Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Visualisering af kraniofaciale udvikling i sox10: Kaede Transgene zebrafisk linje ved hjælp af Time-lapse konfokal mikroskopi

Published: September 30, 2013 doi: 10.3791/50525

Summary

Visualisering af eksperimentelle data er blevet et centralt element i at præsentere resultater til det videnskabelige samfund. Generering af levende tidsforskudt optagelse af voksende embryoner bidrager til en bedre præsentation og forståelse af komplekse udviklingsprocesser. Denne protokol er en trin-for-trin guide til cellemærkning via fotoomdannelse af kaede protein i zebrafisk.

Abstract

Hvirveldyr palatogenesis er en meget koreograferet og komplekse udviklingsmæssige proces, som involverer migration af kraniale neuralkam (CNC) celler, konvergens og udvidelse af ansigtets fremspring, og modning af kraniofaciale skelet. At studere bidrag kranie neurale våbenskjold til bestemte områder af zebrafisk ganen en sox10: kaede transgene zebrafisk linje blev genereret. Sox10 giver afstamning begrænsning af kaede reporter protein til den neurale våbenskjold, hvorved cellen mærkning en mere præcis proces end traditionel farvestof eller reporter mRNA injektion. Kaede er et foto-konvertibelt protein, der skifter fra grøn til rød efter foto aktivering og gør det muligt at følge celler præcist. De sox10: kaede transgene linje blev brugt til at udføre afstamning analyse for at afgrænse CNC cellepopulationer der giver anledning til maxillary versus mandiblens elementer og illustrere homologi af ansigtets prominences til amniotes. Denne protokol beskrives trins til at generere en levende time-lapse video af en sox10: kaede zebrafisk foster. Udvikling af ethmoid plade vil tjene som et praktisk eksempel. Denne protokol kan anvendes til at gøre en time-lapse konfokal optagelse under nogen kaede eller lignende photoconvertible reporter protein i transgene zebrafisk. Desuden kan det bruges til at fange ikke blot er normal, men også unormal udvikling af kraniofaciale strukturer i zebrafisk mutanter.

Introduction

Orofaciale kløfter repræsenterer den mest udbredte craniofacial deformitet, med 1/700-1 påvirket 000 leverancer 1.. Forstyrrelse af tidlig embryologiske kraniofaciale udvikling kan føre til dannelse af læbe og gane (CL / P). Mens årsagerne til syndromiske kløft stort set er blevet vist, stadig nødt til at blive afdækket 2-4 de genetiske og epigenetiske baser af nonsyndromic former for orofacial clefting. For at forstå ætiologien og patogenesen af ​​disse misdannelser, er det nødvendigt at belyse udviklingen af ​​kraniofaciale strukturer på celleniveau basis.

I alle hvirveldyr kranie neurale crest celler (CNCC) migrere fra dorsale neuralrøret at befolke svælg buer, der vil bidrage til dannelsen af ​​orofaciale strukturer. Forstyrrelse af tidlig embryologiske neural crest udvikling kan føre til dannelse af kraniofaciale misdannelser, herunder CL / P 5-7.

I annoncetillæg til strukturelle ligheder mellem zebrafisk og pattedyr kraniofaciale udvikling (CNCCs opholde sig i homologe regioner), er det gen regulerende netværk meget bevares. Det er også blevet vist, at CNCCs udvikle sig på samme måde mellem amniote arter og zebrafisk 8, hvilket gør zebrafisk en stærk organisme til undersøgelse af udviklingsmæssige og genetiske grundlag for CL / P. Det har mange fordele, bl.a. lille størrelse, hurtig og ex-utero embryonale udvikling og høje avl satser. Desuden fosteret er optisk transparent, hvilket gør det muligt at foretage en observation af komplekse udviklingsmæssige begivenheder under lup 9. Det er en ideel dyremodel for studiet af migration og differentiering af kranie neurale crest celler.

Udvidelse på tidligere offentliggjorte arbejde 8, 10, 11, den trækmønster af CNCC blev beskrevet i detaljer ved hjælp af de sox10: kaede transgene model 5.. Kaede er et foto-konvertibelt protein, turns fra grøn til rød efter foto aktivering og gør det muligt at spore CNCCs præcist. I løbet af denne forvandling peptidrygraden spaltes, hvilket tyder på, at konverteringen er stabil, hvilket betyder, at cellerne kan spores til deres endelige bestemmelsessted 12. Transgene linier mærket med kaede under transkriptionel kontrol af sox10 viste, at amniote gane og Sibenet plade af zebrafisk dannes homologt ved fusion af bilaterale maxillary prominences (MXP) med frontonasal fremtrædende (FNP), og at Y-formet fusion sømmen er analog mellem arter.

Blandt andre applikationer, de sox10: blev kaede transgene zebrafisk model, der anvendes til at generere videoer af zebrafisk embryoner på forskellige udviklingsstadier at vise dannelsen af ​​normale og unormale kraniofaciale strukturer. Fotoomdannelse af specifikke grupper af celler gør det muligt at spore deres udvikling. Med denne metode en tilgang til at skabe levende billeddannelse udvikle craniofacial strukturer i zebrafisk er indført, gør det nemt at visuelt at demonstrere dette kompleks udviklingsproces.

Denne protokol har til formål at udveksle erfaringer med at generere disse videoer ved hjælp af den normale udvikling af ethmoid plade i sox10: kaede transgene zebrafisk som et eksempel. Denne protokol kan yderligere anvendes til at gøre time-lapse videoer af enhver struktur stammer fra kranielle neurale crest celler i zebrafisk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Embryonindsamling til fotoomdannelse

  1. Opretter mindst ti par sox10: kaede transgene zebrafisk mellem 5 og 6 pm i aften.
  2. Den næste morgen, træk skillevægge og indsamle æg omkring middag. Overfør dem til petriskåle og sætte dem i 28,5 ° C inkubator.
  3. På omkring 24 timer efter befrugtningen rense petriskåle ved at fjerne døde fostre. Kontroller udviklingsstadiet af embryoner 13 ved hjælp lysfelt-mikroskopi og noget fluorescerende mikroskop med forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP) filter. Kaede vil være synlig gennem dette filter.
  4. Når embryoner nå 60 HPF transfer fem lyst fluorescerende embryoner i en separat petriskål og dechorionate dem om nødvendigt.

2. Montering af Embryo for fotoomdannelse

  1. Monter foster ved hjælp af en normal fluorescerende mikroskop. Montering af embryoner på konfokal mikroskop er ekstremt udfordrende.
  2. Brug stativard E3 vand eller forberede frisk E3 ved hjælp af følgende opskrift:
    Tilføj følgende pr en liter destilleret vand dH2O tilføje følgende for at 1x E3L:
    0,292 g 5,0 mM NaCl
    0,013 g 0.17mM KCl
    0,044 g 0,33 mm CaCl2 (tørremiddel, 96%, ACS-reagens)
    0,081 g .33 mM MgSO4 (anhydrated)
    Valgfrit: tilføj 200 pi 0,05% methylenblåt til 1X E3 som fungicid og rør.
    Medium holder ved stuetemperatur i 1 uge.
  3. Brug standard tricaine eller forberede tricaine hjælp følgende opskrift:
    For 5 liter 0,2% tricaine blande de følgende ingredienser:
    45 ml tris-Cl (1M, pH 9,5)
    5 LH 2 O
    10 g tricaine
  4. Forbered 'film juice' (50 ml E3, 0,015% tricaine opløsning), ved at tilsætte 3,75 ml 0,2% tricaine til 46,25 ml E3.
  5. Forbered agarose ved at blande 46,25 ml E3 vand med 46,35 mg lavt smeltepunkt (LMP) agarose i en 50 ml glaskolbe og opløse faste partikler ved mikrobølgebehandling. Derefter tilsættes3,73 ml 0,2% tricaine til agarose og sætte glaskolbe med agarose i 50 ° C vandbad, indtil brug.

3. Forberedelse og montering af Embryo

  1. Bedøver embryoner med E3/0.015% tricaine løsning lavet i trin 1.1.2 og ægoplægning til kammer dias.
  2. Opsuge al overskydende E3 med papir væv og put agarose på foster.
  3. Position foster perfekt dorsal med microloader tips. Sørg hele embryo ikke flyde på toppen af ​​agarose, men skubbe hele kroppen ned. Hæld E3/0.015% tricaine opløsning i løbet af agarose indlejret foster indtil kammeret er fuldt fyldt med væske.

4.. Justering Software Settings på konfokal mikroskop

  1. Brug 20X luft immersible målsætning (blændetal 0,75; pinhole størrelse 20) til at fokusere embryoet. Tryk derefter på L100 lys knap på mikroskopet og vælg kanaler i software. Åbn ikoner se / erhvervelse controls/A1settings og click konfokal setup knappen. Næste klik på 'auto', og vælg følgende kanaler, før du lukker vinduet igen:
    K1: DAPI kanal-403,4 nm (kan bruges bølgelængder mellem 350-410 nm)
    Ch2: 488,0 nm
    Ch3: 561,9 nm

5.. Fotoomdannelse

  1. Sluk Ch1 og 3, og tænd Ch2 før du klikker på Fjern interlock knappen og scanning.
  2. Fokus på celler af interesse for fotoomdannelse, hvilket gøres bedst ved at starte med 1frame/sec og høj spænding (HV) 200 og derefter gå op i billeder / sek og sænke HV herom, indtil den når 1/32 billeder / sek og HV rundt 100-120, afhængig af baggrundsstøj.
  3. Når fosteret er i fokus, se på den højre kant af skærmen, tag fat i grønne ring og gøre det mindre, så det passer til området af interesse for fotoomdannelse og højreklik med musen. Mindre er bedre, fordi den fotoomdannelse er irreversibel.
  4. Drej billeder / sek til 1 og HV til 200 og ramtescan. Indzoomet billede af området fotoomdannelse er nu synlig.
  5. Photoconvert celler ved at tænde Ch1 (403,4 nm). Expose til photoconverting laser overalt 5-60 sekunder, afhængigt af størrelsen af ​​regionens indtil grøn kaede set gennem GFP kanalen er næsten fraværende.
  6. Når den grønne kaede signal er næsten fraværende, drej Ch1 fra. Vend Ch2 og 3 på. Klik derefter til højre ad vinduet på A1 scanningsområde felt og hit 'tilbagevenden til oprindelige størrelse' for at se, om de ønskede celler blev photoconverted.

6.. Realiseringen af ​​et Z-stack

  1. Find ikonet 'capture Z-serien "i menulinjen og sætte øvre og nedre grænser for Z-stack, før du starter den. Indstil LUTS.

7.. Software-Indstillinger Time-lapse

  1. Gå til A1Simple GUI boks og kryds følgende indstillinger:
    1/32 billeder / sek
    str. 1024
    gennemsnit 4 eller 8X afhængigt af antallet af Z-stakke, der skal tages i en løkke
  2. Gå til:kontroller visning / erhverves / ND sekvens erhvervelse og sæt tidsramme (8-30min), klik kontinuerlig og klik på Z-stack. Sæt grænser som testet før og starte filmen.
  3. Holde tilføje E3/0.015% tricaine løsning kammer slide hele dagen. Om natten, fylde kammer helt. Det vil vare indtil næste morgen.
  4. Den næste morgen, refill E3/0.015% tricaine løsning og se om fosteret er stadig i live. Tab af fluorescens indikerer død. Fortsæt opfyldninger og kontrol hele dagen.
  5. Når konstruktionen er færdig formning, eller fosteret er død, afslutte filmen.

8.. Post-produktion Processing

  1. Klik på 'show maksimal intensitet projektion' på værktøjslinjen, derefter højreklikke på billedet og oprette nyt dokument. Videoen er nu synlig i den bedst mulige kvalitet. Gå på at slette billeder, der ikke er nødvendige, og juster LUTS. Endelig gemme som. Avi. Dette format vil være fint til Windows. Til Mac downloade software to konvertere til mov eller. wmv..

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I sox10: kaede transgen linje, vandrende og post vandrende CNCCs er mærket fluorescerende grøn. De CNCC celler mærket med grønne fluorescerende kaede rekapitulere endogene sox10 mRNA udtrykket 5.

Blandt andre programmer, blev dette dyr model, der anvendes til bedre at visualisere udviklingen af ​​CNCC afhængige kraniofaciale strukturer. Normal udvikling af specifikke strukturer og også patologisk udvikling af kraniofaciale misdannelser, især læbe og gane er blevet fanget. En række af levende time-lapse videoer af zebrafisk på forskellige udviklingsmæssige tidspunkter er blevet genereret.

Som et eksempel, embryoner ved 60 HPF, et stadium, hvor de parrede trabeculae har mødtes for at danne den ethmoid plade, blev udvalgt. Ensidig målrettet fotoomdannelse resulterer i rød mærkning af de forreste del af celler i ethmoid plade blev udført. Først normal udvidelse og dannelsen af ​​the ethmoid plade blev observeret i vildtype Tübingen zebrafisk (se figur 1 og video 1). Med en forståelse af normale udvikling af ethmoid plade blev denne vilde typebetegnelse derefter anvendt til at sammenligne migration af CNCCs i embryoner, hvor den normale genekspression er foruroliget.

En specc1lb morpholino knockdown zebrafisk foster blev valgt som et repræsentativt eksempel. SPECC1L er det første gen impliceret i udviklingen af den sjældne, men alvorlige skrå facial kløft. Morpholino-baserede knockdown af SPECC1L homolog specc1lb i zebrafisk resultater i bilateral facial clefting i ethmoid plade. Embryoner ved 60 HPF embryoner, der var blevet injiceret med specc1lb antisense morfolino blev udvalgt, og den mest forreste del af ethmoid plade celler blev photoconverted ensidigt. I modsætning til normale udvikling af ethmoid plade, svigt af fusion mellem median ethmoid plade cellerog laterale ethmoid plade celler kunne observeres. Det ligner patogenese ObFC udvikling hos mennesker, hvor svigt af fusion mellem den laterale nasal-processen og maxillary fremtrædende forekommer (se video 2).

Figur 1
Figur 1. sox10:. kaede fotoomdannelse A. Ventral visning af 60 HPF sox10: kaede transgene zebrafisk. Strukturen er mærket grøn i diagrammet og den tilsvarende rigtig levende billede ligner ethmoid plade. Efter udsættelse for UV-lys (ved 403,4 nm) under konfokal mikroskop, er den fluorescerende protein kaede photoconverted fra grøn til rød. B. photoconverted celler kan følges som vist i panel B.

Movie 1. Tid bortfalder video 60 HPF stadie vildtype Tübingen zebrafisk foster.Normal dannelsen af ​​ethmoid plade. Ventral udsigt. Registreret hvert 30 min starter 60-72 HPF. Klik her for at se film .

Movie 2. Tid bortfalder video 60 HPF stadie specc1lb morpholino injiceres foster. Kan observeres Svigt i fusion mellem median ethmoid plade celler og laterale ethmoid plade celler. Ventral udsigt. Registreret hvert 30 min starter 60-72 HPF. Klik her for at se film .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her er en ny metode til visualisering af kraniofaciale udvikling i zebrafisk model er vist. De sox10: kaede transgene zebrafisk linje er med succes blevet brugt til at beskrive den migrerende mønster af CNCC i detaljer bruges som en model organisme 5..

Tidligere undersøgelser har brugt grove vartegn såsom øjet til at målrette celler og har påberåbt sig kaede mRNA injektion, fotoomdannelse assays eller bur fluorescein dextran for fotoomdannelse 10, 11, 14, 15 Sox:. 10. kaede transgene linje har mange fordele i forhold til disse metoder. Med neurale crest celler, der allerede er mærket med kaede og i overensstemmelse med en meget bestemt fordeling kan mere præcise pejlemærker for oprettelse af regioner skæbne mapping anvendes. Desuden har jeg kaede protein udtrykt endogent under kontrol af sox10 promotoren sikrer, at kun neurale kamceller er photoconverted og at kun derivater vil blive mærket på et senere tidspunkt, defolder den potentielle baggrund 5..

Med denne teknik, kan dannelsen af ​​enhver neural crest celleafledt kraniofaciale struktur i zebrafisk blive vist med succes. Udviklingen af ​​normale vildtype zebrafisk embryoner kan følges, og denne vilde typebetegnelse kan sammenlignes med embryoner, hvor den normale genekspression er foruroliget.

Potentielle modifikationer omfatter brug af en anden beholder til at fastsætte embryo under visualisering. Dette kan være en petriskål, eller enhver anden gennemskinnelig bakke.

Hvis billeddannelse er ikke lykkes, dette skyldes sandsynligvis fejl i software-indstillinger. Læs brugervejledning af mikroskopet omhyggeligt, inden du levende tidsforskydningen.

Mens billedbehandling, er det afgørende at fokusere på det rigtige plan foster og præcist at indstille Z-stack grænser. Endvidere billedkvalitet parametre såsom billeder / sek, gennemsnit og LUT'er skal indstilles i den bedste way muligt for at få resultater af høj kvalitet.

En potentiel begrænsning ved denne teknik er, at det er teknisk udfordrende at mærke celler på en enkelt celle basis, som det omgivende væv også udsættes for UV-lys. Yderligere, hvis celleproliferation er hurtig, er den røde mærkning tabt ved fortynding efter celledeling.

Desuden kaede er tetramere og har en tendens til at danne aggregater, når fusioneret til andre proteiner. Dette begrænser dens anvendelse i de fleste applikationer fusion i levende celler.

Live-time-lapse imaging er et vigtigt redskab til at gøre komplekse udviklingsmæssige eksperimentelle data mere tilgængelig for det videnskabelige samfund og et bredere publikum.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Forfatterne takker Robert Kelsh for venligt deler zebrafisk sox10 promotor reagens.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sox10:kaede transgenic zebrafish line MGH Available via the Liao lab
Petri dishes 100x15 mm BD Falcon 351029
Petri dishes 35 mmx10 mm BD Falcon 351008
Ultrapure Low melting point (LMP) Agarose Invitrogen 15517022
Lab Tek 2 Chamber SlideSystem LabTek 154453
Microloaders 200/pk Fisher E5242956003
Nikon A1R Si Confocal Ti series Nikon No Catalog number
NIS Elements Software AR3.2 64-bit Nikon No Catalog number

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Prevalence at Birth of Cleft Lip With or Without Cleft Palate: Data From the International Perinatal Database of Typical Oral Clefts (IPDTOC). Cleft Palate Craniofac. J. 48 (1), 66-81 (2011).
  2. Dixon, M. J., et al. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences. Nat. Rev. Genet. 12 (3), 167-178 (2011).
  3. Mangold, E., Ludwig, K. U., Nothen, M. M. Breakthroughs in the genetics of orofacial clefting. Trends Mol. Med. 17 (12), 725-733 (2011).
  4. Kimmel, C. B., Miller, C. T., Moens, C. B. Specification and morphogenesis of the zebrafish larval head skeleton. Dev. Biol. 233 (2), 239-257 (2001).
  5. Dougherty, M., et al. Embryonic Fate Map of First Pharyngeal Arch Structures in the sox10: kaede Zebrafish Transgenic Model. J. Craniofac. Surg. 23 (5), 1333-1337 (2012).
  6. Trainor, P. A., Krumlauf, R. Hox genes, neural crest cells and branchial arch patterning. Curr. Opin. Cell Biol. 13 (6), 698-705 (2001).
  7. Schilling, T. F., Kimmel, C. B. Segment and cell type lineage restrictions during pharyngeal arch development in the zebrafish embryo. Development. 120 (3), 483-494 (1994).
  8. Swartz, M. E., et al. Examination of a palatogenic gene program in zebrafish. Dev. Dyn. 240 (9), 2204-2220 (2011).
  9. McCollum, C. W., et al. Developmental toxicity screening in zebrafish. Birth Defects Res. C. Embryo Today. 93 (2), 67-114 (2011).
  10. Wada, N., et al. Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull. Development. 132 (17), 3977-3988 (2005).
  11. Eberhart, J. K., et al. Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development. Development. 133 (6), 1069-1077 (2006).
  12. Ando, R., et al. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 99 (20), 12651-12656 (2002).
  13. Kimmel, C. B., et al. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203 (3), 253-310 (1993).
  14. Kawakami, A., et al. The zebrafish-secreted matrix protein you/scube2 is implicated in long-range regulation of hedgehog signaling. Curr. Biol. 15 (5), 480-488 (2005).
  15. Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. Cell tracking using photoconvertible proteins during zebrafish development. J. Vis. Exp. (67), e4350 (2012).

Tags

Developmental Biology Kraniofacial Abnormiteter kæbe abnormiteter ganespalte Kraniofacial abnormiteter Maxillofacial abnormiteter rekonstruktiv kirurgiske procedurer Developmental Biology Embryologi Medfødte arvelige og neonatal sygdomme og uregelmæssigheder Craniofacial udvikling kraniel neurale våbenskjold konfokal mikroskopi skæbne kortlægning celleafstamning analyse sox10 kaede fotoomdannelse zebrafisk gane
Visualisering af kraniofaciale udvikling i sox10: Kaede Transgene zebrafisk linje ved hjælp af Time-lapse konfokal mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gfrerer, L., Dougherty, M., Liao, E. More

Gfrerer, L., Dougherty, M., Liao, E. C. Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (79), e50525, doi:10.3791/50525 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter