Summary
Visualizzazione dei dati sperimentali è diventata un elemento chiave per la presentazione dei risultati alla comunità scientifica. Generazione di live time-lapse di embrioni in crescita contribuisce a una migliore presentazione e la comprensione dei processi di sviluppo complessi. Questo protocollo è una guida passo-passo per l'etichettatura cellulare tramite fotoconversione di proteine Kaede in zebrafish.
Abstract
Vertebrato palatogenesis è un processo di sviluppo altamente coreografica e complesso, che coinvolge la migrazione di cranica cresta neurale (CNC), le cellule, la convergenza e l'estensione delle protuberanze facciali, e la maturazione dello scheletro cranio-facciale. Per studiare il contributo della cresta neurale cranica a specifiche regioni del palato zebrafish una SOX10: Kaede linea zebrafish transgenico è stato generato. Sox10 prevede la restrizione lignaggio della proteina Kaede giornalista alla cresta neurale, rendendo in tal modo la cella etichettare un processo più preciso di tintura tradizionale o giornalista iniezione di mRNA. Kaede è una proteina foto-convertibile che passa dal verde al rosso dopo l'attivazione foto e permette di seguire con precisione le cellule. I SOX10: Kaede linea transgenica è stato utilizzato per eseguire l'analisi lignaggio di delineare popolazioni di cellule del CNC che danno luogo a mascellare contro elementi mandibolari e illustrano omologia di protuberanze facciali per amnioti. Questo protocollo è descritto il passaggios per generare un time-lapse video live di una SOX10: Kaede zebrafish. Sviluppo della piastra etmoide servirà come esempio pratico. Questo protocollo può essere applicato a una registrazione confocale time-lapse di qualsiasi Kaede o simile proteina reporter fotoconvertibile in zebrafish transgenico. Inoltre, può essere utilizzato per catturare non solo normale, ma anche anormale sviluppo di strutture craniofacciali nei mutanti di zebrafish.
Introduction
Schisi oro-facciali rappresentano la deformità cranio-facciale più diffusa, con 1/700-1, 000 consegne interessati 1. Turbativa del primo embrionale sviluppo craniofacciale può portare alla formazione di labio-palatoschisi (CL / P). Mentre cause di schisi sindromica sono stati ampiamente dimostrato, le basi genetiche ed epigenetiche delle forme non sindromiche di clefting orofacciale devono ancora essere scoperti 2-4. Per comprendere l'eziologia e la patogenesi di queste malformazioni, è necessario chiarire lo sviluppo di strutture craniofacciali su base cellulare.
In tutte le specie di vertebrati le cellule della cresta neurale cranica (CNCC) migrano dal tubo neurale dorsale per popolare gli archi faringei, che contribuiranno alla formazione di strutture oro-facciale. Turbativa di sviluppo embrionale cresta neurale precoce può portare alla formazione di malformazioni cranio-facciali tra cui CL / P 5-7.
In annunciodizione di somiglianze strutturali tra zebrafish e mammiferi sviluppo craniofacciale (CNCCs risiedono in regioni omologhe), la rete di regolamentazione gene è altamente conservata. È stato anche dimostrato che CNCCs evolve allo stesso modo tra specie amniote e zebrafish 8, rendendo il zebrafish un potente organismo per lo studio di base dello sviluppo e genetica di CL / P. Ha molti vantaggi, tra cui piccole dimensioni, rapida ed ex-utero sviluppo embrionale, e di alti tassi di allevamento. Inoltre, l'embrione è otticamente trasparente, rendendolo suscettibile di osservazione di eventi evolutivi complessi sotto il microscopio 9. Si tratta di un modello animale ideale per lo studio della migrazione e differenziazione delle cellule della cresta neurale cranica.
Ampliando precedentemente lavoro pubblicato 8, 10, 11, il modello migratorio di CNCC è stato descritto in dettaglio utilizzando le SOX10: kaede modello transgenico 5. Kaede è una proteina foto-convertibile che turns da verde a rosso dopo l'attivazione di foto e permette di tracciare con precisione CNCCs. Durante questa trasformazione il scheletro peptidico viene scisso, suggerendo che la conversione è stabile, cioè le cellule possono essere monitorate per la loro destinazione finale 12. Linee transgeniche etichettati con Kaede sotto il controllo trascrizionale di SOX10 hanno mostrato che il palato amniote e la piastra etmoide di zebrafish sono formate omologo dalla fusione di protuberanze mascellari bilaterali (MXP) con il rilievo frontonasale (FNP) e che la cucitura di fusione a forma di Y è analogo tra specie.
Tra le altre applicazioni, i SOX10: Kaede transgenici modello zebrafish è stato utilizzato per generare video di embrioni di zebrafish a diversi stadi di sviluppo di mostrare formazione delle strutture cranio-facciali normali e anormali. Fotoconversione di gruppi specifici di cellule permette di monitorare il loro sviluppo. Con questo metodo un metodo per creare immagini dal vivo di sviluppare craniofacstrutture IAL di zebrafish viene introdotta, rendendo più facile dimostrare visivamente il processo di sviluppo complesso.
Questo protocollo è finalizzato a condividere l'esperienza di generare questi video utilizzando il normale sviluppo della piastra etmoide in SOX10: Kaede zebrafish transgenico come esempio. Questo protocollo può essere ulteriormente applicato a fare video time-lapse di qualsiasi struttura derivata da craniche cellule della cresta neurale in zebrafish.
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Protocol
1. Embrione Collection per Fotoconversione
- Impostare almeno dieci coppie di SOX10: Kaede zebrafish transgenico tra il 5 e 6:00 di sera.
- La mattina successiva, tirare divisori e raccogliere le uova intorno a mezzogiorno. Trasferirli su piastre di Petri e metterli in 28,5 ° C incubatore.
- A circa 24 ore dopo la fecondazione, pulire i piatti Petri, eliminando gli embrioni morti. Controllare lo stadio di sviluppo degli embrioni 13 usando la microscopia campo di luce e ogni microscopio a fluorescenza con una maggiore proteina fluorescente verde (EGFP) del filtro. Kaede sarà visibile attraverso questo filtro.
- Quando gli embrioni raggiungono il 60 trasferimento hpf cinque embrioni fluorescenti vivaci in una capsula di Petri separata e dechorionate se necessario.
2. Montaggio di embrioni per Fotoconversione
- Montare l'embrione utilizzando un microscopio fluorescente normale. Montaggio di embrioni su microscopio confocale è estremamente impegnativo.
- Utilizzare supportoacqua ard E3 o preparare E3 fresco con la seguente ricetta:
Aggiungere il seguente per litro di acqua distillata dH acqua 2 O aggiungere il seguente rendere 1x E3L:
0.292 g 5.0 mM NaCl
0,013 g 0.17mm KCl
0.044 g 0,33 mm CaCl 2 (essiccante, 96%, il reagente ACS)
0,081 g 0,33 mM MgSO4 (anhydrated)
Facoltativo: aggiungere 200 ml di 0,05% di blu di metilene a 1X E3 come fungicida e mescolate.
Piano mantiene a temperatura ambiente per 1 settimana. - Utilizzare tricaine standard o preparare tricaine usando seguente ricetta:
Per 5 L di 0,2% tricaine mescolare i seguenti ingredienti:
45 ml Tris-Cl (1M pH9.5)
5 LH 2 O
10 g tricaine - Preparare 'succo film' (50 ml E3, soluzione tricaine 0,015%), con l'aggiunta di 3,75 ml di 0,2% tricaine a 46.25 ml E3.
- Preparare agarosio mescolando 46.25 ml di acqua E3 a 46,35 mg basso punto di fusione (LMP) agarosio in un pallone di vetro da 50 ml e sciogliere le particelle solide da forno a microonde. Quindi aggiungere3,73 ml 0,2% tricaine di agarosio e mettere boccetta di vetro con agarosio in 50 ° C a bagnomaria fino a quando utilizzo.
3. Preparazione e Montaggio di Embryo
- Anestetizzare gli embrioni con una soluzione tricaine E3/0.015% made in fase 1.1.2 e trasferimento di embrioni di diapositiva da camera.
- Immergetevi in eccesso E3 con il tessuto carta e la messa agarosio su embrione.
- Posizione embrione dorsale perfettamente con punte microloader. Assicurarsi che l'intero embrione non galleggia sopra l'agarosio, ma spingere il corpo verso il basso. Poi versare la soluzione tricaine E3/0.015% rispetto dell'embrione agarosio incorporato fino a camera è completamente riempita di fluido.
4. Regolazione delle impostazioni del software sul microscopio confocale
- Utilizzare 20X obiettivo dell'aria immersible (apertura numerica 0,75; dimensione pinhole 20) per mettere a fuoco l'embrione. Quindi premere il pulsante della luce L100 sul microscopio e selezionare i canali nel software. Controls/A1settings aprire le icone di visualizzazione / acquisizione e premetek il pulsante di configurazione confocale. Avanti fare clic su 'auto' e seleziona seguenti canali prima di chiudere nuovamente la finestra:
Ch1: DAPI canale 403.4 nm (lunghezze d'onda tra 350-410 nm possono essere utilizzati)
CH2: 488,0 nm
Ch3: 561,9 nm
5. Fotoconversione
- Spegnere Ch1 e 3 e accendere Ch2 prima di fare clic sul pulsante Rimuovi blocco e la scansione.
- Focus su cellule di interesse per fotoconversione, che è meglio farlo partendo da 1frame/sec e alta tensione (HV) 200 e poi andare nella fotogrammi / sec e abbassando la HV di conseguenza fino a raggiungere 1/32 fotogrammi / sec e HV intorno 100-120, a seconda del rumore di fondo.
- Quando l'embrione è a fuoco, guardare sul lato destro dello schermo, afferrare il bordo verde e renderlo più piccolo modo che si inserisce l'area di interesse per fotoconversione e fare clic destro con il mouse. Più piccolo è meglio perché la fotoconversione è irreversibile.
- Girare fotogrammi / sec a 1 e HV 200 e colpirescansione. Una immagine ingrandita dell'area di fotoconversione è ora visibile.
- Cellule Photoconvert girando sul canale 1 (403.4 nm). Esporre al laser photoconverting ovunque 5-60 secondi, a seconda delle dimensioni della regione fino Kaede verde come si è visto attraverso il canale GFP è quasi assente.
- Quando il segnale Kaede verde è quasi assente, girare Ch1 off. Girare Ch2 e 3. Quindi fare clic a destra sulla finestra sul campo area di scansione A1 e premere 'ritorno alla dimensione originale' per verificare se sono stati photoconverted cellule desiderate.
6. Fare un Z-stack
- Trovare l'icona 'cattura Z-serie' nella barra dei menu e impostare i limiti superiore e inferiore della Z-stack prima di avviarlo. Imposta LUT.
7. Software-Settings Time-lapse
- Vai al box A1Simple GUI e selezionare le impostazioni seguenti:
1/32 fotogrammi / sec
dimensioni 1024
mediamente 4 o 8X seconda del numero di Z-stack che deve essere presa in un loop - Vai a:controlli view / acquisizione / ND acquisizione sequenza e telaio tempo impostato (8-30min), fare clic su continua e fare clic su Z-stack. Imposta frontiere come provato prima e iniziare film.
- Continuare ad aggiungere E3/0.015% soluzione tricaine diapositiva camera tutto il giorno. Di notte, riempire camera completamente. Che durerà fino al mattino successivo.
- La mattina seguente, riempire soluzione tricaine E3/0.015% e verificare se embrione è ancora vivo. Perdita di fluorescenza indica morte. Continua ricariche e controlli per tutta la giornata.
- Quando la struttura è terminata formatura, o l'embrione è morto, finire il film.
8. Elaborazione post-produzione
- Fare clic su 'show proiezione massima intensita' sulla barra degli strumenti, quindi fare clic destro sull'immagine e creare un nuovo documento. Il video è ora visibile nella migliore qualità possibile. Vai a eliminare i fotogrammi che non sono necessari e regolare LUT. Infine salvare come. Avi. Questo formato sarà bene per Windows. Per Mac software scaricare to convertire. mov o. wmv.
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Representative Results
Nel SOX10: CNCCs Kaede linea transgenica, migratori e post-migratori sono etichettati fluorescente verde. Le cellule CNCC etichettati con Kaede fluorescente verde ricapitolano endogena espressione SOX10 mRNA 5.
Tra le altre applicazioni, questo modello animale è stato usato per visualizzare meglio lo sviluppo di CNCC strutture craniofacciali dipendenti. Il normale sviluppo di strutture specifiche e anche lo sviluppo patologico di malformazioni cranio-facciali, in particolare il labbro leporino e palato sono stati catturati. È stato generato una serie di video time-lapse in diretta di zebrafish in diversi momenti dello sviluppo.
Come esempio, embrioni a 60 HPF, una fase in cui le trabecole accoppiati sono riuniti per formare la piastra etmoide, sono stati selezionati. È stata eseguita unilaterale fotoconversione mirato conseguente etichettatura rosso della porzione più anteriore di cellule nella piastra etmoide. In primo luogo, l'estensione normale e formazione di the piastra etmoide è stata osservata nel tipo selvatico Tuebingen zebrafish (vedi Figura 1 e Video 1). Con una comprensione del normale sviluppo della piastra etmoide, questo riferimento di tipo selvatico è stato poi applicato per confrontare migrazione di CNCCs in embrioni di cui normale espressione genica è stata perturbata.
Un specc1lb morpholino atterramento zebrafish è stato scelto come esempio rappresentativo. SPECC1L è il primo gene implicato nello sviluppo della rara ma grave schisi facciale obliqua. Knockdown-based morpholino di SPECC1L omologo specc1lb nei risultati di zebrafish in clefting facciale bilaterale nella piastra etmoidale. Gli embrioni a 60 HPF embrioni che erano stati iniettati con specc1lb antisenso morfolino sono stati selezionati e la porzione più anteriore delle celle etmoidali piastra è stata photoconverted unilateralmente. In contrasto con il normale sviluppo della piastra etmoide, il fallimento della fusione tra le cellule mediane piastra etmoidalie potrebbero essere osservate cellule laterali piastra etmoidali. Questo assomiglia patogenesi di sviluppo ObFC negli esseri umani, dove il fallimento della fusione tra il processo nasale laterale e prominenza mascellare si verifica (vedi video 2).
Figura 1. SOX10:. Kaede fotoconversione vista A. ventrale di 60 hpf SOX10: Kaede zebrafish transgenico. La struttura etichettato verde nel diagramma e la corrispondente immagine dal vivo reale assomiglia al piatto etmoide. Dopo l'esposizione a luce UV (a 403,4 nm) al microscopio confocale, la proteina fluorescente Kaede è photoconverted dal verde al rosso. B. Il photoconverted cellule possono essere seguiti come mostrato in Pannello B.
Movie 1. Time lapse video di 60 stage hpf tipo selvatico Tuebingen embrione di zebrafish.Normale formazione della placca etmoide. Vista ventrale. Registrato ogni 30 minuti a partire 60-72 hpf. Clicca qui per vedere film .
Movie 2. Embrione time lapse video di 60 hpf fase specc1lb morpholino iniettato. Fallimento di fusione tra mediani cellule piastra etmoidali e le cellule etmoidali laterali della targa può essere osservato. Vista ventrale. Registrato ogni 30 minuti a partire 60-72 hpf. Clicca qui per vedere film .
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Discussion
Qui è illustrato un nuovo metodo per la visualizzazione di sviluppo craniofacciale nel modello zebrafish. I SOX10: Kaede transgenico linea zebrafish è stato usato con successo per descrivere il modello migratorio di CNCC in dettaglio viene utilizzato come organismo modello 5.
Precedenti studi hanno utilizzato i luoghi di interesse lordi come l'occhio alle cellule bersaglio e si sono affidati a iniezione Kaede mRNA, saggi fotoconversione o in gabbia fluoresceina destrano per fotoconversione 10, 11, 14, 15 La sox:. 10 Kaede linea transgenica ha molti vantaggi rispetto a questi metodi. Con cellule della cresta neurale già etichettati con Kaede e conforme a una particolare distribuzione, si possono utilizzare punti di riferimento più precisi per stabilire le regioni per la mappatura destino. Inoltre, avendo proteina espressa Kaede endogenamente sotto il controllo del promotore SOX10 assicura che solo le cellule della cresta neurale sono photoconverted e che solo derivati saranno classificati in una fase successiva, decordonatura sfondo potenziale 5.
Con questa tecnica, la formazione di qualsiasi cella cresta neurale derivata struttura craniofacciale zebrafish può essere visualizzata correttamente. Lo sviluppo di normali embrioni wild type zebrafish può essere seguita e questo riferimento di tipo selvaggio può essere paragonato agli embrioni in cui normale espressione genica è stata perturbata.
I potenziali modifiche includono l'utilizzo di un contenitore diverso per fissare l'embrione durante la visualizzazione. Questa può essere una capsula di Petri, o qualsiasi altro vassoio traslucido.
Se imaging non è successo, questo è probabilmente dovuto ad errori nelle impostazioni del software. Leggere il manuale utente del microscopio con attenzione prima di iniziare il tempo in diretta lapse.
Mentre l'imaging, è fondamentale concentrarsi sul piano di diritto dell'embrione e di fissare i confini Z-stack con precisione. Inoltre, i parametri di qualità dell'immagine, come fotogrammi / sec, media e LUT devono essere impostate nel migliore wapossibile y al fine di ottenere risultati di alta qualità.
Un potenziale limite di questa tecnica è che è tecnicamente difficile per le cellule di etichette su base singola cellula, come il tessuto circostante è inoltre esposto a luce UV. Inoltre, se la proliferazione cellulare è rapida, l'etichettatura rosso è perso attraverso diluizione dopo la divisione cellulare.
Inoltre, Kaede è tetrameric e ha la tendenza a formare aggregati quando fusa ad altre proteine. Questo limita il suo utilizzo nella maggior parte delle applicazioni di fusione in imaging cellulare dal vivo.
L'imaging dal vivo time-lapse è uno strumento importante per rendere complessi i dati sperimentali di sviluppo più accessibili alla comunità scientifica e un pubblico più ampio.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Robert Kelsh per gentile condividere il zebrafish reagente promotore SOX10.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sox10:kaede transgenic zebrafish line | MGH | Available via the Liao lab | |
| Petri dishes 100x15 mm | BD Falcon | 351029 | |
| Petri dishes 35 mmx10 mm | BD Falcon | 351008 | |
| Ultrapure Low melting point (LMP) Agarose | Invitrogen | 15517022 | |
| Lab Tek 2 Chamber SlideSystem | LabTek | 154453 | |
| Microloaders 200/pk | Fisher | E5242956003 | |
| Nikon A1R Si Confocal Ti series | Nikon | No Catalog number | |
| NIS Elements Software AR3.2 64-bit | Nikon | No Catalog number |
References
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