Summary
Visualisatie van experimentele gegevens is uitgegroeid tot een belangrijk element in de presentatie van de resultaten aan de wetenschappelijke gemeenschap. Generatie van de live time-lapse opname van groeiende embryo draagt bij aan een betere presentatie en begrip van complexe ontwikkelingsprocessen. Dit protocol is een stap-voor-stap handleiding voor cel etikettering via photoconversion van kaede eiwit in de zebravis.
Abstract
Gewervelde palatogenesis is een zeer choreografie en complexe ontwikkelingsproces, waarin migratie van craniale neurale lijst (CNC) cellen, convergentie en uitbreiding van het gezicht uitsteeksels, en rijping van het craniofaciale skelet gaat. Kaede transgene zebravis lijn werd gegenereerd: de bijdrage van de craniale neurale lijst aan specifieke regio's van de zebravis gehemelte een SOX10 bestuderen. SOX10 biedt lineage beperking van de kaede reporter eiwit aan de neurale lijst, waardoor de cel etikettering een nauwkeuriger proces dan traditionele kleurstof of reporter mRNA injectie. Kaede is een foto-cabriolet eiwit dat verandert van groen naar rood na foto-activering en maakt het mogelijk om cellen precies te volgen. De SOX10: kaede transgene lijn werd gebruikt om lineage analyse uit te voeren om CNC celpopulaties die aanleiding geven tot de bovenkaak versus onderkaak elementen en illustreren homologie van het gezicht uitsteeksels aan amniotes bakenen. Dit protocol beschrijft de staps om een live time-lapse video van een SOX10 genereren: kaede zebravis embryo. Ontwikkeling van de ethmoid plaat zal dienen als een praktisch voorbeeld. Dit protocol kan worden toegepast op het maken van een time-lapse confocale opnemen van welke kaede of soortgelijke photoconvertible reportergen in transgene zebravis. Bovendien kan het worden gebruikt om niet alleen normaal, maar ook abnormale ontwikkeling van craniofaciale structuren in de zebravismutanten vangen.
Introduction
Orofaciale kloven vormen de meest voorkomende craniofaciale misvorming, met 1/700-1, 000 leveringen getroffen 1. Verstoring van de vroege embryonale craniofaciale ontwikkeling kan leiden tot de vorming van gespleten lip en gehemelte (CL / P). Terwijl oorzaken voor syndromic gespleten grotendeels zijn aangetoond, de genetische en epigenetische basis van niet-syndromale vormen van orofaciale clefting moeten nog worden ontdekt 2-4. Om de etiologie en pathogenese van deze misvormingen te begrijpen, is het noodzakelijk de ontwikkeling van craniofaciale structuren op cellulaire basis helderen.
In alle gewervelde diersoorten craniale neurale lijst cellen (CNCC) migreren van de dorsale neurale buis naar de pharynxbogen, die zullen bijdragen tot de vorming van orofaciale structuren bevolken. Verstoring van de vroege embryonale neurale ontwikkeling kan leiden tot de vorming van craniofaciale misvormingen, waaronder CL / P 5-7.
In de advoorwaarde om structurele overeenkomsten tussen zebravis en zoogdieren craniofaciale ontwikkeling (CNCCs in homologe gebieden wonen), wordt het gen regulerende netwerk sterk geconserveerd. Ook is aangetoond dat CNCCs ontwikkelen op dezelfde wijze tussen amniote soorten en zebravis 8, waardoor de zebravis een krachtige organisme voor de studie van ontwikkeling en genetische basis van CL / P. Het heeft vele voordelen, met inbegrip van kleine omvang, snelle en ex-utero embryonale ontwikkeling, en een hoge fokkerij tarieven. Bovendien is het embryo optisch transparant, waardoor het vatbaar voor observatie van complexe ontwikkelingsgebeurtenissen onder de microscoop 9. Het is een ideale diermodel voor de studie van migratie en differentiatie van craniale neurale cellen.
Voortbouwend op eerder gepubliceerd werk 8, 10, 11, de trekkende patroon van CNCC werd in detail beschreven met behulp van de SOX10: kaede transgene model 5. Kaede is een foto-cabriolet eiwit dat turns van groen naar rood na foto-activering en maakt het mogelijk CNCCs nauwkeurig traceren. Gedurende deze transformatie de peptide hoofdketen wordt gesplitst, wat suggereert dat de conversie stabiel, waardoor de cellen kunnen worden gevolgd op hun eindbestemming 12. Transgene lijnen gelabeld met kaede onder transcriptionele controle van SOX10 bleek dat de amniote gehemelte en zeefbeen plaat van zebravis homoloog zijn gevormd door fusie van bilaterale bovenkaak uitsteeksels (MXP) met frontonasal bekendheid (FNP) en de Y-vormige fusie naad tussen analoog species.
Onder andere toepassingen, de SOX10: kaede transgene zebravis als model werd gebruikt om video's van de zebravis embryo's te genereren in verschillende ontwikkelingsstadia van de vorming van normale en abnormale craniofaciale structuren tonen. Photoconversion specifieke groepen cellen maakt het mogelijk om de ontwikkeling te volgen. Met deze methode een aanpak om live beeldvorming van het ontwikkelen craniofac creërenial structuren in de zebravis wordt geïntroduceerd, waardoor het gemakkelijk is om visueel te tonen dit complex ontwikkelingsproces.
Dit protocol is gericht op het delen van de ervaring van het genereren van deze video's met behulp van de normale ontwikkeling van de ethmoid plaat in SOX10: kaede transgene zebravis als voorbeeld. Dit protocol kan verder worden toegepast op het maken van time-lapse video van een structuur afgeleid van craniale neurale cellen in de zebravis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Embryo Collection voor Photoconversion
- Richt ten minste tien paar SOX10: kaede transgene zebravis tussen 5 en 18:00 in de avond.
- De volgende ochtend, trek verdelers en eieren te verzamelen rond het middaguur. Overbrengen naar petrischaaltjes en leg ze in 28.5 ° C incubator.
- Om ongeveer 24 uur na de bevruchting, het reinigen van de petrischalen door het verwijderen van dode embryo's. Controleer het ontwikkelingsstadium van het embryo 13 met behulp van licht microscopie en eventuele fluorescentiemicroscoop met versterkt groen fluorescerend eiwit (EGFP) filter. Kaede zal zichtbaar zijn door dit filter.
- Wanneer embryo's oplopen tot 60 HPF overdracht vijf fel fluorescerende embryo's in een aparte petrischaal en dechorionate ze indien nodig.
2. Montage van Embryo voor Photoconversion
- Monteer het embryo met een normale fluorescentiemicroscoop. Montage van embryo's op confocale microscoop is zeer uitdagend.
- Gebruik standard E3 water of het bereiden van verse E3 met het volgende recept:
Voeg de volgende per een liter gedestilleerd water dH 2 O het volgende toevoegen aan 1x E3L maken:
0,292 g 5,0 mM NaCl
0,013 g 0.17mm KCl
0.044 g 0,33 mm CaCl2 (droogmiddel, 96%, ACS reagens)
0.081 g 0,33 mM MgSO4 (anhydrated)
Optioneel: voeg 200 ul van 0,05% methyleenblauw tot 1X E3 als een fungicide en roer.
Medium houdt bij kamertemperatuur gedurende 1 week. - Gebruik standaard tricaïne of tricaïne bereiden met behulp van volgende recept:
5 L 0,2% tricaïne Meng de volgende ingrediënten:
45 ml Tris-Cl (1M pH9.5)
5 LH 2 O
10 g tricaïne - Bereid 'film juice' (50 ml E3, 0,015% tricaïne oplossing), door toevoeging van 3,75 ml 0,2% tricaïne om 46.25 ml E3.
- Bereid agarose door het mengen van 46,25 ml E3 water met 46,35 mg laag smeltpunt (LMP) agarose in een 50 ml glazen kolf en los vaste deeltjes door de magnetron. Voeg vervolgens3,73 ml 0,2% tricaïne aan agarose en zet glazen kolf met agarose in 50 ° C waterbad tot gebruik.
3. Voorbereiding en montage van Embryo
- Verdoven van embryo's met E3/0.015% tricaïne oplossing gemaakt in stap 1.1.2 en overdracht embryo naar kamer dia.
- Geniet van alle overtollige E3 met papier weefsel en de put agarose op embryo.
- Positie embryo perfect dorsale met microloader tips. Controleer het hele embryo niet zweven boven de agarose, maar drukt het hele lichaam naar beneden. Giet vervolgens E3/0.015% tricaïne oplossing over agarose ingebed embryo tot kamer volledig is gevuld met vloeistof.
4. Aanpassen van software-instellingen op confocale microscoop
- Gebruik 20X lucht immersible doelstelling (numerieke opening 0.75; pinhole maat 20) voor het richten van de embryo. Druk op de lichtknop L100 op de microscoop en kanalen selecteren in de software. Open de pictogrammen te bekijken / acquisitie controls/A1settings en click de confocale setup knop. Klik vervolgens op 'auto' en selecteer volgende kanalen voor het raam opnieuw te sluiten:
K1: DAPI kanaal-403,4 nm (golflengtes tussen 350-410 nm worden gebruikt)
Ch2: 488,0 nm
Ch3: 561,9 nm
5. Photoconversion
- Schakel Ch1 en 3 en zet Ch2 voordat u op de knop verwijderen interlock en scannen.
- Focus op cellen van belang voor photoconversion, dat is best gedaan door te beginnen met 1frame/sec en hoogspanning (HV) 200 en dan gaan in de beelden / sec en het verlagen van de HV derhalve tot aan 1/32 beelden / sec en HV rond 100-120, afhankelijk van de achtergrondruis.
- Wanneer het embryo is in focus, kijk aan de rechterkant van het scherm, pak de groene rand en worden verkleind zodat het past bij het gebied van belang voor photoconversion en rechts klikken met de muis. Kleiner is beter omdat het photoconversion is onomkeerbaar.
- Draai frames / sec tot 1 en HV tot 200 en druk opscannen. Een ingezoomd beeld van het gebied van photoconversion is nu zichtbaar.
- Photoconvert cellen door te draaien op kanaal 1 (403.4 nm). Expose de photoconverting laser overal 5-60 seconden, afhankelijk van de grootte van het gebied tot groene kaede gezien door de GFP kanaal nagenoeg afwezig.
- Wanneer de groene kaede signaal is bijna afwezig is, schakelt kanaal 1 uit. Draai Ch2 en 3 op. Klik vervolgens rechtsaf venster op A1 scangebied veld en klik op 'terugkeer naar de oorspronkelijke grootte' om te controleren of de gewenste cellen werden photoconverted.
6. Het maken van een Z-stack
- Zoek het pictogram 'capture Z-serie' in de menubalk en stel onder-en bovengrenzen van Z-stack voordat het. Stel LUT.
7. Software-instellingen Time-lapse
- Ga naar A1Simple GUI doos en vink volgende instellingen:
1/32 frames / sec
maat 1024
gemiddeld 4 of 8X afhankelijk van het aantal Z-stacks die moet worden genomen in een lus - Ga naar:view / overname controles / ND sequence acquisitie en ingesteld tijdsbestek (8-30min), klik op continue en klik Z-stack. Stel grenzen zoals getest voor en start movie.
- Blijven toevoegen E3/0.015% tricaïne oplossing kamer dia gedurende de dag. 'S Nachts, vul kamer volledig. Die zal duren tot de volgende ochtend.
- De volgende ochtend, vul E3/0.015% tricaïne oplossing en controleer of embryo nog leeft. Verlies van fluorescentie geeft aan de dood. Verder bijgevuld en controles tijdens de dag.
- Wanneer de constructie klaar is vormen, of het embryo is overleden, de afwerking van de film.
8. Post-productie, de verwerking
- Klik op 'toon maximale intensiteit projectie' op werkbalk, klik met de rechtermuisknop op de afbeelding en nieuwe document. De video is nu zichtbaar in de best mogelijke kwaliteit. Ga naar frames die niet nodig verwijderen en LUT passen. Tenslotte opslaan als. Avi. Dit formaat zal zijn prima voor Windows. Voor Mac-software downloaden to converteren naar. mov of. wmv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In de SOX10: kaede transgene lijn, trekkende en post trekkende CNCCs gelabeld fluorescerend groen. De CNCC cellen gelabeld met groen fluorescerend kaede recapituleren endogene SOX10 mRNA expressie 5.
Onder andere toepassingen, werd dit diermodel gebruikt om beter te visualiseren de ontwikkeling van CNCC afhankelijk craniofaciale structuren. Normale ontwikkeling van specifieke structuren en ook pathologische ontwikkeling van craniofaciale misvormingen, vooral gespleten lip en gehemelte zijn vastgelegd. Een serie live time-lapse video's van zebravissen in de verschillende ontwikkelingsfasen tijdstippen is gegenereerd.
Als voorbeeld, embryo's in 60 HPF, een fase waarin de gepaarde trabekels hebben voldaan voor ethmoid plaatvorm werden geselecteerd. Unilaterale gerichte photoconversion waardoor rode labels van de voorste deel van de cellen in het zeefbeen plaat uitgevoerd. Ten eerste, de normale uitbreiding en de vorming van ee ethmoid plaat werd waargenomen in wild type Tübingen zebravis (zie figuur 1 en Video 1). Met een goed begrip van de normale ontwikkeling van de ethmoid plaat, werd deze wilde soort verwijzing vervolgens toegepast op migratie van CNCCs vergelijken in embryo's waar normale genexpressie is verstoord.
Een specc1lb morfolino knockdown zebravis embryo werd gekozen als representatief voorbeeld. SPECC1L is het eerste gen betrokken bij de ontwikkeling van de zeldzame maar ernstige schuine gezicht gespleten. Morfolino-gebaseerde knockdown van SPECC1L homoloog specc1lb in zebravis resultaten in bilaterale gezicht clefting in de ethmoid plaat. Embryo's in 60 HPF embryo's die waren ingespoten met specc1lb antisense morfolino werden geselecteerd en de meest voorste deel van ethmoid plaat cellen werd eenzijdig photoconverted. In tegenstelling tot de normale ontwikkeling van de ethmoid plaat, het falen van fusie tussen mediaan ethmoid plaat cellenen laterale ethmoid plaat cellen kunnen worden waargenomen. Dit lijkt op pathogenese van ObFC ontwikkeling bij de mens, indien het weglaten van fusie tussen de laterale nasale proces en bovenkaak bekendheid optreedt (zie video 2).
Figuur 1. SOX10:. kaede photoconversion A. Ventraal aanzicht van de 60 HPF SOX10: kaede transgene zebravis. De structuur groen gelabeld in het diagram en de bijbehorende echte live-beeld lijkt op de ethmoid plaat. Na blootstelling aan UV-licht (bij 403.4 nm) onder de confocale microscoop, wordt het fluorescerende eiwit kaede photoconverted van groen naar rood. B. De photoconverted cellen kan worden gevolgd zoals getoond in Paneel B.
Film 1. Time lapse video 60 HPF stadium wildkleur Tübingen zebravis embryo.Normale vorming van de ethmoid plaat. Ventrale bekijken. Opgenomen na elke 30 min beginnen 60-72 HPF. Klik hier om de film te bekijken .
Movie 2. Time lapse video 60 HPF stadium specc1lb morfolino geïnjecteerd embryo. Falen van fusie tussen mediaan ethmoid plaat cellen en laterale ethmoid plaat cellen kunnen worden waargenomen. Ventrale bekijken. Opgenomen na elke 30 min beginnen 60-72 HPF. Klik hier om de film te bekijken .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier wordt een nieuwe werkwijze voor visualisatie van craniofaciale ontwikkeling in de zebravis model weergegeven. De SOX10: kaede transgene zebravis lijn is met succes gebruikt om de migratie patroon van CNCC in detail te beschrijven wordt gebruikt als modelorganisme 5.
Eerdere studies hebben bruto bezienswaardigheden, zoals het oog gebruikt om cellen te richten en hebben vertrouwd op kaede mRNA injectie, photoconversion assays of gekooide fluoresceïne dextran voor photoconversion 10, 11, 14, 15 De sox:. 10 kaede transgene lijn heeft vele voordelen ten opzichte van deze methoden. Met neurale lijst cellen al gelabeld met kaede en die voldoen aan een zeer bijzondere uitkering, kan nauwkeuriger oriëntatiepunten voor de vaststelling van de regio's voor het lot mapping worden gebruikt. Bovendien heeft kaede eiwit endogeen tot expressie onder de controle van de promotor SOX10 garandeert dat alleen neurale cellen photoconverted en dat alleen derivaten zal later worden gemerkt, devouwen de potentiële achtergrond 5.
Met deze techniek kan de vorming van een neurale cellen afgeleide craniofaciale structuur zebravis succes worden weergegeven. De ontwikkeling van normale wildtype zebravis embryo kan worden gevolgd en dat wildtype referentie te vergelijken met embryo's waar normale genexpressie werd verstoord.
Mogelijke aanpassingen zijn het gebruik van een andere container voor het embryo te repareren tijdens visualisatie. Dit kan een petrischaal of een andere lade doorzichtig zijn.
Als beeldvorming is niet succesvol, dit waarschijnlijk te wijten aan fouten in software-instellingen. Lees de handleiding van de microscoop zorgvuldig voordat u live-time lapse.
Hoewel beeldvorming, is het essentieel om zich rechts vlak van het embryo en Z-stack randen nauwkeurig instellen. Verder beeldkwaliteit parameters zoals frames / sec, de gemiddelde en LUT's moeten worden ingesteld in de beste way mogelijk om hoge kwaliteit resultaten te krijgen.
Een mogelijke beperking van deze techniek is, dat het technisch moeilijk etiket cellen op een cel basis, zoals omringende weefsel wordt ook blootgesteld aan UV-licht. Verder, als celproliferatie is snel, is de rode labels verloren door verdunning na celdeling.
Bovendien kaede is tetramere en heeft de neiging om aggregaten te vormen wanneer gefuseerd aan andere eiwitten. Dit beperkt het gebruik ervan in de meeste fusie toepassingen in live cell imaging.
Live-time-lapse imaging is een belangrijk instrument om complexe ontwikkelingsstoornis experimentele gegevens beter toegankelijk voor de wetenschappelijke gemeenschap en een breder publiek te maken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
De auteurs danken Robert Kelsh voor vriendelijk delen van de zebravis SOX10 promotor reagens.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sox10:kaede transgenic zebrafish line | MGH | Available via the Liao lab | |
| Petri dishes 100x15 mm | BD Falcon | 351029 | |
| Petri dishes 35 mmx10 mm | BD Falcon | 351008 | |
| Ultrapure Low melting point (LMP) Agarose | Invitrogen | 15517022 | |
| Lab Tek 2 Chamber SlideSystem | LabTek | 154453 | |
| Microloaders 200/pk | Fisher | E5242956003 | |
| Nikon A1R Si Confocal Ti series | Nikon | No Catalog number | |
| NIS Elements Software AR3.2 64-bit | Nikon | No Catalog number |
References
- Prevalence at Birth of Cleft Lip With or Without Cleft Palate: Data From the International Perinatal Database of Typical Oral Clefts (IPDTOC). Cleft Palate Craniofac. J. 48 (1), 66-81 (2011).
- Dixon, M. J., et al. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences. Nat. Rev. Genet. 12 (3), 167-178 (2011).
- Mangold, E., Ludwig, K. U., Nothen, M. M. Breakthroughs in the genetics of orofacial clefting. Trends Mol. Med. 17 (12), 725-733 (2011).
- Kimmel, C. B., Miller, C. T., Moens, C. B. Specification and morphogenesis of the zebrafish larval head skeleton. Dev. Biol. 233 (2), 239-257 (2001).
- Dougherty, M., et al. Embryonic Fate Map of First Pharyngeal Arch Structures in the sox10: kaede Zebrafish Transgenic Model. J. Craniofac. Surg. 23 (5), 1333-1337 (2012).
- Trainor, P. A., Krumlauf, R. Hox genes, neural crest cells and branchial arch patterning. Curr. Opin. Cell Biol. 13 (6), 698-705 (2001).
- Schilling, T. F., Kimmel, C. B. Segment and cell type lineage restrictions during pharyngeal arch development in the zebrafish embryo. Development. 120 (3), 483-494 (1994).
- Swartz, M. E., et al. Examination of a palatogenic gene program in zebrafish. Dev. Dyn. 240 (9), 2204-2220 (2011).
- McCollum, C. W., et al. Developmental toxicity screening in zebrafish. Birth Defects Res. C. Embryo Today. 93 (2), 67-114 (2011).
- Wada, N., et al. Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull. Development. 132 (17), 3977-3988 (2005).
- Eberhart, J. K., et al. Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development. Development. 133 (6), 1069-1077 (2006).
- Ando, R., et al. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 99 (20), 12651-12656 (2002).
- Kimmel, C. B., et al. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203 (3), 253-310 (1993).
- Kawakami, A., et al. The zebrafish-secreted matrix protein you/scube2 is implicated in long-range regulation of hedgehog signaling. Curr. Biol. 15 (5), 480-488 (2005).
- Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. Cell tracking using photoconvertible proteins during zebrafish development. J. Vis. Exp. (67), e4350 (2012).
