylated हैं जो multidomain प्रोटीन होते हैं. यहाँ, हम जिससे उनके समग्र सेलुलर phophorylation के स्तर को मापने के लिए एक साधन उपलब्ध कराने, 32 पी orthophosphate साथ कोशिकाओं में LRRK1 और LRRK2 लेबल करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं.

Abstract

Leucine संपन्न दोहराने kinases 1 और 2 (LRRK1 और LRRK2), एक सेरीन-threonine kinase डोमेन, जटिल प्रोटीन डोमेन का रास (ROC), आरओसी डोमेन (कोर) की एक सी टर्मिनल सहित, एक समान डोमेन संगठन का हिस्सा है जो paralogs हैं और leucine संपन्न और एन टर्मिनस पर ankyrin की तरह दोहराता. LRRK1 और LRRK2 के सटीक सेलुलर भूमिकाओं LRRK2 पार्किंसंस रोग 3,4 के रोगजनन में फंसा है, जबकि हालांकि LRRK1, 1,2 संकेत tyrosine kinase रिसेप्टर में फंसाया गया है, स्पष्ट होना शेष है. इस रिपोर्ट में, हम इस तरह की कोशिकाओं में इन 2 प्रोटीन के समग्र phosphorylation के स्तर को मापने के लिए एक साधन उपलब्ध कराने, 32 पी orthophosphate साथ कोशिकाओं में LRRK1 और LRRK2 प्रोटीन लेबल के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. संक्षेप में, आत्मीयता LRRK प्रोटीन 32 पी orthophosphate युक्त मध्यम के संपर्क में हैं जो HEK293T कोशिकाओं में व्यक्त कर रहे हैं टैग किया. 32 पी orthophosphate के बाद कोशिकाओं से ग्रहण कर लेता है केवल कुछऊष्मायन के घंटे और फॉस्फेट युक्त कक्ष में सभी अणुओं जिससे radioactively लेबल रहे हैं. आत्मीयता टैग के माध्यम से (3xflag) LRRK प्रोटीन immunoprecipitation द्वारा अन्य सेलुलर घटकों से अलग कर रहे हैं. Immunoprecipitates तो एसडीएस पृष्ठ के माध्यम से अलग हो रहे हैं, PVDF झिल्ली और शामिल फॉस्फेट का विश्लेषण करने के लिए मिट blots पर प्रोटीन की autoradiography (32 पी संकेत) और पश्चिमी पहचान (प्रोटीन संकेत) द्वारा किया जाता है. प्रोटोकॉल तत्काल कोशिकाओं में व्यक्त की और immunoprecipitation से अलग किया जा सकता है कि किसी भी अन्य प्रोटीन की phosphorylation की निगरानी करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

Introduction

Leucine संपन्न दोहराने kinases 1 और 2 (LRRK1 और LRRK2) एक समान डोमेन संगठन का हिस्सा है जो multidomain paralogs हैं. दोनों प्रोटीन प्रभावी रूप से ROCO प्रोटीन परिवार 5,6 करने के लिए दोनों प्रोटीन वर्गीकृत, GTPases (प्रोटीन जटिल का रास, या आरओसी) के रास परिवार के साथ ही आरओसी डोमेन (कोर) की एक सी टर्मिनल के सदृश एक GTPase अनुक्रम सांकेतिक शब्दों में बदलना. केवल LRRK2 एक अतिरिक्त वर्मी domein 6-8 encodes जबकि रूह भ्रष्टाचार डोमेन मिलकर की एन टर्मिनल, दोनों प्रोटीन, एक leucine संपन्न दोहराने डोमेन के साथ ही एक ankyrin तरह डोमेन सांकेतिक शब्दों में बदलना. केवल LRRK2 सी टर्मिनल क्षेत्र 8 में एक WD40 डोमेन encodes जबकि रूह भ्रष्टाचार के सी टर्मिनल, दोनों प्रोटीन एक सेरीन-threonine kinase डोमेन का हिस्सा. LRRK1 और LRRK2 के सटीक सेलुलर भूमिकाओं, हालांकि LRRK1 1,2 संकेत tyrosine kinase रिसेप्टर में फंसाया गया है, स्पष्ट होना शेष है जबकि पार्किंसंस रोग 3,4 के रोगजनन में LRRK2 के लिए एक भूमिका के लिए आनुवंशिक सबूत बताते हैं.

9-11 के बीच एक क्लस्टर में होने के सेलुलर phosphorylation साइटों के बहुमत से पता चला है. LRRK1 सेलुलर phosphorylation साइटों मैप किया जा करने के लिए अभी तक हालांकि, Cos7 कोशिकाओं से immunoprecipitated LRRK1 प्रोटीन की blots की phosphoprotein धुंधला का उपयोग अध्ययन से सबूत LRRK1 प्रोटीन कोशिकाओं 12 में phosphorylated है कि पता चलता है.

इस पत्र 32 पी orthophosphate साथ चयापचय लेबलिंग का उपयोग सेल लाइनों में LRRK1 और LRRK2 के सामान्य phosphorylation स्तर परख करने की क्रिया के लिए एक बुनियादी प्रोटोकॉल प्रदान करता है. समग्र रणनीति सरल है. आत्मीयता LRRK prote में चिह्नितआईएनएस 32 पी orthophosphate युक्त मध्यम के संपर्क में हैं जो HEK293T कोशिकाओं में व्यक्त कर रहे हैं. 32 पी orthophosphate केवल कुछ ऊष्मायन के घंटे और फॉस्फेट युक्त कक्ष में सभी अणुओं के बाद कोशिकाओं से ग्रहण कर लेता है, जिससे radioactively लेबल रहे हैं. आत्मीयता टैग (3xflag) तो immunoprecipitation द्वारा अन्य सेलुलर घटकों से LRRK प्रोटीन को अलग करने के लिए प्रयोग किया जाता है. Immunoprecipitates तो एसडीएस पृष्ठ के माध्यम से अलग हो रहे हैं, PVDF झिल्ली और शामिल फॉस्फेट का विश्लेषण करने के लिए मिट blots पर प्रोटीन की autoradiography (32 पी संकेत) और पश्चिमी पहचान (प्रोटीन संकेत) द्वारा किया जाता है.

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Protocol

वर्तमान प्रोटोकॉल LRRK2 के सेलुलर phosphorylation का पालन करने के लिए रेडियोधर्मी 32 पी लेबल orthophosphate का उपयोग करता है. यह रेडियोधर्मी अभिकर्मकों के साथ सभी आपरेशनों ऑपरेटर और पर्यावरण के लिए रेडियोधर्मी विकिरण के जोखिम को कम करने के लिए उचित सुरक्षा उपायों का उपयोग किया जाना चाहिए कि मन में रखना जरूरी है. विकिरण फेंकना कि आइसोटोप युक्त यौगिकों के एक संस्थागत और राष्ट्रीय स्तर पर नियंत्रण उनके उपयोग में मानव स्वास्थ्य और सख्त लाइसेंस और विनियमों के लिए हानिकारक हो सकता है. इस प्रोटोकॉल में प्रयोगों कथोलिएके Universiteit लोवेन (यू लोवेन) में खुला स्रोत विकिरण उपयोग में प्रशिक्षण के बाद और विश्वविद्यालय में स्वास्थ्य, सुरक्षा एवं पर्यावरण विभाग द्वारा प्रदान की अच्छी प्रयोगशाला अभ्यास दिशा निर्देशों का पालन किया गया. हमारे प्रोटोकॉल में कई कदम उठाए व्यापक रूप से सेल संस्कृति, एसडीएस पृष्ठ, पश्चिमी सोख्ता के रूप में तैनात है और हमारी प्रयोगशाला में लागू किया यहाँ के रूप में प्रोटोकॉल का विवरण दिया जाता है. यह हैhould सटीक प्रयोगात्मक शर्तों प्रयोगशाला से प्रयोगशाला के लिए अलग अलग उल्लेखनीय है कि, रेडियोधर्मी सामग्री के समुचित से निपटने को सुनिश्चित करने के लिए इसलिए विशिष्ट उपायों प्रत्येक नई प्रयोगशाला स्थापित करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए.

खुला स्रोत विकिरण का उपयोग से पहले नियामक की मंजूरी के अधीन है और प्रयोगशाला अनुसंधान में खुला स्रोत विकिरण के लिए जिम्मेदार नियामक संस्था देश देश से भिन्न होता है. उपयोगकर्ताओं को उस प्रक्रिया स्थानीय नियमों और विनियमों के अनुरूप सुनिश्चित करने के क्रम में उनके संस्थागत विकिरण सुरक्षा अधिकारी के साथ परामर्श करना चाहिए. नियामक संस्थाओं पर सूचना पाया जा सकता है: बेल्जियम, परमाणु नियंत्रण के लिए संघीय एजेंसी में ( http://www.fanc.fgov.be , में वेबसाइट फ्रेंच या डच), यूनाइटेड किंगडम में, स्वास्थ्य और सुरक्षा के कार्यकारी ( HTTP: / / www.hse.gov.uk / विकिरण / ionizing / index.htm ), संयुक्त राज्य अमेरिका Nuc मेंलेअर नियामक आयोग ( http://www.nrc.gov/materials/miau/regs-guides-comm.html कनाडा में), कनाडा के परमाणु सुरक्षा आयोग ( http://nuclearsafety.gc.ca/eng/ ), और जर्मनी दास Bundesamt फर Strahlenschutz में ( http://www.bfs.de/de/bfs ). इस प्रोटोकॉल के लिए प्रासंगिक सुरक्षा सावधानियों पाठ में उल्लेख किया गया है, रेडियोधर्मी तिपतिया प्रतीक (साथ प्रकाश डाला रेड प्रतीक ).

1. कोशिकाओं के चयापचय लेबल

  1. लेबलिंग के लिए कोशिकाओं को तैयार है.
    1. संस्कृति HEK293T सेल लाइनों मानक संस्कृति की स्थिति के अनुसार (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) 8% भ्रूण बछड़ा सीरम और gentamycin के साथ DMEM में.
    2. करने के लिए पर्याप्त रूप से कोशिकाओं का विस्तारपरीक्षण करने के लिए नमूना प्रति कम से कम 1 x 10 6 कोशिकाओं प्राप्त करते हैं.
    3. कोशिकाओं Trypsinize और अच्छी तरह से 10 6 कोशिकाओं / 6 अच्छी तरह प्लेटें (35 मिमी व्यास) में बाहर थाली.
    4. 24 घंटा कोशिकाओं बाहर चढ़ाना के बाद, अभिकर्मक या lentiviral वेक्टर मध्यस्थता पारगमन के माध्यम से 3xflag-LRRK2 प्रोटीन व्यक्त करते हैं.
      1. अभिकर्मक के लिए, परिवर्धन के बिना (नमूना 4 ग्राम डीएनए (pCHMWS-3xflag-LRRK2 प्लाज्मिड 13-15 या pCHMWS-3xflag-LRRK1 प्लाज्मिड 15) और 80 μl DMEM में रेखीय polyethyleneimine (रेखीय पी, 1 मिलीग्राम / एमएल) की 8 μl प्रति मिश्रण ). 15-30 मिनट के लिए जटिल करने की अनुमति दें तो मध्यम वर्तमान में अच्छी तरह से मिश्रण से कोशिकाओं को जटिल जोड़ें.
      2. Lentiviral वेक्टर मध्यस्थता पारगमन के लिए, lentiviral वेक्टर एन्कोडिंग 3xflag-LRRK1 पतला या -2 (एल.वी. 3xflag-LRRK1, एल.वी. 3xflag-LRRK2, अंगूठे का एक नियम के रूप में दो बार के रूप में कई transducing इकाइयों के साथ transduce, कार्यात्मक वेक्टर कणों की यानी नंबर, कोशिकाओं) संस्कृति के माध्यम में कर रहे हैं lentivector के रूप में. उत्पाद का विवरण एल.वी. 3xflag-LRRK1 / 2 के आयन पहले 15 में वर्णित किया गया है.
    5. कोशिकाओं 80-100% मिला हुआ (लगभग 48 घंटे अभिकर्मक या पारगमन के बाद) कर रहे हैं, फॉस्फेट के बिना prewarmed (37 डिग्री सेल्सियस) DMEM के साथ कोशिकाओं कुल्ला.
  2. 32 पी ऑर्थो फॉस्फेट के साथ लेबल कोशिकाओं.
    1. विकिरण के साथ कार्य करते समय सुरक्षा का मन सामान्य सिद्धांतों में रखें.
      1. रेड प्रतीक एक नामित विकिरण क्षेत्र में 32 पी के साथ सभी आपरेशन प्रदर्शन.
      2. रेड प्रतीक उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहना होना चाहिए - हमारी प्रयोगशाला में मानक संचालन प्रक्रिया के तहत इन प्रयोगशाला कोट, डबल दस्ताने और सुरक्षात्मक काले चश्मे में शामिल हैं.
      3. जी "src =" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> 32 पी के साथ सभी काम जोखिम को कम करने के लिए 6 मिमी Perspex स्क्रीन से उपयोगकर्ताओं से परिरक्षित किया जाना चाहिए.
      4. रेड प्रतीक निजी निगरानी उपकरणों हमेशा इस्तेमाल किया जाना चाहिए - KUL भीतर सभी प्रमाणित खुला स्रोत विकिरण उपयोगकर्ता प्रयोगों के दौरान विकिरण जोखिम पर नजर रखने के लिए प्रयोगशाला कोट के स्तन जेब से जुड़ी एक फिल्म बिल्ला पहनता है.
      5. रेड प्रतीक सभी प्रयोगात्मक सतहों एक Geiger काउंटर के साथ उपयोग करने से पहले और बाद रेडियोधर्मिता के लिए मूल्यांकन किया जाना चाहिए.
      6. रेड प्रतीक सभी संभावित दूषित उपभोग्य आरए के लिए संस्थागत दिशा निर्देशों का कड़ाई से पालन में निपटाया जाना चाहिएdioactive अपशिष्ट निपटान.
    2. एक लामिना का प्रवाह के तहत, लेबल के लिए कक्षों की 6 अच्छी तरह से थाली प्रति (37 डिग्री सेल्सियस के लिए prewarmed) फॉस्फेट के बिना DMEM के 2.1 मिलीलीटर के साथ एक फाल्कन ट्यूब तैयार करते हैं.
      1. उदाहरण के लिए, 6 अच्छी तरह से थाली के सभी कुओं में लेबल कोशिकाओं के लिए, 12.6 मिलीलीटर मध्यम (= x 2.1 6) तैयार करते हैं. इस 2 मिलीलीटर मध्यम मात्रा में 5% की अतिरिक्त के साथ कोशिकाओं के 6 अच्छी तरह से थाली में अच्छी तरह से प्रति इस्तेमाल किया जा करने के लिए उपलब्ध कराने के लिए है.
    3. रेड प्रतीक विकिरण के साथ प्रयोगों का प्रदर्शन किया जाएगा, जिस पर बेंच तैयार करें. अंतरिक्ष काम शोषक सामग्री की एक सुरक्षात्मक लाइनर रखा गया है जिस पर एक फैल चटाई द्वारा कवर किया जाता है. आप एक निविड़ अंधकार की सतह के साथ एक जहाज का उपयोग कर रहे हैं मामले में, शोषक पक्ष के साथ यह जगह.
    4. रेड प्रतीक इसके अलावा के लिए प्रदानएक Perspex काम की जगह पर जार और उस में फॉस्फेट मुक्त माध्यम से ट्यूब जगह.
    5. रेड प्रतीक फ्रिज के बाहर 32 पी लेबल orthophosphate की शीशी के साथ नेतृत्व अटे कंटेनर ले लो और रेडियोधर्मिता बेंच पर ले आएं. एक Geiger काउंटर का उपयोग बाहरी रेडियोधर्मी संदूषण के लिए कंटेनर की निगरानी करें.
    6. रेड प्रतीक 24 μCi / एमएल के एक एकाग्रता में फॉस्फेट के बिना DMEM के ट्यूब में 32 पी लेबल orthophosphate पतला.
      1. नोट: अच्छी तरह से कोशिकाओं की 6 अच्छी तरह से थाली प्रति 2 मिलीलीटर पर, इस 5 μCi 32 तक संवर्धित कोशिकाओं के पी लेबल orthophosphate / 2 सेमी मेल खाती है.
      2. रेड प्रतीक रखनाPerspex जार में ट्यूब.
    7. रेड प्रतीक 32 पी लेबल orthophosphate के शेष के साथ कंटेनर बंद करें और फ्रिज में जगह.
    8. रेड प्रतीक रेडियोधर्मिता बेंच पर इनक्यूबेटर और जगह से लेबल किया जा कोशिकाओं के साथ 6 अच्छी तरह प्लेटें निकालें.
    9. रेड प्रतीक मध्यम सतह पर तैरनेवाला हटाने और त्यागें. जिसमें फॉस्फेट मुक्त मध्यम 2 मिलीलीटर जोड़ें 32 पी orthophosphate / अच्छी तरह से लेबल.
    10. रेड प्रतीक एक Perspex बॉक्स में संस्कृति प्लेटें प्लेस तो कंटेनर के लिए की निगरानीएक Geiger काउंटर का उपयोग R बाहरी रेडियोधर्मी संदूषण.
    11. रेड प्रतीक समस्थानिक चयापचय लेबलिंग के लिए समर्पित एक यूकेरियोटिक सेल इनक्यूबेटर में कोशिकाओं के साथ Perspex बॉक्स स्थानांतरण.
    12. रेड प्रतीक 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1-20 घंटे के लिए सेते हैं.
      1. सामान्य में, 3 घंटा या अधिक का समावेश समय की सलाह दी है. वांछित के रूप में इष्टतम ऊष्मायन समय प्रत्येक विशिष्ट प्रोटीन के लिए समय पाठ्यक्रम प्रयोगों के माध्यम से मूल्यांकन किया जा सकता है.
    13. रेड प्रतीक वैकल्पिक: परिसर के साथ कोशिकाओं का इलाज.
      1. (जैसे एक kinase अवरोध के रूप में) परिसर उपचार के साथ प्रयोगों में, एक यौगिक उपचार कदम एक में करने के बाद शामिल किया गया हैलेबलिंग के लिए अनुमति देने के लिए मिश्रित बिना ऊष्मायन समय itial. वांछित ऊष्मायन समय के बाद, संस्कृति प्लेटों युक्त Perspex बॉक्स इनक्यूबेटर से हटा रहे हैं और रेडियोधर्मिता बेंच के लिए लाया.
      2. रेड प्रतीक लेबल मध्यम परिसर वांछित एकाग्रता में पतला है जो में prewarmed फॉस्फेट मुक्त माध्यम से हटा दिया है और जगह है. Perspex जार में रखा गया है जो कचरा संग्रहण के लिए एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में मध्यम त्यागें.
      3. रेड प्रतीक प्रकोष्ठों Perspex बॉक्स में बदल दिया और इच्छित संपर्क समय के लिए सेल इनक्यूबेटर में रखा जाता है.
  3. रेड प्रतीक Labe की lysates लीजिएनेतृत्व में कोशिकाओं.
    1. रेड प्रतीक कोशिकाओं से मध्यम निकालें और Perspex जार में रखा गया है जो बेकार संग्रह ट्यूब में डाल दें.
    2. रेड प्रतीक कोशिकाओं Perspex जार में रखा बर्बादी संग्रह ट्यूब में कुल्ला समाधान discarding, बर्फ के ठंडे टीबीएस (Tris 50 मिमी, NaCl 150 मिमी, 7.4 पीएच, 2 मिलीग्राम / कुल्ला) के साथ 2x कुल्ला.
    3. रेड प्रतीक प्रत्येक अच्छी तरह से बर्फ के ठंडे immunoprecipitation (आईपी) lysis बफर के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें और सभी lysed कोशिकाओं को ढीला करने के क्रम में ऊपर और नीचे lysate pipetting द्वारा lysate इकट्ठा.
      1. Protease अवरोध कॉकटेल और फॉस्फेट जोड़ने, आईपी lysis बफर समय से आगे (0.5 मिलीग्राम / नमूना प्लस 5% अतिरिक्त) की मात्रा को तैयारबस का उपयोग करने से पहले ताजा अवरोध करनेवाला कॉकटेल.
      2. lysis बफर की रचना Tris 20 मिमी 7.5 पीएच, NaCl 150 मिमी, EDTA 1 मिमी, ट्राइटन 1%, ग्लिसरॉल 10%, protease अवरोध कॉकटेल और फॉस्फेट अवरोध करनेवाला कॉकटेल है.
    4. रेड प्रतीक एक microcentrifuge ट्यूब lysate स्थानांतरण और कम से कम 10 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं.
    5. रेड प्रतीक 10 मिनट के लिए> 5,000 XG पर एक microcentrifuge में lysates अपकेंद्रित्र.
    6. रेड प्रतीक Perspex ढाल के पीछे जमा हो जाती है, जो समर्पित बेकार डिब्बे में रेडियोधर्मी कचरे के निपटान के.

2. ब्याज की प्रोटीन के लेबल विश्लेषण

  1. रेड प्रतीक Immunopurification (आईपी) द्वारा ब्याज की प्रोटीन को अलग.
    1. रेड प्रतीक वापस बर्फ के लिए centrifuged lysates साथ microcentrifuge ट्यूबों स्थानांतरण और equilibrated झंडा-M2 agarose मोती के 10 μl बिस्तर मात्रा युक्त एक microcentrifuge ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला पिपेट.
      1. समय से आगे equilibrated झंडा-M2 agarose मोती के साथ ट्यूबों तैयार.
      2. इस के लिए, 10 नमूना प्रति μl बिस्तर मात्रा के साथ साथ एक 5% अतिरिक्त के लिए इसी झंडा-M2 agarose घोल की मात्रा विंदुक.
        1. आम तौर पर, मोतियों की एक 10 μl बिस्तर मात्रा 20 μl घोल से मेल खाती है. अधिक जानकारी के लिए उत्पाद डाटा शीट को देखें.
      3. आईपी ​​lysis बफर के 10 संस्करणों (बिस्तर मात्रा के सापेक्ष) में 3x rinsing द्वारा मोती संतुलित करना.
      4. नमूने के रूप में वहाँ के रूप में कई ट्यूबों में 10 μl बिस्तर मात्रा / ट्यूब पर समान रूप से equilibrated मोती बांटो. प्रत्येक नमूने के लिए एक पहचानकर्ता के साथ ट्यूबों लेबल.
    2. रेड प्रतीक एक रेडियोधर्मी तिपतिया प्रतीक के साथ लेबल 50 मिलीलीटर ट्यूब (लगभग 6 microcentrifuge tubes/50 मिलीलीटर ट्यूब) को microcentrifuge ट्यूबों स्थानांतरण और बर्फ पर रख.
    3. रेड प्रतीक 1-20 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण अंत पर अंत के लिए एक ठंडे कमरे के निर्धारित क्षेत्र में एक Perspex ढाल के पीछे एक घूर्णन डिवाइस पर स्थानांतरण नमूनों.
    4. रेड प्रतीक बर्फ पर एक नामित काम की जगह के लिए नमूने स्थानांतरण.
    5. 50523rad1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> एक microcentrifuge (1,000 XG, 1 मिनट) में झंडा-M2 agarose मोती बाध्य प्रोटीन स्पिन और बर्बादी संग्रह ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
    6. रेड प्रतीक 1 मिलीलीटर आईपी धोने बफर में resuspending द्वारा प्रोटीन बाध्य झंडा-M2 agarose मोती धो लें.
      1. आईपी ​​धोने बफर की संरचना: Tris 25 मिमी 7.5 पीएच, NaCl 400 मिमी, ट्राइटन 1%. यह भी सह सफ़ाई proteases से या सह सफ़ाई फास्फेटेजों द्वारा dephosphorylation को गिरावट के प्रति संवेदनशील प्रोटीन के लिए धोने बफर में प्रोटीज और फॉस्फेट inhibitors शामिल करने के लिए सिफारिश की है.
      2. रेड प्रतीक एक microcentrifuge में प्रोटीन बाध्य झंडा-M2 agarose मोती (1,000 XG, 1 मिनट) स्पिन और बर्बादी संग्रह में सतह पर तैरनेवाला त्यागनेtion ट्यूब.
      3. रेड प्रतीक धोने कदम 3x दोहराएँ.
    7. रेड प्रतीक Washes के बाद, 1 मिलीलीटर आईपी कुल्ला बफर (Tris 25 मिमी 7.5 पीएच, 2 MgCl 10 मिमी, dithiothreitol (डीटीटी) 2 मिमी, ट्राइटन 0.02%, बीटा glycerophosphate 5 मिमी, ना 3 वीओ 4 0.1 मिमी) में मोती resuspend.
    8. रेड प्रतीक एक microcentrifuge में प्रोटीन बाध्य झंडा-M2 agarose मोती (1,000 XG, 1 मिनट) स्पिन और बर्बादी संग्रह ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला त्यागने. सभी अतिरिक्त बफर निकालें.
    9. रेड प्रतीक 40 & M में Resuspend मोतीयू, आईपी नमूना एसडीएस लदान बफर के एल (Tris-एचसीएल 160 मिमी 6.8 पीएच, एसडीएस 2%, डीटीटी 0.2 एम, ग्लिसरॉल 40%, bromophenol नीले 2 मिलीग्राम / एमएल).
      1. नमूने तुरंत विश्लेषण किया या गलत विश्लेषण के लिए एक -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में संग्रहीत किया जा सकता है.
        1. रेड प्रतीक रेडियोधर्मी नमूनों के भंडारण के लिए समर्पित एक रेडियोधर्मी तिपतिया प्रतीक लेबल फ्रीजर में एक Perspex बॉक्स में ट्यूब धारकों या बक्से में -20 डिग्री सेल्सियस, जगह नमूने में नमूने के भंडारण के लिए.
    10. रेड प्रतीक Perspex ढाल के पीछे जमा हो जाती है, जो समर्पित बेकार डिब्बे में रेडियोधर्मी कचरे के निपटान के.
  2. रेड प्रतीक एसडीएस पृष्ठ और blo के माध्यम से आईपी नमूनों का समाधान करेंPVDF झिल्ली को टी.
    1. रेड प्रतीक मोती गोली> 1,000 XG पर 1 मिनट के लिए 2 मिनट और अपकेंद्रित्र के लिए 95 डिग्री सेल्सियस को लोडिंग बफर में हीट नमूनों.
    2. रेड प्रतीक एक Perspex स्क्रीन के पीछे रेडियोधर्मिता बेंच पर प्रोटीन जेल वैद्युतकणसंचलन मॉड्यूल तैयार करें.
    3. रेड प्रतीक एक 3-8% Tris-एसीटेट एसडीएस पृष्ठ जैल पर लोड नमूने हैं.
      1. जेल के इस प्रकार के उच्च आणविक भार (HMW) प्रोटीन को हल करने के लिए अनुकूल है. अन्य जेल प्रकार भी इस तरह के एक 4-20% बीआईएस Tricine जेल या Tris-ग्लाइसिन 4-20% जैल के रूप में, उपयुक्त हो सकता है.
      2. HMW प्रोटीन का आकार विचार करने के लिए उपयुक्त है जो एक आणविक वजन मार्कर को शामिल करें.
      4. <ली> रेड प्रतीक 1 घंटे के लिए 150 वी पर वैद्युतकणसंचलन प्रदर्शन करना.
    4. रेड प्रतीक वैद्युतकणसंचलन के बाद, अपने प्लास्टिक आवरण से जेल को हटाने और पश्चिमी सोख्ता स्थानांतरण बफर के साथ एक कंटेनर को जेल हस्तांतरण.
      1. पश्चिमी सोख्ता स्थानांतरण बफर की संरचना: Tris 50 मिमी, Glycine 40 मिमी, एसडीएस 0.04%, मेथनॉल 20%.
      2. रेड प्रतीक ऐसे में अच्छी तरह विभाजक और बाहर लाठी जो जेल के नीचे के हिस्से के रूप में बाहर रहना जो जेल के कुछ हिस्सों से कट.
    5. 1 मिनट के लिए मेथनॉल में सूई से जेल प्रति एक polyvinylidene फ्लोराइड की तैयारी (PVDF) झिल्ली, तो स्थानांतरण बफर में जगह है.
      1. झिल्ली के लिए काट रहे हैं जेल प्लस 3 मिमी की एक मार्जिन के रूप में एएमई आकार.
    6. रेडियोधर्मिता बेंच पर एक अर्द्ध शुष्क सोख्ता मॉड्यूल प्लेस और कवर और ऊपरी इलेक्ट्रोड प्लेट हटा दें.
    7. रेड प्रतीक अर्द्ध शुष्क सोख्ता मॉड्यूल की सतह पर सोख्ता सैंडविच तैयार करें.
      1. सोख्ता मॉड्यूल के नीचे की थाली पर स्थानांतरण बफर और जगह में फिल्टर सोख्ता (7.5 x 10 सेमी बड़ी, मोटी 2.5 मिमी) एक अतिरिक्त मोटी गीला करें.
      2. रेड प्रतीक सोख्ता फिल्टर पर पूर्व गीला PVDF झिल्ली रखें.
      3. रेड प्रतीक ध्यान PVDF झिल्ली पर जेल जगह और किसी भी हवाई बुलबुले को दूर.
      4. 523/50523rad1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> सोख्ता मॉड्यूल के नीचे की थाली पर स्थानांतरण बफर और जगह में एक अतिरिक्त मोटी सोख्ता फिल्टर को गीला करके धब्बा सैंडविच को पूरा करें. सब हवा निकालें सोख्ता सैंडविच में अंत में उपस्थित बुलबुले.
        यहां दिए गए विवरण इलेक्ट्रोड प्रोटीन झिल्ली पर नीचे की तरफ विस्थापित ऐसे हैं कि जहां BioRad पार धब्बा एसडी सिस्टम के साथ संगत है कि कृपया ध्यान दें. अन्य सोख्ता सिस्टम भी उन अंततः खाते में एक और सोख्ता दिशा लेने की जरूरत या, टैंक सोख्ता, ऊपर वैद्युतकणसंचलन बफर के रूप में एक ही तरीके से निपटाया जाना करने के लिए अतिरिक्त तरल अपशिष्ट के मामले में नाबालिग रूपांतरों के साथ इन चरणों के साथ संगत कर रहे हैं.
    8. रेड प्रतीक एक शोषक ऊतक के साथ सभी अतिरिक्त बफर निकालें और ऊपर थाली और अर्द्ध डी के कवर जगह RY मॉड्यूल सोख्ता.
    9. रेड प्रतीक 1-2 घंटे के लिए 15 वी में प्रोटीन स्थानांतरण.
    10. रेड प्रतीक इस समय के दौरान, वैद्युतकणसंचलन मॉड्यूल को साफ.
      1. रेड प्रतीक Perspex ढाल के पीछे जमा हो जाती है, जो समर्पित बेकार डिब्बे में रेडियोधर्मी कचरे के निपटान के.
      2. रेड प्रतीक आसुत जल (ई.) के साथ वैद्युतकणसंचलन मॉड्यूल कुल्ला और रेडियोधर्मी तरल अपशिष्ट कंटेनर में पानी कुल्ला त्यागें.
    11. 0523/50523rad1.jpg "/> हस्तांतरण के बाद, सोख्ता मॉड्यूल से मिट प्रोटीन के साथ PVDF झिल्ली को हटा दें.
    12. रेड प्रतीक वैकल्पिक: प्रोटीन कल्पना करने के लिए मिट प्रोटीन की एक काकरेज़ी रंग एस धुंधला प्रदर्शन करते हैं.
      1. रेड प्रतीक काकरेज़ी रंग एस समाधान युक्त एक उथले दाग ऊष्मायन पोत के लिए धब्बा स्थानांतरण और 5 मिनट के लिए सेते हैं.
      2. रेड प्रतीक ई. में जल्दी 2x कुल्ला.
    13. रेड प्रतीक झिल्ली सूखी.
  3. / Files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> autoradiography प्रदर्शन करना.
    1. रेड प्रतीक 1-5 दिनों के लिए एक स्फुरदीप्ति थाली झिल्ली बेनकाब.
    2. रेड प्रतीक बराबर एक तूफान 840 स्फुरदीप्ति स्कैनर या का उपयोग करते हुए अवगत कराया स्फुरदीप्ति थाली से दूर 32P पढ़ें और एक उच्च संकल्प झगड़ा के रूप में छवि को बचाने.
  4. रेड प्रतीक Immunodetection के माध्यम से प्रोटीन के स्तर का पता लगाने.
    1. रेड प्रतीक मेथनॉल में उन्हें संक्षेप में सूई से झिल्ली rehydrate, तो पीबीएस के साथ एक उथले दाग ऊष्मायन पोत को हस्तांतरण. रेड प्रतीक 5% दूध युक्त (0.1% ट्राइटन साथ पीबीएस) पीबीएस आयकर में झिल्ली ब्लॉक.
    2. रेड प्रतीक उचित धोने कदम और माध्यमिक एंटीबॉडी ऊष्मायन के साथ विरोधी झंडा एंटीबॉडी और प्रक्रिया आगे विरोधी LRRK2 प्रतिरक्षी 13,16 या साथ blots सेते हैं.
    3. रेड प्रतीक LRRK2 के सापेक्ष प्रोटीन का स्तर की पुष्टि करने के chemiluminescence पता लगाने के कार्य करें.
  5. LRRK2 में 32 पी का समावेश यों.
    1. ऐसे ImageJ सॉफ्टवेयर, राष्ट्रीय Instit पर उपलब्ध एक फ्रीवेयर प्रोग्राम के रूप में उपयुक्त सॉफ्टवेयर का उपयोग कर धब्बा autoradiograms और immunoreactivity पर बैंड की densitometric विश्लेषण प्रदर्शनस्वास्थ्य वेबसाइट की Utes ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ).
    2. Immunoreactivity स्तर के ऊपर autoradiographic संकेत के अनुपात के रूप में फॉस्फेट समावेश के स्तर की गणना.

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Representative Results

कोशिकाओं में LRRK1 और LRRK2 के समग्र phosphorylation स्तर की तुलना करने के लिए, 3xflag LRRK1 टैग और LRRK2 HEK293T कोशिकाओं 15 में व्यक्त किया गया. कोशिकाओं 6 अच्छी तरह प्लेटें में सुसंस्कृत थे और 32 पी के साथ लेबल और प्रोटोकॉल पाठ में ऊपर वर्णित के रूप में विश्लेषण किया. चित्रा 1 HEK293T कोशिकाओं में LRRK1 और LRRK2 के चयापचय लेबलिंग के लिए प्रतिनिधि परिणाम से पता चलता है. रेडियोधर्मी फॉस्फेट समावेश LRRK1 और LRRK2 दोनों के लिए मनाया जाता है. सांख्यिकीय महत्व है, हालांकि विरोधी झंडा एंटीबॉडी के साथ immunodetection की densitometric विश्लेषण द्वारा मापा के रूप में प्रोटीन के स्तर के लिए सामान्यीकृत 32 पी के स्तर की मात्रा का ठहराव होने पर, यह LRRK1 का परीक्षण परिस्थितियों में LRRK2 की तुलना में कम है जो एक औसत phosphorylation स्तर पर था पाया गया कि (पी> 0.05) नहीं पहुंचे.

1.jpg "/>
चित्रा 1. LRRK1 और LRRK2 के मेटाबोलिक लेबलिंग. ए LRRK1 और LRRK2 HEK293T कोशिकाओं में व्यक्त पाचन प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में 32 पी के साथ लेबल और वर्गों के परिणाम थे. 32 पी समावेश के प्रतिनिधि autoradiograms (ऊपरी पैनल) के साथ ही उनके 3xflag टैग के माध्यम से LRRK1 और LRRK2 का पता लगाने के प्रतिनिधि पश्चिमी blots (कम पैनल) यहाँ हैं दर्शाया. LRRK1 और LRRK2 के तुलनात्मक चयापचय लेबलिंग के बी मात्रा (n = 4).

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Discussion

इस पत्र 32 पी orthophosphate साथ चयापचय लेबलिंग का उपयोग सेल लाइनों में LRRK1 और LRRK2 के सामान्य phosphorylation स्तर परख करने की क्रिया के लिए एक बुनियादी प्रोटोकॉल प्रदान करता है. समग्र रणनीति सरल है. आत्मीयता LRRK प्रोटीन 32 पी orthophosphate युक्त मध्यम के संपर्क में हैं जो HEK293T कोशिकाओं में व्यक्त कर रहे हैं टैग किया. 32 पी orthophosphate केवल कुछ ऊष्मायन के घंटे और फॉस्फेट युक्त कक्ष में सभी अणुओं के बाद कोशिकाओं से ग्रहण कर लेता है, जिससे radioactively लेबल रहे हैं. आत्मीयता टैग (3xflag) तो immunoprecipitation द्वारा अन्य सेलुलर घटकों से LRRK प्रोटीन को अलग करने के लिए प्रयोग किया जाता है. Immunoprecipitates तो एसडीएस पृष्ठ के माध्यम से अलग हो रहे हैं, PVDF झिल्ली और शामिल फॉस्फेट का विश्लेषण करने के लिए मिट blots पर प्रोटीन की autoradiography (32 पी संकेत) और पश्चिमी पहचान (प्रोटीन संकेत) द्वारा किया जाता है. इस प्रोटोकॉल LRRK2 Au मापने के लिए प्रोटोकॉल से प्रतिष्ठित किया जाना हैकि LRRK1 की लेबलिंग या LRRK2 में tophosphorylation 17 बल्कि शुद्ध प्रोटीन के साथ इन विट्रो phosphorylation प्रतिक्रिया में से सेल संस्कृति में किया जाता है.

यह यहां प्रस्तुत विस्तृत प्रोटोकॉल प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के आधार पर कई रूपों के लिए समायोजित करने के लिए समायोजित किया जा सकता है कि ध्यान दिया जाना चाहिए. लेबलिंग सबसे आम प्रयोगशाला सेल लाइनों में कुशल है के रूप में उदाहरण के लिए, इस प्रोटोकॉल HEK293T सेल लाइन का उपयोग करने के लिए सीमित नहीं है. इसके अलावा, अन्य आत्मीयता टैग ऐसी हा के रूप में, 3xflag के लिए एक विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, Myc, वी 5, GFP या अन्य टैग्स 18 के रूप में कई टैग कुशलतापूर्वक immunoprecipitate LRRK1 या LRRK2 के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. मामले में एक प्रोटीन विशिष्ट एंटीबॉडी LRRK2 11 के लिए मामला है, immunoprecipitation के लिए अनुकूल है कि प्रोटीन के लिए उपलब्ध है, इस के रूप में अच्छी तरह से लागू किया जा सकता है. एक immunoprecipitation ग्रेड प्रोटीन विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ, यह LRRK की चयापचय लेबलिंग प्रदर्शन करने के लिए भी संभव हैप्रोटीन endogenously सेल लाइनों में व्यक्त किया. LRRK2 के मामले में, कई मोनोक्लोनल एंटीबॉडी अंतर्जात LRRK2 19 की जो कर सकते हैं immunoprecipitation वर्णित किया गया है. अंत में, LRRK1 और LRRK2 के लिए यहाँ वर्णित चयापचय लेबलिंग प्रोटोकॉल, भी ऊपर वर्णित सामान्य रणनीति का उपयोग सेल लाइनों से immunoprecipitated किया जा सकता है जो किसी भी अन्य प्रोटीन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

सेल संस्कृति में प्रोटीन के चयापचय लेबलिंग प्रदर्शन से पहले एक महत्वपूर्ण विचार है कि इस तकनीक सेलुलर प्रोटीन phosphorylation निर्धारित करने के लिए उपलब्ध अन्य तरीकों की तुलना में कैसा है. उदाहरण के लिए, विशिष्ट स्थलों पर phosphorylation एक phospho विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग कर immunoblotting द्वारा नजर रखी जा सकती है. इस विधि समस्थानिक लेबलिंग कदम को छोड़कर यहाँ वर्णित उन लोगों, और जब यह उपलब्ध है इस कारण से, इस तकनीक अक्सर 32 पी orthophosphate साथ चयापचय लेबलिंग पर इष्ट है करने के लिए इसी तरह के कदम इस प्रकार है. साथ मेटाबोलिक लेबलिंग 32 पीorthophosphate इसलिए यह विशिष्ट साइटों की phosphorylation पर जानकारी प्रदान नहीं कर सकते, प्रोटीन के समग्र phosphorylation राज्य का प्रतिनिधि है जो एक संकेत देता है. यह LRRK2 10,11 के लिए मामला है के रूप में कई phosphorylation साइटों के साथ प्रोटीन के लिए, चयापचय लेबलिंग तकनीक ही कई immunodetection कदम लंबित phospho विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ निधारित कर सकते हैं जो समग्र phosphorylation स्तर के एक एक कदम मूल्यांकन प्रदान करता है. उदाहरण के लिए, LRRK2 S910/S935/S955/S973 11,20 साइटों यानी के साथ ही हाल ही में विशेषता S1292 साइट 21 सहित अन्य क्षेत्रों के 10 में अपने ANK-LRR interdomain क्षेत्र में अत्यधिक phosphorylated है. व्यक्तिगत phosphosites की भूमिका काटना करने के लिए, यह phosphosite विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ प्रयोगों को तरजीह देने की सिफारिश की है. उदाहरण के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी S910/S935/S955/S973 phosphosites dephosphorylate हैं कि विचार करने की अनुमति दी है phosphositeऐसे R1441C / जी, Y1699C, I2020T, लेकिन नहीं G2019S में 11,22, के रूप में कई रोगजनक म्यूटेंट में डी LRRK2 रोग उत्परिवर्ती रूपों आम तौर पर उच्च phospho-S1292 का स्तर 21 दिखा है. हालांकि, चयापचय लेबलिंग सेलुलर phosphorylation के अन्य अध्ययनों के एक नंबर के लिए उपयोगी होते हैं. मेटाबोलिक लेबलिंग हमेशा अज्ञात phosphorylation साइटों के मामलों में उदाहरण के लिए एक लागू तकनीक है, या phospho एंटीबॉडी उपलब्ध नहीं हैं जब या कम संवेदनशीलता की. (LRRK1 और LRRK2, संख्या 1 के सेलुलर phosphorylation के स्तर की तुलना में यहाँ दिखाया गया है) अंत में, चयापचय लेबलिंग दूसरे के लिए एक एंटीबॉडी से संवेदनशीलता में मतभेद दिया phosphosite विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ क्या करना चुनौतीपूर्ण है, जो एक तुलना, विभिन्न प्रोटीन के समग्र phosphorylation के स्तर की तुलना की अनुमति देता है .

अंत में, वर्तमान प्रोटोकॉल कोशिकाओं में LRRK प्रोटीन की समग्र phosphorylation के स्तर के कुशल मूल्यांकन की अनुमति देता है. प्रोटोकॉल आसानी से नजर रखने के लिए अनुकूलित किया जा सकताकोशिकाओं में व्यक्त की और immunoprecipitation से अलग किया जा सकता है कि किसी भी अन्य प्रोटीन की phosphorylation. Phosphosite विशिष्ट एंटीबॉडी अध्ययन में या उनकी मान्यता में एक कदम के रूप में प्रोटीन के लिए उपलब्ध नहीं हैं, जब इस प्रोटोकॉल के उपयोग की सिफारिश की है. प्रयोगात्मक लक्ष्य चयापचय लेबलिंग के माध्यम से इस तरह की तुलना के रूप में 2 या अधिक विभिन्न प्रोटीन के समग्र phosphorylation तुलना करने के लिए है जब यह प्रोटोकॉल विशेष रूप से उपयोगी है दूसरे के लिए एक प्रोटीन से phosphorylation का पता लगाने की संवेदनशीलता में मतभेद से पक्षपाती नहीं कर रहे हैं. विशेष रूप से LRRK1 और LRRK2 के लिए, इस तकनीक अपेक्षाकृत LRRK1 phosphorylation विनियमन खराब समझा जाता है, जबकि इस तरह के बदलाव, LRRK2 11,13,23 के लिए वर्णित किया जा करने के लिए शुरू कर दिया है कि दिए गए LRRK1 और LRRK2 के phosphorylation में गतिविधि निर्भर परिवर्तन, निगरानी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम भी इस अध्ययन का समर्थन माइकल जे फॉक्स फाउंडेशन के लिए आभारी हैं. फ़्लैंडर्स FWO (FWO परियोजना G.0666.09, जेएमटी को वरिष्ठ शोधकर्ता फैलोशिप), आईडब्ल्यूटी SBO/80020 परियोजना न्यूरो लक्ष्य, यू लोवेन (OT/08/052A और IOF-KP/07 / 001) - हम रिसर्च फाउंडेशन को धन्यवाद उनके समर्थन के लिए. इस शोध भी जेएमटी को राजा Baudouin फाउंडेशन द्वारा प्रबंधित फंड Druwé-Eerdekens द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphorus-32 Radionuclide, 1 mCi, buffer disodiumphosphate in 1 ml water Perkin Elmer NEX011001MC
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (D-MEM) (1X), liquid (high glucose) Invitrogen 11971-025 This medium contains no phosphates
Anti Flag M2 affiinty gel Sigma A2220 For an equivalent product with red colored gel (useful to more easily visualize the beads), use cat. No. F2426.
Extra thick blotting filter Bio-Rad 1703965
Ponceau S solution Sigma P7170

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References

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सेलुलर जीवविज्ञान अंक 79 जीव विज्ञान (सामान्य) जैव रसायन जैव अभियांत्रिकी (सामान्य) LRRK1 LRRK2 चयापचय लेबलिंग 32P orthophosphate immunoprecipitation autoradiography
Leucine रिच के चयापचय लेबल रेडियोधर्मी फास्फेट के साथ Kinases 1 और 2 दोहराएँ
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Taymans, J. M., Gao, F., Baekelandt, … More

Taymans, J. M., Gao, F., Baekelandt, V. Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate. J. Vis. Exp. (79), e50523, doi:10.3791/50523 (2013).

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