Summary
Visualisation des données expérimentales est devenu un élément clé dans la présentation des résultats à la communauté scientifique. Génération de direct enregistrement time-lapse d'embryons croissance contribue à une meilleure présentation et la compréhension des processus de développement complexes. Ce protocole est un guide pour le marquage des cellules par l'intermédiaire de photoconversion de la protéine chez le poisson zèbre kaede étape par étape.
Abstract
Vertébré palatogenesis est un processus de développement très chorégraphiée et complexe, qui implique la migration de la crête neurale crânienne (CNC) des cellules, la convergence et l'extension des protubérances du visage, et la maturation du squelette cranio-facial. Pour étudier la contribution de la crête neurale crânienne à des régions spécifiques du palais de poisson zèbre un de SOX10: Kaede ligne de poisson zèbre transgénique a été généré. Sox10 fournit restriction de la lignée de la protéine Kaede rapporteur de la crête neurale, ce qui rend la cellule étiquetage d'un processus plus précis que colorant traditionnel ou injection d'ARNm rapporteur. Kaede est une protéine de photo-convertible qui passe du vert au rouge après l'activation de photo et permet de suivre précisément les cellules. Les SOX10: Kaede ligne transgénique a été utilisé pour effectuer une analyse de la lignée de délimiter les populations de cellules CNC qui donnent lieu à maxillaire par rapport à des éléments mandibulaires et illustrent homologie des protubérances du visage pour amniotes. Ce protocole décrit l'étape consistant às pour générer une vidéo en time-lapse en direct d'un SOX10: embryon de poisson zèbre Kaede. Développement de la plaque ethmoïde servira un exemple pratique. Ce protocole peut être appliqué à la réalisation d'un time-lapse enregistrement confocale de toute Kaede ou protéine rapporteur photoconvertible similaire chez le poisson zèbre transgénique. En outre, il peut être utilisé pour capturer non seulement normal, mais aussi anormale développement des structures craniofaciales dans les mutants de poisson zèbre.
Introduction
Les fentes faciales représentent la déformation craniofaciale la plus répandue, avec 1/700-1, 000 livraisons affectées 1. Perturbation du développement cranio-facial embryonnaire précoce peut conduire à la formation de fente labio-palatine (FL / P). Bien que les causes de fissure syndromique ont été largement représenté, les bases génétiques et épigénétiques de formes non syndromiques de clefting buccofaciale doivent encore être mis au jour 2-4. Afin de comprendre l'étiologie et la pathogenèse de ces malformations, il est nécessaire d'élucider le développement des structures craniofaciales sur une base cellulaire.
Dans toutes les espèces de vertébrés cellules de la crête neurale crânienne (CNCC) migrent du tube neural dorsal pour remplir les arcs pharyngiens, ce qui contribuera à la formation de structures oro-faciales. Perturbation du développement précoce de la crête neurale embryonnaire peut conduire à la formation de malformations cranio-faciales, y compris CL / P 5-7.
Dans annoncecondition des similitudes structurelles entre le poisson zèbre et le développement cranio-facial chez les mammifères (CNCCs résident dans des régions homologues), le réseau de régulation génique est hautement conservée. Il a également été montré que CNCCs développer de la même manière entre les espèces de poisson-zèbre amniote et 8, ce qui rend le poisson zèbre d'un organisme efficace pour l'étude de la génétique et développementale base de CL / P. Il présente de nombreux avantages, y compris de petite taille, rapide et ex-utero le développement embryonnaire, et les taux de reproduction élevé. De plus, l'embryon est optiquement transparent, ce qui prête à l'observation d'événements complexes de développement sous la loupe 9. Il s'agit d'un modèle animal idéal pour l'étude de la migration et la différenciation des cellules de la crête neurale crâniens.
Étendre sur le travail déjà publié 8, 10, 11, le modèle migratoire de la CNCC a été décrite en détail à l'aide des SOX10: Kaede modèle transgénique 5. Kaede est une protéine de photo-convertible que turns du vert au rouge après l'activation de photo et permet de retracer CNCCs précisément. Au cours de cette transformation dans le squelette peptidique est clivée, ce qui suggère que la conversion est stable, ce qui signifie les cellules peuvent être suivis à leur destination finale 12. Les lignées transgéniques étiquetés avec kaede sous contrôle transcriptionnel d'SOX10 ont montré que la bouche de amniote et la plaque ethmoïde de poisson-zèbre sont formées de manière homologue par fusion de saillies maxillaires bilatérales (MXP) avec la proéminence frontonasal (FNP), et que la couture de fusion en forme de Y est similaire entre espèces.
Parmi d'autres applications, les SOX10: Kaede transgénique modèle de poisson zèbre a été utilisé pour générer des vidéos de embryons de poisson zèbre à différents stades de développement de montrer la formation de structures cranio-faciales normales et anormales. Photoconversion de groupes spécifiques de cellules, il est possible de suivre leur développement. Avec cette méthode, une approche pour créer l'imagerie en direct de développer craniofacstructures ial chez le poisson zèbre est introduit, le rendant facile à démontrer visuellement ce processus complexe du développement.
Ce protocole vise à partager l'expérience de la production de ces vidéos à l'aide au développement normal de la plaque ethmoïde dans SOX10: poisson zèbre transgénique Kaede, par exemple. Ce protocole peut en outre être appliquée à faire des vidéos time-lapse de toute structure dérivée de cellules de la crête neurale crânienne chez le poisson zèbre.
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Protocol
Une. Collection d'embryons pour Photoconversion
- Mettre en place au moins dix paires de SOX10: poisson zèbre transgénique Kaede entre 5 et 18 heures dans la soirée.
- Le lendemain matin, tirez diviseurs et ramasser les œufs vers midi. Les transférer à des boîtes de Pétri et les mettre dans 28,5 ° C incubateur.
- Aux environs de 24 heures après la fécondation, nettoyer les boîtes de Pétri en supprimant des embryons morts. Vérifiez le stade de développement des embryons 13 en utilisant la microscopie champ de lumière et tout microscope à fluorescence avec la protéine fluorescente verte (EGFP) de filtre. Kaede sera visible à travers ce filtre.
- Lorsque embryons atteignent 60 transfert de HPF cinq embryons fluorescentes vives dans une boîte de Petri séparée et dechorionate si nécessaire.
2. Montage des embryons pour Photoconversion
- Montez l'embryon en utilisant un microscope à fluorescence normale. Montage des embryons sur microscope confocal est extrêmement difficile.
- Employez le stand deeau ard E3 ou préparer E3 frais en utilisant la recette suivante:
Ajouter le texte suivant pour un litre d'eau distillée dH de l'eau 2 O ajouter ce qui suit à faire 1x E3L:
0,292 g NaCl 5.0
0,013 g KCl 0.17mm
0,044 g 0.33mm CaCl 2 (déshydratant, 96%, réactif ACS)
0,081 g 0,33 mM MgSO 4 (anhydrated)
Facultatif: ajouter 200 ul de 0,05% de bleu de méthylène à 1X E3 comme fongicide et remuer.
Moyen maintient à la température ambiante pendant 1 semaine. - Utilisez tricaine standard ou préparer tricaine utilisant recette suivante:
Pour 5 L de 0,2% tricaïne mélanger les ingrédients suivants:
45 ml de tris-Cl (1M pH 9,5)
5 LH 2 O
10 g tricaine - Préparer «jus de film" (50 ml E3, solution de tricaine 0,015%), en ajoutant 3,75 ml de 0,2% à 46,25 ml tricaine E3.
- Préparer agarose en mélangeant 46,25 ml d'eau avec 46,35 mg E3 bas point de fusion (LMP) d'agarose dans un flacon en verre de 50 ml et dissoudre les particules solides par les micro-ondes. Puis ajouter3,73 ml de 0,2% d'agarose à tricaïne et mettre ballon en verre avec de l'agarose à 50 ° C bain d'eau jusqu'à l'utilisation.
3. Préparation et montage de l'embryon
- Anesthésier embryons avec une solution de tricaine E3/0.015% rendue à l'étape 1.1.2 et le transfert d'embryons à la chambre diapositive.
- Imprégnez-vous de tout excès E3 avec du papier et la vente d'agarose sur l'embryon.
- Position embryon parfaitement dorsale avec des conseils de microloader. Assurez-vous que l'ensemble de l'embryon ne flotte pas au-dessus de la gélose, mais pousser l'ensemble du corps vers le bas. Puis verser la solution de tricaine E3/0.015% par rapport à l'embryon agarose embarqué jusqu'à la chambre est entièrement rempli de liquide.
4. Réglage des paramètres du logiciel sur microscope confocal
- Utilisation air 20X objectif immersible (ouverture numérique de 0,75, la taille de trou d'épingle 20) pour focaliser l'embryon. Ensuite, appuyez sur le bouton d'éclairage L100 sur le microscope et sélectionner les canaux dans le logiciel. Controls/A1settings ouvrir les icônes voir / d'acquisition et click le bouton de configuration confocale. Ensuite, cliquez sur "auto" et sélectionner les canaux suivants avant de fermer la fenêtre de nouveau:
Ch1: DAPI canal 403.4 nm (longueur d'onde de 350 à 410 nm entre peuvent être utilisés)
Ch2: 488,0 nm
Ch3: 561,9 nm
5. Photoconversion
- Désactiver Ch1 et 3 et tourner sur Ch2 avant de cliquer sur le bouton supprimer de verrouillage et de numérisation.
- Focus sur les cellules d'intérêt pour photoconversion, qui est le mieux fait en commençant par la tension 1frame/sec et haute (HT) 200, puis aller dans le cadres / sec et l'abaissement de la HV en conséquence jusqu'à ce qu'il atteigne 1/32 images / s et HV autour 100 à 120, en fonction du bruit de fond.
- Lorsque l'embryon est au point, regarder sur le bord droit de l'écran, saisissez le rebord vert et le rendre plus petit de sorte qu'il s'adapte à la zone d'intérêt pour photoconversion et clic droit avec la souris. Plus petit est mieux parce que la photoconversion est irréversible.
- Tournez images / sec à 1 et HV 200 et frappernumériser. Une image zoomée de la zone de photoconversion est maintenant visible.
- cellules Photoconvert en tournant sur Ch1 (403,4 nm). Exposer au laser photoconverting partout 5-60 secondes, selon la taille de la région jusqu'à ce que Kaede vert comme on le voit par la voie de la GFP est presque absent.
- Lorsque le signal de Kaede vert est presque absent, tourner Ch1 off. Tournez Ch2 et 3 sur. Puis cliquez droit sur la fenêtre sur A1 champ de la zone de numérisation et cliquez sur «retour à la taille originale" pour vérifier si les cellules désirées ont été photoconverted.
6. Faire un Z-stack
- Trouvez l'icône «capture série Z» dans la barre de menus et fixer des limites supérieures et inférieures de Z-pile avant de le démarrer. Réglez LUT.
7. Logiciels-Paramètres Time-lapse
- Aller à la boîte A1Simple GUI et cochez les paramètres suivants:
1/32 images / s
taille 1024
moyenne de 4 ou 8 fois, selon le nombre de Z-piles qui doit être prise dans une boucle - Aller à:contrôles vue / acquisition / acquisition de séquence ND et mis délai (8-30min), cliquez sur continue et cliquez Z-stack. Définir les frontières comme testé avant et afficher la vidéo.
- Continuez à ajouter E3/0.015% tricaine solution chambre glissière tout au long de la journée. La nuit, remplir la chambre complètement. Cela durera jusqu'à ce que le lendemain matin.
- Le lendemain matin, remplir solution tricaine E3/0.015%, et vérifier si l'embryon est encore en vie. Perte de fluorescence indique la mort. Continuer recharges et contrôles tout au long de la journée.
- Lorsque la structure a terminé la formation, ou l'embryon est mort, terminer le film.
8. Traitement post-production
- Cliquez sur "projection d'intensité maximale de spectacle» sur la barre d'outils, puis faites un clic droit sur l'image et créer un nouveau document. La vidéo est maintenant visible dans la meilleure qualité possible. Passez à supprimer des images qui ne sont pas nécessaires et ajuster LUT. Enfin enregistrer sous. Avi. Ce format sera parfait pour Windows. Pour Mac logiciel de téléchargement to convertir. mov ou. wmv.
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Representative Results
Dans le SOX10: CNCCs Kaede lignée transgénique, migratoires et post migratoires sont marqués par fluorescence verte. Les cellules marquées par la CNCC vert fluorescent Kaede récapitulent endogène expression de l'ARNm SOX10 5.
Parmi d'autres applications, ce modèle animal a été utilisé pour mieux visualiser le développement de structures cranio-faciales charge CNCC. Le développement normal des structures spécifiques et aussi le développement pathologique des malformations cranio-faciales, la lèvre en particulier de lièvre ont été capturés. Une série de vidéos time-lapse en direct de poisson zèbre à différents points dans le temps de développement a été généré.
A titre d'exemple, des embryons à 60 HPF, un stade où les travées paires se sont réunis pour former la plaque ethmoïde, ont été sélectionnés. Photoconversion ciblée unilatéral résultant dans l'étiquetage rouge de la portion la plus antérieure de cellules dans la plaque ethmoïde a été effectuée. Tout d'abord, l'extension normale et la formation de ee plaque ethmoïde a été observée dans de type sauvage Tübingen poisson zèbre (voir la figure 1 et Vidéo 1). Avec une compréhension du développement normal de la plaque ethmoïde, cette référence de type sauvage a été ensuite appliquée à comparer la migration de CNCCs embryons où l'expression de gène normal a été perturbé.
Un specc1lb morpholino knockdown embryon de poisson zèbre a été choisi comme un exemple représentatif. SPECC1L est le premier gène impliqué dans le développement de la fente faciale oblique rare mais grave. Knockdown base-morpholino de SPECC1L homologue specc1lb dans les résultats de poisson zèbre à clefting faciale bilatérale dans la plaque ethmoïde. Embryons à 60 embryons de HPF qui avaient été injectés avec specc1lb antisens morpholino ont été sélectionnés et la partie la plus antérieure de cellules de la plaque a été ethmoïde photoconverted unilatéralement. Contrairement à un développement normal de la plaque ethmoïde, l'échec de la fusion entre les cellules ethmoïdales médiane de la plaqueet les cellules de la plaque ethmoïde latérales ont pu être observées. Cela ressemble à la pathogenèse du développement ObFC chez l'homme, où l'échec de la fusion entre le processus nasal latéral et l'importance maxillaire se produit (voir vidéo 2).
Figure 1. SOX10:. Kaede photoconversion A. Vue ventrale de 60 HPF SOX10: poisson zèbre transgénique Kaede. La structure étiqueté vert sur le schéma et l'image réelle en direct correspondant ressemble à la plaque ethmoïde. Après exposition à la lumière UV (à 403,4 nm) sous le microscope confocal, le Kaede protéine fluorescente est photoconverted du vert au rouge. B. Le photoconverted cellules peuvent être suivis comme indiqué dans la partie B.
Film 1. Time lapse vidéo 60 de type sauvage stade de HPF Tübingen embryon de poisson zèbre.Formation normale de la plaque ethmoïde. Vue ventrale. Enreg toutes les 30 minutes à partir 60-72 HPF. Cliquez ici pour voir le film .
Movie 2. Embryon Time lapse vidéo 60 HPF specc1lb étape morpholino injecté. Échec de la fusion entre les cellules de la plaque ethmoïde médianes et cellules de la plaque ethmoïde latérales peut être observée. Vue ventrale. Enreg toutes les 30 minutes à partir 60-72 HPF. Cliquez ici pour voir le film .
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Discussion
Voici une nouvelle méthode pour la visualisation de développement cranio-facial dans le modèle de poisson zèbre est affiché. Les SOX10: Kaede ligne de poisson zèbre transgénique a été utilisé avec succès pour décrire le modèle migratoire de la CNCC en détail est utilisé comme organisme modèle 5.
Des études antérieures ont utilisé des repères bruts tels que l'œil aux cellules cibles et se sont appuyés sur l'injection Kaede de l'ARNm, des essais de photoconversion ou cage dextran fluorescéine pour photoconversion 10, 11, 14, 15 Le sox: 10. Kaede lignée transgénique présente de nombreux avantages par rapport à ces méthodes. Avec des cellules de la crête neurale déjà étiquetés avec Kaede et conforme à une distribution très particulier, monuments plus précises pour créer des régions pour la cartographie de sort peuvent être utilisés. En outre, ayant protéine exprimée de façon endogène Kaede sous le contrôle du promoteur de SOX10 assure que seules les cellules de la crête neurale sont photoconverted et que seuls les dérivés seront marqués à un stade ultérieur, derainage le fond potentiel 5.
Avec cette technique, la formation d'une cellule neuronale de crête dérivé la structure cranio-faciale chez le poisson zèbre peut être démontré avec succès. Le développement des embryons de poisson zèbre de type sauvage normales peut être suivie et cette référence de type sauvage peut être comparée aux embryons où l'expression de gène normal a été perturbé.
Les modifications possibles comprennent l'aide d'un autre conteneur de fixer l'embryon pendant la visualisation. Il peut s'agir d'une boîte de Pétri, ou tout autre plateau translucide.
Si l'imagerie n'est pas réussie, c'est probablement dû à des erreurs dans les paramètres du logiciel. Lire le manuel d'utilisation du microscope avant de commencer laps de temps réel.
Bien que l'imagerie, il est essentiel de se concentrer sur le bon plan de l'embryon et de fixer les frontières Z-stack précisément. En outre, les paramètres de qualité d'image tels que les cadres / sec, moyenne et LUT doivent être mis dans le meilleur way possible afin d'obtenir des résultats de haute qualité.
Une limitation potentielle de cette technique est qu'il est techniquement difficile de marquer les cellules sur la base d'une seule cellule, que le tissu environnant est également exposé à la lumière UV. En outre, si la prolifération cellulaire est rapide, le marquage rouge est perdue par dilution après la division cellulaire.
En outre, kaede est tétramérique et a tendance à former des agrégats lorsqu'ils sont fusionnés à d'autres protéines. Cette limite son utilisation dans la plupart des applications de fusion de l'imagerie des cellules vivantes.
Imagerie en temps réel time-lapse est un outil important pour rendre les données expérimentales complexes de développement plus accessible à la communauté scientifique et un public plus large.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Les auteurs remercient Robert Kelsh pour avoir bien voulu partager le poisson zèbre réactif promoteur SOX10.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sox10:kaede transgenic zebrafish line | MGH | Available via the Liao lab | |
| Petri dishes 100x15 mm | BD Falcon | 351029 | |
| Petri dishes 35 mmx10 mm | BD Falcon | 351008 | |
| Ultrapure Low melting point (LMP) Agarose | Invitrogen | 15517022 | |
| Lab Tek 2 Chamber SlideSystem | LabTek | 154453 | |
| Microloaders 200/pk | Fisher | E5242956003 | |
| Nikon A1R Si Confocal Ti series | Nikon | No Catalog number | |
| NIS Elements Software AR3.2 64-bit | Nikon | No Catalog number |
References
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