Summary
Visualisering av experimentella data har blivit en viktig del i att presentera resultat för forskarvärlden. Generation av levande tidsförlopp inspelning av växande embryon bidrar till en bättre presentation och förståelse för komplexa utvecklingsprocesser. Detta protokoll är en steg-för-steg guide till cellmärkning via photoconversion av kaede protein i zebrafisk.
Abstract
Vertebrate palatogenesis är en mycket koreograferad och komplex utvecklings process, som innefattar migration av cranial neural crest (CNC)-celler, konvergens och utvidgning av ansikts protuberanser och mognad av kraniofaciala skelettet. För att studera bidraget från den kraniella neural crest till specifika regioner av zebrafisk gommen en sox10: kaede transgen zebrafisk linje alstrades. Sox10 ger härstamning begränsning av kaede reporter protein till neurallisten, vilket gör cellen märka en mer exakt process än traditionell färg eller reporter mRNA injektion. Kaede är en foto-cabriolet protein som skiftar från grönt till rött efter fotoaktivering och gör det möjligt att följa celler exakt. De sox10: kaede transgen linje användes för att utföra härstamning analys för att avgränsa CNC cellpopulationer som ger upphov till maxillary kontra mandibular element och illustrerar homologi av ansikts protuberanser till amnioternas. Detta protokoll beskriver stegets för att skapa en levande time-lapse video av en sox10: Kaede zebrafisk embryo. Utveckling av SILBEN plattan kommer att fungera som ett praktiskt exempel. Detta protokoll kan användas för att göra ett tidsförlopp konfokala inspelning av någon kaede eller liknande photoconvertible reporter protein i transgena zebrafisk. Dessutom kan den användas för att fånga in inte bara det normala, men även onormal utveckling av kraniofaciala strukturer i zebrafisk mutanter.
Introduction
Orofaciala klyftor representerar den vanligaste kraniofacial missbildning, med 1/700-1, 000 leveranser påverkade 1. Störningar av tidig embryo kraniofaciala utveckling kan leda till bildning av läpp-och gomspalt (CL / P). Även om orsakerna till synd kluven har i stor utsträckning visat, de genetiska och epigenetiska baser av nonsyndromic former av orofacial clefting måste fortfarande avslöjats 2-4. För att förstå etiologin och patogenesen för dessa missbildningar, är det nödvändigt att belysa utvecklingen av kraniofaciala strukturer på en cellulär basis.
I alla ryggradsdjur kraniala neurallistceller (CNCC) migrera från den dorsala neuralröret att befolka svalg valv, som bidrar till bildandet av orofaciala strukturer. Störningar av tidig embryo neurallisten utveckling kan leda till bildning av kraniofaciala missbildningar inklusive CL / P 5-7.
In adsättning på strukturella likheter mellan zebrafisk och däggdjur kraniofaciala utveckling (CNCCs bor i homologa regioner), är genen reglerande nätverk starkt konservativa. Det har också visats att CNCCs utvecklas på samma sätt mellan amniote arter och zebrafisk 8, vilket gör den zebrafisk en kraftfull organism för studien av utvecklings-och genetiska basen av CL / s. Det har många fördelar, bland annat ringa storlek, snabb och ex-utero foster-utveckling, och höga avelspriser. Dessutom är embryot optiskt transparent, vilket gör den mottaglig för observation av komplexa utvecklings händelser under mikroskop 9. Det är en idealisk djurmodell för studier av migration och differentiering av kraniala neurallistceller.
Expanderande på tidigare publicerade verk 8, 10, 11, migrationsmönster CNCC beskrevs i detalj med hjälp av sox10: kaede transgen modell 5. Kaede är en foto-cabriolet protein som turns från grönt till rött efter fotoaktivering och gör det möjligt att spåra CNCCs exakt. Under denna omvandling peptiden ryggraden spjälkas, vilket tyder på att omvandlingen är stabil, vilket innebär att cellerna kan spåras till deras slutliga destination 12. Transgena linjer märkta med kaede under transkriptionskontroll av sox10 visade att amniote gommen och SILBEN platta av zebrafisk bildas homologt genom fusion av bilaterala maxillary protuberanser (MXP) med frontonasal framträdande (FNP) och att Y-formade fusions söm är jämförbar mellan arter.
Bland andra program, de sox10: var kaede transgena zebrafisk modell som används för att generera video av zebrafisk embryon vid olika utvecklingsstadier att visa bildandet av normala och onormala kraniofaciala strukturer. Photoconversion av särskilda grupper av celler som gör det möjligt att följa deras utveckling. Med denna metod en metod för att skapa live-avbildning av att utveckla craniofacIAL strukturer i zebrafisk införs, vilket gör det enkelt att visuellt visa detta komplex utvecklingsprocess.
Protokollet syftar till att dela upplevelsen av att generera dessa filmer med den normala utvecklingen av SILBEN plattan i sox10: Kaede transgena zebrafisk som exempel. Detta protokoll kan vidare användas till att göra time-lapse video av någon struktur härrör från kraniala neurallistceller i zebrafisk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Embryo Insamling för Photoconversion
- Sätt upp minst tio par sox10: Kaede transgena zebrafisk mellan 5 och 18:00 på kvällen.
- Nästa morgon, dra avdelare och samla ägg runt middagstid. Ta dem till petriskålar och sätta dem i 28,5 ° C inkubator.
- Vid ungefär 24 timmar efter befruktning, rengör petriskålar genom att ta bort döda embryon. Kontrollera utvecklingsstadiet av embryon 13 med hjälp av ljusfältmikroskop och eventuella fluorescerande mikroskop med förbättrade grönt fluorescerande protein (EGFP) filter. Kaede kommer att vara synlig genom detta filter.
- När embryona når 60 HPF överföra fem ljust fluorescerande embryon till en separat petriskål och dechorionate dem om det behövs.
2. Montering av Embryo för Photoconversion
- Montera embryo med hjälp av en vanlig fluorescerande mikroskop. Montering av embryon på konfokalmikroskop är extremt utmanande.
- Använd stativard E3 vatten eller bered nya E3 med användning av följande recept:
Lägg till följande per en liter destillerat vatten dH 2 O lägg till följande för att göra 1x E3L:
0,292 g 5,0 mM NaCl
0,013 g 0,17 mm KCl
0,044 g 0,33 mm CaCl2 (torkmedel, 96%, ACS-reagens)
0,081 g .33 mM MgSO 4 (anhydrated)
Tillval: tillsätt 200 l av 0,05% metylenblått till 1X E3 som fungicid och rör om.
Medel håller vid rumstemperatur under en vecka. - Använd standard tricaine eller förbereda tricaine använder följande recept:
För 5 L av 0,2% tricaine blanda följande ingredienser:
45 ml Tris-Cl (1 M pH 9,5)
5 LH 2 O
10 g tricaine - Förbered 'film juice "(50 ml E3, 0,015% tricaine lösning), genom att tillsätta 3,75 ml 0,2% tricaine till 46,25 ml E3.
- Förbered agaros genom att blanda 46,25 ml E3 vatten med 46,35 mg låg smältpunkt (LMP) agaros i en 50 ml glaskolv och lös upp fasta partiklar från mikrovågsugnen. Sedan till3,73 ml 0,2% tricaine till agaros och sätta glaskolv med agaros i 50 ° C vattenbad tills användning.
3. Förberedelse och montering av Embryo
- Söva embryon med E3/0.015% tricaine lösning i steg 1.1.2 och överföra embryot till kammar slide.
- Sug upp allt överflödigt E3 med pappersnäsduk och put agaros på embryo.
- Position embryo perfekt, bröst med microloader tips. Se till hela embryot inte flyter ovanpå agaros, men pressa hela kroppen ner. Häll sedan E3/0.015% tricaine lösningen över agaros inbäddad embryo tills kammaren är helt fylld med vätska.
4. Justera programvaruinställningar på konfokalmikroskop
- Använd 20X luft nedsänkningsbar mål (numerisk apertur 0,75; pinhole storlek 20) för att fokusera embryot. Tryck sedan på L100 ljus knapp på mikroskopet och välja kanaler i mjukvara. Öppna ikonerna visa / förvärvs controls/A1settings och click konfokala inställningsknappen. Nästa klicka på "auto" och välj följande kanaler innan du stänger fönstret igen:
K1: DAPI kanal-403,4 nm (våglängder mellan 350-410 nm kan användas)
Ch2: 488,0 nm
Ch3: 561,9 nm
5. Photoconversion
- Stäng av Ch1 och 3 och sätt på Ch2 innan du klickar på Ta bort spärrknappen och scanning.
- Fokus på celler av intresse för photoconversion, vilket görs bäst genom att börja med 1frame/sec och högspänning (HV) 200 och sedan gå upp i bilder / sek och sänka HV om detta tills den når 1/32 bilder / sek och HV runt 100 till 120, beroende på bakgrundsbrus.
- När embryot är i fokus, titta på den högra kanten av skärmen, ta den gröna kanten och göra bilden mindre så att den passar det område av intresse för photoconversion och högerklicka med musen. Mindre är bättre eftersom photoconversion är oåterkallelig.
- Vänd bilder / sek till 1 och HV till 200 och slogskanna. En inzoomad bild av området med photoconversion syns nu.
- Photoconvert celler genom att slå på kanal 1 (403,4 nm). Exponera till photoconverting laser någonstans 5-60 sekunder, beroende på regionens storlek tills gröna kaede som betraktas genom GFP-kanalen är nästan frånvarande.
- När den gröna kaede signalen är nästan frånvarande, stänger Ch1 av. Vänd Ch2 och 3 på. Klicka sedan höger in fönster på A1 skanningsområde fältet och tryck "återgång till ursprunglig storlek" för att kontrollera om önskade celler photoconverted.
6. Att göra en Z-stack
- Hitta ikonen "capture Z-serien" i menyraden och ange övre och undre gränserna för Z-stack innan du startar den. Ställ LUTS.
7. Software-Inställningar Time-lapse
- Gå till A1Simple GUI rutan och kryssa följande inställningar:
1/32 bilder / sek
storlek 1024
genomsnitt 4 eller 8X, beroende på antalet Z-stackar som måste tas i en slinga - Gå till:view / förvärvskontroller / ND sekvens förvärv och ange tidsram (8-30min), klicka på kontinuerlig och klicka på Z-stack. Ange gränser testas innan och börjar filmen.
- Fortsätt att tillsätta E3/0.015% tricaine lösning kammare bild hela dagen. På natten, fyller upp kammaren fullständigt. Det kommer att pågå fram till nästa morgon.
- Nästa morgon, fylla E3/0.015% tricaine lösning och kolla om embryot fortfarande lever. Förlust av fluorescens indikerar död. Fortsätt påfyllnad och kontroller under hela dagen.
- När konstruktionen är klar formning, eller embryot har dött, avslutar filmen.
8. Efterproduktion Processing
- Klicka på "visa maximal intensitet projektion" på verktygsfältet, högerklicka på bilden och skapa nytt dokument. Videon visas nu i bästa möjliga kvalitet. Gå vidare för att ta bort bildrutor som inte behövs och justerar LUT. Slutligen spara som. Avi. Detta format kommer att bli bra för Windows. För Mac ladda ner programvara to konvertera till. mov eller. wmv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I sox10: kaede transgen linje, flyttande och postmigrations CNCCs är märkta fluorescerande grönt. De CNCC celler märkta med grönt fluorescerande kaede rekapitulera endogen sox10 mRNA-uttryck 5.
Bland andra program, var denna djurmodell för att bättre visualisera utvecklingen av CNCC beroende kraniofaciala strukturer. Normal utveckling av specifika strukturer samt patologisk utveckling av kraniofaciala missbildningar, speciellt läpp-och gomspalt har fångats. En serie av levande time-lapse video av zebrafisk vid olika utvecklings tidpunkter har genererats.
Som ett exempel, embryon vid 60 HPF, ett stadium då de parade trabekelantal har träffats för att bilda den ethmoid plattan, valdes ut. Ensidig riktad photoconversion vilket resulterar i röd märkning av de mest främre delen av celler i SILBEN plattan utfördes. Först den normala förlängningen och bildandet av the SILBEN plattan observerades i vildtyp Tuebingen zebrafisk (se Figur 1 och Video 1). Med en förståelse för normal utveckling av den ethmoid plattan, var detta vildtyp hänvisning tillämpas sedan jämföra migration av CNCCs i embryon där normalt genuttryck har störd.
En specc1lb morfolino knockdown zebrafisk embryo valdes som ett representativt exempel. SPECC1L är den första genen som blandas in i utvecklingen av den sällsynta men allvarliga sned ansikts kluven. Morfolino Baserad knockdown av SPECC1L homolog specc1lb i zebrafisk resultat i bilaterala ansikts clefting i SILBEN plattan. Embryon vid 60 HPF embryon som hade injicerats med specc1lb antisense morfolino valdes ut och den mest främre delen av ethmoid plåtceller photoconverted ensidigt. I motsats till normal utveckling av SILBEN plattan, fel på fusion mellan median ethmoid platt celleroch laterala ethmoid platt celler kunde observeras. Detta liknar patogenes av ObFC utveckling hos människor, där fel på fusion mellan den laterala processen nasala och maxillary framträdande inträffar (se video 2).
Figur 1. sox10:. kaede photoconversion A. Ventral vy av 60 HPF sox10: kaede transgen zebrafisk. Strukturen märkta gröna i diagrammet och motsvarande verkligt levande bild liknar SILBEN plattan. Efter exponering för UV-ljus (vid 403,4 nm) under konfokalt mikroskop, är det fluorescerande proteinet kaede photoconverted från grönt till rött. B. photoconverted celler kan följas så som visas i panel B.
Film 1. Time lapse video 60 HPF skede vildtyp Tübingen zebrafisk embryo.Normal bildandet av SILBEN plattan. Ventrala uppfattning. Recorded var 30 min med start 60-72 HPF. Klicka här för att se filmen .
Movie 2. Time lapse video 60 HPF skede specc1lb morfolino injicerade embryo. Kan observeras Fel på fusion mellan median ethmoid plåtceller och sido ethmoid plåtceller. Ventrala uppfattning. Recorded var 30 min med start 60-72 HPF. Klicka här för att se filmen .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här har en ny metod för visualisering av craniofacial utveckling i zebrafisk modell visas. De sox10: kaede transgena zebrafisk linje har framgångsrikt använts för att beskriva migrationsmönster CNCC i detalj används som modellorganism 5.
Tidigare studier har använt bruttolandmärken som ögat till målceller och har förlitat sig på kaede mRNA injektion, photoconversion analyser eller bur fluorescein dextran för photoconversion 10, 11, 14, 15 sox:. 10 kaede transgen linje har många fördelar jämfört med dessa metoder. Med neurallistceller redan har märkts med kaede och överensstämmer med en mycket särskild spridning, får mer exakta landmärken för att fastställa områden för ödet kartläggning användas. Dessutom uttrycks med kaede protein endogent under kontroll av den sox10 promotorn säkerställer att endast neurallistceller är photoconverted och att endast derivat skall märkas på ett senare stadium, deskrynklas den potentiella bakgrunden 5.
Med denna teknik kan visas bildandet av en neural crest celler härstammar kraniofaciala struktur i zebrafisk med framgång. Utvecklingen av normala vildtyp zebrafisk embryon kan följas och denna vilda typen referens kan jämföras med embryon där normalt genuttryck har störd.
Potentiella ändringar inkluderar användning av en annan behållare för att fixera embryot under visualisering. Detta kan vara en petriskål, eller något annat genomskinligt magasin.
Om avbildning inte lyckas, är det sannolikt på grund av misstag i programmets inställningar. Läs bruksanvisningen för mikroskopet noggrant före live-tid förfaller.
Medan avbildning, är det viktigt att fokusera på rätt plan embryot och att ställa Z-stack gränser exakt. Vidare bildkvalitetsparametrar såsom bilder / sek, i genomsnitt och LUTs måste ställas in på bästa way möjligt för att få resultat av hög kvalitet.
En potentiell begränsning av denna teknik är, att det är tekniskt svårt att märka celler på en enkelcellbasis, som omgivande vävnad är även utsatt för UV-ljus. Vidare, om celldelning är snabb, är den röda märkningen förloras genom utspädning efter celldelning.
Dessutom är kaede tetramert och har en tendens att bilda aggregat när smält till andra proteiner. Detta begränsar dess användning i de flesta fusions applikationer i levande cell imaging.
Live-time-lapse avbildning är ett viktigt verktyg för att göra komplexa utvecklings experimentella data mer tillgängliga för forskarvärlden och en bredare publik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Författarna tackar Robert Kelsh för vänligt dela zebrafisk sox10 promotorn reagens.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sox10:kaede transgenic zebrafish line | MGH | Available via the Liao lab | |
| Petri dishes 100x15 mm | BD Falcon | 351029 | |
| Petri dishes 35 mmx10 mm | BD Falcon | 351008 | |
| Ultrapure Low melting point (LMP) Agarose | Invitrogen | 15517022 | |
| Lab Tek 2 Chamber SlideSystem | LabTek | 154453 | |
| Microloaders 200/pk | Fisher | E5242956003 | |
| Nikon A1R Si Confocal Ti series | Nikon | No Catalog number | |
| NIS Elements Software AR3.2 64-bit | Nikon | No Catalog number |
References
- Prevalence at Birth of Cleft Lip With or Without Cleft Palate: Data From the International Perinatal Database of Typical Oral Clefts (IPDTOC). Cleft Palate Craniofac. J. 48 (1), 66-81 (2011).
- Dixon, M. J., et al. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences. Nat. Rev. Genet. 12 (3), 167-178 (2011).
- Mangold, E., Ludwig, K. U., Nothen, M. M. Breakthroughs in the genetics of orofacial clefting. Trends Mol. Med. 17 (12), 725-733 (2011).
- Kimmel, C. B., Miller, C. T., Moens, C. B. Specification and morphogenesis of the zebrafish larval head skeleton. Dev. Biol. 233 (2), 239-257 (2001).
- Dougherty, M., et al. Embryonic Fate Map of First Pharyngeal Arch Structures in the sox10: kaede Zebrafish Transgenic Model. J. Craniofac. Surg. 23 (5), 1333-1337 (2012).
- Trainor, P. A., Krumlauf, R. Hox genes, neural crest cells and branchial arch patterning. Curr. Opin. Cell Biol. 13 (6), 698-705 (2001).
- Schilling, T. F., Kimmel, C. B. Segment and cell type lineage restrictions during pharyngeal arch development in the zebrafish embryo. Development. 120 (3), 483-494 (1994).
- Swartz, M. E., et al. Examination of a palatogenic gene program in zebrafish. Dev. Dyn. 240 (9), 2204-2220 (2011).
- McCollum, C. W., et al. Developmental toxicity screening in zebrafish. Birth Defects Res. C. Embryo Today. 93 (2), 67-114 (2011).
- Wada, N., et al. Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull. Development. 132 (17), 3977-3988 (2005).
- Eberhart, J. K., et al. Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development. Development. 133 (6), 1069-1077 (2006).
- Ando, R., et al. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 99 (20), 12651-12656 (2002).
- Kimmel, C. B., et al. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203 (3), 253-310 (1993).
- Kawakami, A., et al. The zebrafish-secreted matrix protein you/scube2 is implicated in long-range regulation of hedgehog signaling. Curr. Biol. 15 (5), 480-488 (2005).
- Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. Cell tracking using photoconvertible proteins during zebrafish development. J. Vis. Exp. (67), e4350 (2012).
