Summary
실험 데이터의 시각화는 과학계에 결과를 제시하는 핵심 요소가되고있다. 성장하는 배아의 살아있는 시간 경과 기록의 생성은 복잡한 발달 과정의 더 나은 표현과 이해에 기여한다. 이 프로토콜은 제브라 피쉬의 단풍 나무 단백질의 광 변환을 통해 셀 라벨에 대한 단계별 가이드입니다.
Abstract
척추 palatogenesis는 두개골 신경 능선 (CNC) 세포 융합과 얼굴 홍염의 확장 및 두개 안면 골격 성숙의 마이그레이션을 포함하는 고도의 안무와 복잡한 발달 과정이다. 단풍 나무 형질 전환 제브라 피쉬 라인이 생성되었습니다 제브라 피쉬 미각의 특정 지역 sox10에 두개골 신경 능선의 기여를 공부합니다. Sox10함으로써 기존의 염료 또는 기자 mRNA의 주입보다 더 정확한 과정을 라벨 세포를 만드는 신경 능선에 단풍 나무 기자 단백질의 계보 제한을 제공합니다. 단풍 나무는 사진을 활성화 한 후 녹색에서 적색으로 점등하고 가능한 정확하게 세포를 수행 할 수있게 광 변환 단백질이다. sox10 : 단풍 나무 유전자 변형 라인은 하악 요소에 비해 상악에 상승을 제공하고 양막 류 (amniotes)에 얼굴 홍염의 상 동성을 설명 CNC의 세포 집단을 묘사하는 혈통 분석을 수행하는 데 사용되었다. 이 프로토콜은 공정을 설명단풍 나무 제브라 피쉬 배아 : sox10의 라이브 시간 경과 비디오를 생성하는의. 사골 판의 개발은 실용적인 예제가 될 것입니다. 이 프로토콜은 형질 전환 제브라 피쉬의 모든 단풍 나무 또는 유사한 photoconvertible 기자 단백질의 시간 경과 공 촛점 촬영하기에 적용 할 수 있습니다. 또한, 제브라 피쉬 돌연변이있는 두개 안면 구조의 정상 만 아니라 비정상적인없는 발전을 캡처하는 데 사용될 수있다.
Introduction
구강 안면 쪼개진 조각이 1/700-1로, 가장 널리 두개 안면 기형을 나타내고, 000의 배송은 1에 영향을 미쳤다. 초기 배아 두개 안면 개발의 중단은 갈라진 입술과 구개 (CL / P)의 형성으로 이어질 수 있습니다. syndromic 분열에 대한 원인은 크게 표시되어 있지만, 구강 안면 clefting의 nonsyndromic 형태의 유전과 후생 유전 학적 기초는 여전히 2-4를 발견해야합니다. 이러한 기형의 병인 및 발병 기전을 이해하기 위해, 셀룰러 기초 두개 안면 구조의 발달을 규명 할 필요가있다.
모든 척추 동물 종에서 두개골 신경 능선 세포 (CNCC)는 구강 안면 구조의 형성에 기여 인두 아치를 채우는 등의 신경 튜브에서 마이그레이션. 초기 배아 신경 능선 개발 중단 CL / P 5-7를 포함한 두개 안면 기형의 형성으로 이어질 수 있습니다.
광고에제브라 피쉬와 포유류의 두개 안면 개발 (CNCCs는 상동 지역에 거주) 사이의 구조적 유사성에 dition은 유전자 조절 네트워크는 매우 절약됩니다. 또한 CNCCs은 제브라 피쉬에게 CL / P.의 발달과 유전 적 기초 연구를위한 강력한 유기체를 만드는 amniote 종과 제브라 피쉬 8과 같은 방식으로 개발하는 것으로 나타났습니다 그것은 작은 크기, 신속하고 전 자궁 내 배아 발달, 높은 번식 속도 등 많은 장점을 가지고 있습니다. 또한, 배아는 현미경 9에서 복잡한 발달 사건의 관찰에이 의무 만들기, 광학적으로 투명합니다. 그것은 마이그레이션 및 두개골 신경 능선 세포의 분화 연구를위한 이상적인 동물 모델입니다.
단풍 나무 형질 전환 모델 5 : 이전에 출판 된 작품 8, 10, 11, CNCC의 이주 패턴에 확장하는 sox10를 사용하여 상세하게 설명했다. 단풍 나무는 광 변환 단백질입니다 TU사진을 활성화 한 후 녹색에서 빨간색으로 RNS와는 가능한 정확하게 CNCCs를 추적 할 수 있습니다. 이 변환 동안 펩타이드 골격은 변환이 세포가 자신의 최종 목적지 (12)에 추적 할 수있는 의미, 안정 것을 제안, 절단됩니다. sox10의 전사 제어에 단풍 나무로 표지 유전자 변형 라인은 amniote 구개 및 제브라 피쉬의 사골 판은 Y 모양의 융합 솔기 사이 유사하다 frontonasal 돌기 (FNP)와 그 양측 상악 홍염 (MXP)의 융합에 의해 상동 형성되는 것으로 나타났다 종.
다른 응용 중에서도 sox10 : 단풍 나무 형질 전환 지브라 피쉬 모델은 정상 및 비정상 두개 안면 구조의 형성을 보여주기 위해 다양한 개발 단계에 제브라 피쉬 배아의 영상을 생성하는 데 사용 하였다. 세포의 특정 그룹의 광 변환은 가능한 그들의 발달을 추적 할 수있다. craniofac 개발의 라이브 영상을 만들려면이 방법 접근 방식제브라 피쉬의 원점이라 구조는 쉽게 시각적으로 복잡한 발달 과정을 설명하기 위해 제작, 도입된다.
예를 들어 형질 전환 지브라 피쉬 단풍 나무 :이 프로토콜은 sox10있는 사골 플레이트의 정상적인 발전을 이용하여 동영상을 생성하는 이들의 경험을 공유 할 목적으로한다. 이 프로토콜은 더 제브라 피쉬의 뇌 신경 능선 세포에서 파생 된 구조의 시간 경과 비디오를 만들기에 적용 할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 광 변환을위한 배아 컬렉션
- 저녁에 5 오후 6시 사이에 단풍 나무 형질 전환 제브라 피쉬 : sox10의 최소한 10 쌍을 설정합니다.
- 다음 날 아침, 분배기를 끌어 정오 경 계란을 수집합니다. 페트리 접시로 전송하고 28.5 ° C의 배양기에 넣어.
- 약 24 시간 게시물 수정에서 죽은 태아를 제거하여 배양 접시를 청소합니다. 라이트 필드 현미경 및 향상된 녹색 형광 단백질 (EGFP) 필터가 부착 된 형광 현미경을 이용하여 배아 (13)의 발달 단계를 확인합니다. 단풍 나무는이 필터를 통해 볼 수 있습니다.
- 배아는 별도의 배양 접시에 60 HPF 전송 다섯 밝은 형광 배아에 도달하고 필요한 경우 dechorionate합니다.
2. 광 변환을위한 배아의 설치
- 일반 형광 현미경을 사용하여 배아를 장착합니다. 공 초점 현미경에 배아의 설치는 매우 도전이다.
- 스탠드를 사용하여ARD E3 물 또는 다음과 같은 조리법을 사용하여 신선한 E3를 준비 :
1X E3L을 확인하기 위해 다음을 추가 증류수 Dh를 2 O의 L로 다음을 추가합니다 :
0.292 g 5.0 mM의 NaCl을
0.013 g 0.17의 KCl
0.044 g 0.33mM 염화칼슘 (건조, 96 %, ACS 시약)
0.081 g · 33 mM의 망초 (anhydrated)
선택 사항 : 살균제 및 교반으로 1X E3에 0.05 % 메틸렌 블루의 200 μl를 추가합니다.
매체는 실온에서 1 주간 유지한다. - 표준 tricaine를 사용하거나 다음 조리법을 사용하여 tricaine을 준비 :
0.2 %의 5 L를 들어 다음과 같은 재료를 혼합 tricaine :
45 ㎖의 트리스로-C1 (1M pH9.5)
5 LH 2 O
10g의 tricaine - 46.25 ml의 E3에 4,125 ml의 0.2 % tricaine를 추가하여, '영화 주스'(50 ㎖ E3, 0.015 %의 tricaine 솔루션)을 준비합니다.
- 50 ㎖ 유리 플라스크에 46.35 mg의 저 융점 (LMP) 아가로 오스와 46.25 ML E3 물을 혼합하여 아가로 오스 준비하고 레인지 작동에 의해 고체 입자를 용해. 그런 다음 추가아가로 오스 및 사용 때까지 50 ° C의 물을 욕조에 아가로 오스와 유리 플라스크를 넣어 3.73 ㎖의 0.2 % tricaine.
3. 준비 및 배아의 장착
- 챔버 슬라이드 스텝 1.1.2 및 전송 배아에서 만든 E3/0.015 %의 tricaine 솔루션으로 배아를 마취.
- 종이 조직 및 배아 상 아가 있던 모든 초과 E3를 흡수.
- 위치 배아 완벽 microloader 팁과 지느러미. 전체 배아 아가로 오스 위에 떠 있지만, 몸 전체를 아래로 밀어하지 않도록하십시오. 챔버가 완전히 액체로 가득 때까지 아가 포함 된 배아에 E3/0.015 %의 tricaine 솔루션을 붓는다.
4. 공 초점 현미경에 소프트웨어 설정을 조정
- 배아를 초점을 맞추기 위해, 20X 공기 내수성 목적 (구멍 크기 20 개구 825)를 사용합니다. 그런 다음 현미경 L100 라이트 버튼을 누르면 소프트웨어에서 채널을 선택합니다. 아이콘을 볼 오픈 / 수집 controls/A1settings와 카릭공 초점 설정 버튼을 K. 다음 '자동'을 클릭하고 다시 창을 닫기 전에 다음 채널을 선택 :
CH1 : DAPI 채널 403.4 NM (350-410 나노 미터 사이의 파장이 사용될 수있다)
채널 2 : 488.0 nm의
3 장 : 561.9 nm의
5. 광 변환
- 채널 1과 3의 전원을 끄고 제거 연동 버튼 및 스캔을 클릭하기 전에 채널 2를 켭니다.
- 광 변환에 대한 관심의 세포에 집중하는 것입니다 1frame/sec 고전압 (HV) 200로 시작하는 다음 프레임 / 초에 예정하고 그에 따라 약 1 / 32 프레임 / 초와 HV에 도달 할 때까지 HV를 낮추는 방법으로 수행하는 것이 가장 100 ~ 120, 배경 잡음에 따라.
- 배아에 초점이 맞으면, 화면의 오른쪽 가장자리에 보이는 녹색 테두리를 잡고는 광 변환하고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭에 대한 관심의 영역을 맞도록 더 작게 만든다. 광 변환은 되돌릴 수 있기 때문에 작은 좋습니다.
- (200)에 1 HV에 프레임 / 초를 켜고 충돌스캔 할 수 있습니다. 광 변환의 영역에서 확대 된 이미지는 이제 볼 수 있습니다.
- 채널 1 (403.4 nm의)에 돌려 Photoconvert 세포. GFP 채널을 통해 본 녹색 단풍 나무가 거의 없을 때까지이 지역의 크기에 따라, 어디 5-60초 photoconverting 레이저에 노출.
- 녹색 단풍 나무의 신호가 거의없는 경우, 채널 1을 끄십시오. 채널 2와 3을 켭니다. 그런 다음 A1 스캔 영역 필드에 창에 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 원하는 세포 photoconverted했다 있는지 확인하는 '원래 크기로 돌아 가기'를 누르십시오.
6. Z-스택 만들기
- 메뉴 표시 줄의 아이콘 '캡처 Z-시리즈'를 찾아서 시작하기 전에 Z-스택의 상한과 하한을 설정합니다. LUT를 설정합니다.
7. 소프트웨어 설정 시간 경과
- A1Simple GUI 상자로 이동 한 다음 설정을 선택해서
1 / 32 프레임 / 초
크기 1024
보통 4 또는 8X 한 루프에서 촬영되어야하는 Z-스택의 수에 따라 - :로 이동보기 / 인수 컨트롤 / ND 순서 수집 및 설정 기간 (8 - 30 분), 연속 클릭하고 Z-스택을 클릭합니다. 테스트 이전의 경계를 설정하고 영화를 시작합니다.
- 하루 동안 E3/0.015 %의 tricaine 솔루션 챔버 슬라이드를 계속 추가. 밤에는 완전히 실을 입력합니다. 그 다음날 아침까지 지속됩니다.
- 다음 날 아침, E3/0.015 %의 tricaine 솔루션을 보충하고 태아가 아직 살아 있는지 확인. 형광의 손실이 죽음을 나타냅니다. 하루 동안 보충 및 검사를 계속합니다.
- 구조가 형성 완료, 또는 태아가 사망 한 때, 영화를 완성합니다.
8. 포스트 프로덕션 처리
- 도구 모음에 '쇼 최대 강도 투사'를 클릭 한 다음 이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 새 문서를 만듭니다. 동영상은 현재 최고의 품질을 볼 수 있습니다. 필요없는 프레임을 삭제하고의 LUT를 조정에 대한 이동합니다. 마지막으로. AVI로 저장합니다. 이 형식은 Windows 용 잘 될 것입니다. 맥 소프트웨어 다운로드 T에 대한오. MOV 또는. wmv로 변환합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
sox10의 : 단풍 나무 형질 전환 라인, 이주 및 사후 이주 CNCCs은 형광 녹색 표시되어 있습니다. 녹색 형광 단풍 나무로 표지 CNCC 세포는 내생 sox10의 mRNA 발현 5 요점을 되풀이.
다른 애플리케이션 사이에서,이 동물 모델은 더 CNCC 종속 두개 안면 구조의 발달을 시각화하는데 사용되었다. 특정 구조 또한 두개 안면 기형의 병리학 적 개발, 특히 갈라진 입술과 구개의 정상적인 발달을 캡처 한. 다른 발달 시점에 제브라 피쉬의 라이브 시간 경과 비디오 시리즈가 생성되었습니다.
예로서, 60 HPF에서 배아는 페어링 trabeculae은 사골 플레이트를 형성하기 위해 충족되는 스테이지 선택 하였다. 사골 판에서 세포의 가장 앞쪽 부분의 빨간색 표시의 결과로 일방적 인 대상으로 광 변환을 수행 하였다. 우선, 통상의 확장과 토륨의 형성전자 사골 판은 야생형 튀빙겐의 제브라 피쉬 (그림 1과 비디오 1 참조)에서 관찰되었다. 사골 판의 정상적인 발달에 대한 이해, 야생 유형 참조는 다음 정상적인 유전자 발현이 교란 된 배아 CNCCs의 마이그레이션을 비교하기 위해 적용되었다.
specc1lb의 모르 폴리 노 넉다운 제브라 피쉬 배아가 대표적인 예로서 선택되었다. SPECC1L은 드물지만 심각한 비스듬한 얼굴 분열의 개발에 연루 최초의 유전자입니다. 사골 판의 양측 얼굴 clefting에있는 제브라 피쉬의 결과에 SPECC1L 상동의 specc1lb의 모르 폴리 노 기반의 최저. specc1lb 안티센스 모르 폴리 주입되었던 60 HPF 배아에서 배아 선정되고 접시 사골 세포의 가장 앞쪽 부분은 일방적 photoconverted 하였다. 사골 판의 정상적인 발달, 중간 사골 판 세포 사이의 융합의 실패는 대조적으로횡 사골 판 세포가 관찰 될 수있다. 이 외측 비 공정과 상악 돌기 사이의 융합의 실패 (비디오 2 참조)가 발생 인간의 ObFC 개발의 발병 기전과 유사합니다.
그림 1. 단풍 나무 형질 전환 제브라 피쉬 : sox10 :. 60 HPF의 sox10의 단풍 나무의 광 변환 A. 복부보기. 구조는 그림에 녹색 표시와 해당 실제 라이브 영상은 사골 판과 비슷합니다. 공 초점 현미경 (403.4 nm에서) 자외선에 노출 된 후, 형광 단백질의 단풍 나무가 녹색에서 빨간색으로 photoconverted된다. B. 패널 B에서와 같이 세포가 올 수 있습니다 photoconverted.
영화 1. 시간 경과 비디오 60 HPF 단계 야생형 튀빙겐 제브라 피쉬 배아.사골 판의 정상적인 형성. 복부 볼 수 있습니다. 60-72 HPF를 시작 매 30 분. 녹화 된 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
영화 2. 시간 경과 비디오 60 HPF 단계 specc1lb의 모르 폴리 노 주입 배아. 중간 사골 판 세포와 측면 사골 판 세포 사이의 융합의 실패를 관찰 할 수있다. 복부 볼 수 있습니다. 60-72 HPF를 시작 매 30 분. 녹화 된 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
다음은 제브라 피쉬 모델에서 두개 안면 개발의 시각화를위한 새로운 방법이 표시됩니다. sox10 : 단풍 나무 형질 전환 제브라 피쉬 라인이 성공적으로 자세히 CNCC의 이주 패턴을 설명하는 데 사용 된이 모델 생물 5로 사용됩니다.
이전 연구는 세포를 대상으로 같은 눈으로 총 랜드 마크를 사용하고 단풍 나무 mRNA의 주입, 광 변환 분석 또는 광 변환 10, 11, 14, 15 갇힌 플루 오레 덱스 트란에 의존 삭스 :. 10 단풍 나무 형질 전환 라인이에 비해 많은 장점을 가지고 방법. 신경 능선 세포 이미 단풍 나무 및 매우 특정한 분포를 따르는로 표지로, 운명 매핑에 영역을 설정하기위한 더 정확한 마크가 사용될 수있다. 또, 단풍 나무 갖는 단백질 sox10 프로모터의 제어하에 발현 내생는 신경 능선 세포 photoconverted되도록하고 만 유도체는 이후 단계에서 표시 될 것이다 데잠재적 인 배경 (5) 주름.
이 기술로, 제브라 피쉬의 두개 안면 구조를 파생 된 신경 능선 세포의 형성이 성공적으로 표시 할 수 있습니다. 통상 야생형 제브라 피쉬 배아의 발달은 다음이 될 수 있고, 야생형 참조는 통상 유전자 발현을 교란 된 배아와 비교 될 수있다.
잠재적 인 수정을 시각화하는 동안 배아를 해결하기 위해 다른 용기를 사용하여 있습니다. 이 페트리 접시, 또는 다른 반투명 트레이가 될 수 있습니다.
촬상이 실패하면, 이는 소프트웨어 설정의 실수 가능성이 높다. 라이브 시간 경과를 시작하기 전에주의 깊게 현미경의 사용자 설명서를 참조하십시오.
촬상 동안, 배아의 오른쪽면에 초점을 정확하게 Z-스택 경계를 설정하는 것이 중요하다. 또한, 이러한 프레임 / 초, 보통의 LUT와 같은 화상 품질 파라미터는 제일 WA로 설정해야높은 품질의 결과를 얻기 위해 가능한 Y.
이 기술의 잠재적 인 제한은 주변 조직은 또한 UV 광에 노출되는대로, 단일 세포 기초 레이블 세포에 기술적으로 어려운 것이있다. 세포 증식이 빠른 경우 또한, 레드 라벨은 세포 분열 후 희석을 통해 손실됩니다.
또, 단풍 나무가 량체이고 다른 단백질에 융합 된 경우 응집체를 형성하는 경향이있다. 이 라이브 셀 이미징에있는 대부분의 퓨전 애플리케이션에서의 사용을 제한합니다.
라이브 시간 경과 영상은 과학계와 폭 넓은 관객들에게 복잡한 개발 실험 데이터를보다 쉽게 액세스 할 수 있도록하는 중요한 도구입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
저자는 친절하게 제브라 피쉬 sox10 프로모터 시약을 공유 로버트 켈쉬 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sox10:kaede transgenic zebrafish line | MGH | Available via the Liao lab | |
| Petri dishes 100x15 mm | BD Falcon | 351029 | |
| Petri dishes 35 mmx10 mm | BD Falcon | 351008 | |
| Ultrapure Low melting point (LMP) Agarose | Invitrogen | 15517022 | |
| Lab Tek 2 Chamber SlideSystem | LabTek | 154453 | |
| Microloaders 200/pk | Fisher | E5242956003 | |
| Nikon A1R Si Confocal Ti series | Nikon | No Catalog number | |
| NIS Elements Software AR3.2 64-bit | Nikon | No Catalog number |
References
- Prevalence at Birth of Cleft Lip With or Without Cleft Palate: Data From the International Perinatal Database of Typical Oral Clefts (IPDTOC). Cleft Palate Craniofac. J. 48 (1), 66-81 (2011).
- Dixon, M. J., et al. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences. Nat. Rev. Genet. 12 (3), 167-178 (2011).
- Mangold, E., Ludwig, K. U., Nothen, M. M. Breakthroughs in the genetics of orofacial clefting. Trends Mol. Med. 17 (12), 725-733 (2011).
- Kimmel, C. B., Miller, C. T., Moens, C. B. Specification and morphogenesis of the zebrafish larval head skeleton. Dev. Biol. 233 (2), 239-257 (2001).
- Dougherty, M., et al. Embryonic Fate Map of First Pharyngeal Arch Structures in the sox10: kaede Zebrafish Transgenic Model. J. Craniofac. Surg. 23 (5), 1333-1337 (2012).
- Trainor, P. A., Krumlauf, R. Hox genes, neural crest cells and branchial arch patterning. Curr. Opin. Cell Biol. 13 (6), 698-705 (2001).
- Schilling, T. F., Kimmel, C. B. Segment and cell type lineage restrictions during pharyngeal arch development in the zebrafish embryo. Development. 120 (3), 483-494 (1994).
- Swartz, M. E., et al. Examination of a palatogenic gene program in zebrafish. Dev. Dyn. 240 (9), 2204-2220 (2011).
- McCollum, C. W., et al. Developmental toxicity screening in zebrafish. Birth Defects Res. C. Embryo Today. 93 (2), 67-114 (2011).
- Wada, N., et al. Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull. Development. 132 (17), 3977-3988 (2005).
- Eberhart, J. K., et al. Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development. Development. 133 (6), 1069-1077 (2006).
- Ando, R., et al. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 99 (20), 12651-12656 (2002).
- Kimmel, C. B., et al. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203 (3), 253-310 (1993).
- Kawakami, A., et al. The zebrafish-secreted matrix protein you/scube2 is implicated in long-range regulation of hedgehog signaling. Curr. Biol. 15 (5), 480-488 (2005).
- Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. Cell tracking using photoconvertible proteins during zebrafish development. J. Vis. Exp. (67), e4350 (2012).
