Summary
Vi har utvecklat en metod för att utföra kors i Setaria viridis (S. viridis). Metoden involverar beskärning vippans före en varmvattenbehandling för att döda viabelt pollen. Crosses utförs efter en väl kontrollerad tillväxt regimen och vanligtvis leda till återvinning av 1-7 korspollinerade frön / s per vippans.
Abstract
Setaria viridis är en framväxande modellsystem för C 4 gräs. Den är nära besläktad med den bioenergi råvara switchgrass och spannmålsskörden rävsvans hirs. Nyligen, den 510 Mb genomet av rävsvans hirs, S. italica har sekvenserats 1,2 och 25x täckning genomsekvens av luftig släkting S. viridis pågår. S. viridis har ett antal egenskaper som gör den till ett potentiellt utmärkt modell genetiskt system inklusive en snabb generationstid, liten kroppsbyggnad, enkla krav tillväxt, produktiv fröproduktion 3 och utvecklat system för både övergående och stabil transformation 4. Men genetiken av S. viridis är till stor del outforskat, delvis på grund av bristen på detaljerade metoder för kors. Hittills har ingen standardprotokoll antagits som möjliggör snabb produktion av frön från kontrollerade korsningar.
Protokollet presterade här är optimerad för att utföra genetiska korsningar i S. viridis, A10.1 anslutningen. Vi har anställt en enkel värmebehandling med varmt vatten för kastrering efter beskärning av panicle att behålla 20-30 buketter och märkning av blommor för att eliminera utsäde från nyutvecklade blommor efter kastrering. Efter att ha testat ett antal värmebehandlingar vid permissiva temperaturer och genom att variera varaktigheten av doppning, har vi etablerat en optimal temperatur och tidsintervall av 48 ° C under 3-6 min. Genom att använda denna metod kan utföras i minst 15 korsningar av en enda arbetare per dag och ett genomsnitt av 3-5 utparning avkomma per panicle kan återvinnas. Därför kan produceras i genomsnitt 45-75 utparning avkomma av en person under en enda dag. Bred tillämpning av denna teknik kommer att underlätta utvecklingen av rekombinanta inavlade linjer populationer av S. viridis X S. viridis eller S. viridis X S. italica, kartlägga mutationer genom bulk SEgregant analys och skapa högre mutanter order för genetisk analys.
Introduction
S. viridis är ett NADP-ME subtyp C 4 gräs nära relaterad till bioenergi råvara switchgrass (NAD-ME-subtyp), spannmålsgrödor foxtail hirs, och jordbruks ogräs guinea gräs 5. Den 510 Mb genomet av odlad form av Setaria, S. italica, har nyligen sekvens 1,2 och 25x täckning genomsekvens av luftig släkting, S. viridis, pågår (opublicerad). S. viridis har ett antal egenskaper som gör den till ett potentiellt utmärkt modell genetiskt system inklusive en snabb generationstid, liten kroppsbyggnad, enkla krav tillväxt och produktiv utsädesproduktion 3. Huvudsakligen har metoder nyligen utvecklats för både övergående och stabil transformation av S. viridis, som ger möjlighet till att skapa transgena växter 4. Men en stor flaskhals i utvecklingen av genetiska verktyg för S. viridis är dess räkna omitrance att utkorsning. Hittills har ingen standardprotokoll publicerats som möjliggör snabb produktion av frö från kontrollerade korsningar.
Genetiska kors i S. italica vanligen utförs av kastrering genom borttagande av ståndarknappar från blommor 6,7,8 eller genom värmebehandling av blommor kvinnliga föräldrar 9-11. Efter dessa behandlingar, ståndarknappar eller vippor från icke-behandlade blommor / är manliga föräldrar försiktigt slipas mot pistillmärken släppa pollen. I kastrering är ståndarknappar bort med fin pincett direkt efter floret öppnas och anther börjar exsert, men har ännu inte gett ifrån sig pollen 6-8. Bland de utmaningar som denna senare metod är svårigheten att utföra kastrering i ett smalt tidsintervall mellan öppningen och pollen skjul av blomman. Varaktigheten för öppning och stängning av en enda blomma varierar beroende på anslutningen och miljöförhållanden, och kan variera från 7 min <sup> 6-2,5 tim 12 i S. italica. Sedan sprider pollen förekommer som ståndarknappar exsert från floret, ståndarknappar måste noga och snabbt tas bort, och därför är det svårt att undvika kontaminering på grund av självpollinering. Dessutom, som pollinations utförs omedelbart efter kastrering, är antalet korsningar som kan utföras per person / per dag begränsad.
Som en alternativ metod kan mogna panicles doppas i varmt vatten för att värma-kill utveckla pollenkorn 9,10,13,14 med fördelen av att utföra kors på ett stort antal vippor. Men temperaturen och varaktigheten av värmebehandlingen varierar stort mellan olika experiment (t.ex. 47 ° C under 10 min 14 och 42 ° C under 20 min 10). Dessutom har några systematiska analyser om effekten av värme-medierad emasculations publicerats. Sålunda kan en standard och enkelt förfarande för att utföra genetiska korsningar i S. viridis skulle kraftigt påskynda utvecklingen genetiska resurser och inrättandet av S. viridis som modellsystem inom forskarvärlden.
Vi rapporterar utveckling och optimering av ett standardprotokoll för att utföra genetiska korsningar i S. viridis. Växter odlas under kontrollerade miljöer för att synkronisera blomutveckling och öka reproducerbarheten av förfarandet. Crosses utförs med hjälp av en transgen S. viridis linje som den manliga föräldern som innehåller GUS reportergenen 4 för att underlätta identifieringen av framgångsrika kontrollerade genetiska korsningar. GUS transgen drivs av en ris ubikitinpromotor som gör det möjligt att göra poäng i F1 frön direkt efter skörd och därmed ger en enkel kvalitativ analys för att bestämma effektiviteten av kastrering och pollinering. Vi har anställt en enkel värmebehandling med varmt vatten för kastrering åtföljd av märkning av blommor som har emasculated att eliminera utsäde från nyutvecklade blommor efter kastrering. Efter att ha testat ett antal värmebehandlingar vid tillåtande temperaturer och variera längden på att doppa i varmt vatten, har vi etablerat en optimal temperatur och tid löptider på 48 ° C 3-6 min. En före gryningen kylbehandling befanns främja synkron anthesis i båda föräldrarna för att underlätta korsbefruktning. Vi har också diskuterat de viktigaste stegen i protokollet och den framtida tillämpningen av denna metod till andra Setaria anslutningar.
Protocol
1. Tillväxt av S. viridis
- Ställ tillväxtkammarförhållanden till 31 ° C/22 ° C (dag / natt), 12 tim light/12 hr mörk, 50% relativ fuktighet med en före gryningen behandling av 15 ° C 8:30 till 09:00 AM. (Figur 1). Under dessa förhållanden är S. viridis A10.1 tar cirka 21-22 dagar från sådd till blomning.
- Fyll lägenheter (4 x 9 celler) med Metro Mix 360 och ta bort en cell för bevattning.
- Lätt dimma vatten på markytan.
- Så fröer på ytan av jord, ett frö per cell.
- Täck fröerna med ett jordlager (ca 0,5 cm)
- Mist ytan av lägenheter mark och vatten från bottnen. Håll vattna från botten efter sådd.
- För varje kors som kommer att utföras på minst tre anläggningar kommer att användas som kvinnliga föräldrar och nio anläggningar kommer att användas som manliga föräldrar. Sådd bör fördelas enligt alla växter kommer inte att blomma på samma dag. Seed sowing rekommenderas varje dag under en tre-dagarsperiod.
- Vattna plantorna 1-2 gånger per dag, vilket är beroende av storleken av de växter och markförhållandena. Överskott av vatten i jord är inte gynnsamt för optimal tillväxt av växter, och kan leda till svamptillväxt i jord och skador av bladvävnad.
- Gödsla växter två gånger i veckan, med användning Jacks 15-16-17 vid en koncentration av 100 ppm.
2. Trimning och märkning av Vippa innan kastration - Dag 1
- På eftermiddagen eller kvällen före pollinering, flytta växter från odlingskammaren till labbet (Temperatur (T): 24.06 ° C ± 0,13 ° C, relativ fuktighet (RF) 21.79% ± 1,15%).
- Markera de primära vippor med 1 blomma till 1/3 av blommor på panicle som redan har blommat.
- I denna studie var de fyra domänerna inom den vippans definieras enligt följande (Figur 2A; spets, distala mitten, proximala mitten och basen).
- Helst choosea vippans med 1-5 blommor som har blommat, skära av toppen på panicle (distala änden), och ta bort alla blommor i de proximala delarna mitten och bas med hjälp av fjäder sax eller fin pincett.
- Om vippans har cirka 1/10 till 1/5 av blommor som har blommat, skära av spetsen och trimma blommorna från basen på vippans endast behålla den nedre delen av den distala mellersta och övre delen av proximala mellersta för ytterligare trimning.
- Om en vippans har ca 1/4 till 1/2 av blommor som har blommat, skära av den distala mittsektionen och bara behålla den proximala mittsektionen för ytterligare trimning.
- Använd kirurgisk sax för att lätt trimma borsten.
- Ta bort alla blommor som har blommat och alla omogna blommor lämnar ungefär 20-30 blommor / vippans som är jämnt fördelade i regionen (Figur 3). Praktiken omsorg för att hålla kvar borsten i regionen som ska pollineras för att skydda florets från möjliga värmeskador.För varje spikelet, behålla den övre mest mogna floret. De övre flesta floret kommer att ha en högre sannolikhet för antes vid tiden för pollinering (Figur 2B).
- Markera en sida av varje blomma med en röd permanent markör och registrera antalet buketter på panicle (Figur 2B).
- Flagga för panicle med följande information: datumet för kastrering, varaktighet och den temperatur vid vilken kastrering utförs.
- När panicle trimmas, ta bort alla jordfräsar för varje anläggning för att se till omfördelning av mer resurser till utvecklingen av de viktigaste panicle.
3. Kastrering med varmt vatten-doppning - Dag 1
- Ställ på vattenbadet på 48 ° C ± 0,1 ° C under värmebehandlingen.
- Böj försiktigt de trimmade vippor och doppa dem i varmt vatten vid 48 ° C i 3-6 minuter. Var försiktig att inte bryta stammen av panicle.
- Ca 3-4 vippor kan doppas together på en gång, samtidigt som tillräckligt med utrymme mellan vippor för jämn fördelning av värmen. Det är väsentligt att dränka hela vippans i varmt vatten under värmebehandling. Flaggan blad (löv som upptar den panicle som ger näring till panicle) bör inte komma i kontakt med varmt vatten för att undvika värmeskador på bladvävnad.
- När kastrering utförs för önskad längd, ta bort vippor från vattenbadet och försiktigt skaka av vattnet från panicle.
- Placera en anpassad mikro perforerade brödpåse för att helt täcka den kastrerad vippans och fäst den med en twist-slips. Micro-perforerade brödpåsar kan anpassas efter storleken på panicle (ingår i video).
- Placera växter tillbaka i tillväxtkammaren till nästa dag.
4. Korsning / pollinering efter kastrering - Dag 2 och Dag 3
- Vid 09:00 på dag 2 och dag 3, flytta hona (kastrerad) och male föräldrar från tillväxtkammaren till labbet (T: 24,06 ° C ± 0,13 ° C, RH: 21.79% ± 1,15%) för att utföra korsningar.
- Observera och lägga till ytterligare en röd prick på blommor som har blommat eller blommar med hjälp av en röd märkpenna. Notera den totala antalet blommat blommor per panicle.
- Anteckna datumet för pollinering och namnet på den manliga föräldern på taggen för att hålla reda på vad korsningar utförs.
- Följ topptiden för blomning i manliga föräldrar. Under våra kammarförhållanden (figur 1) blommor på vippor av den manliga föräldern börjar synkron öppning runt 10:10. Från tiden för öppnandet av blommor, kommer den kompletta exsertion av ståndarknappar och frisättning av pollen inträffar efter 20 min.
- Den perfekta scenen för pollinering är i vilket skede av pollen från den manliga föräldern släpps. Blommorna kommer att stänga efter 20 min från pollen släpps. Därför är varaktigheten för blomning ca 40 min från tiden för öppnandet av flödeters. Färgen på pollen förändringar från gulvit till brun under en period av ca 30 min efter blomman stängs.
- Starta pollinering omedelbart när gulvita ståndarknappar syns på blommor av den manliga föräldern. Pollinations utförs på dag 2 och dag 3 med hjälp av en av tre metoder:
- Vippa-till-vippans pollinering: genom att använda en fristående vippans som den manliga, försiktigt gnugga panicle tillsammans med den kastrerad vippans att underlätta pollinering och kasta den manliga Vippa för att undvika kontaminering. Upprepa pollinering processen tills varje kastrerad vippans har pollineras av 2-3 vippor.
- Anther till stigmatisering pollinering: genom att använda pincett plocka en blomma som blommar med gulvita ståndarknappar eller plocka ståndarknappar och fysiskt röra stigmatiseringen av blomman på den kvinnliga föräldern. Använd en blomma från den manliga föräldern att pollinera en blomma på kastrerad vippans. Upprepa pollinering process tills varje stigma på kastrerad vippans har pollineras av några (ca 2-3) blommor / ståndarknappar. Iklädd ett förstoringsglas visir kommer att göra bättre sikt för att utföra pollinering.
- Mellan pollinations av olika manliga föräldrar, doppa tången i 95% etanol följt av avtorkning med Kimwipes för att undvika kontaminering på grund av transport av pollen mellan olika korsningar.
- Vippa bindande: Efter kastrering, välj 3-4 vippor på den manliga föräldern som kommer att blomma nästa dag. Bind ihop dem med den kastrerad vippans av den kvinnliga föräldern med hjälp av en twist-slips. Placera kastrerad vippans något nedanför vippans av den manliga föräldern. Placera en glassin påse över vippor och fäst påsen vid basen med ett gem. Detta kan fyllas på dag 2 när vippor av den manliga föräldern börjar blomningen.
- Under den blommande tid på morgonen av dag 2 och dag 3, flick eller skaka glassin väska att Facilitate pollinering. Fortsätt att bläddra eller skaka vippor var 15 min under hela den tid antes på morgonen (mellan 09:00-11: 00:00). Ta vippor av den manliga föräldern efter pollinering och märka den motsatta sidan av de blommade blommorna på kastrerad vippans. Anteckna antalet blommade blommor på Vippa för varje kvinnlig förälder.
- När pollinering har utförts, placera en anpassad mikro perforerade brödpåse för att täcka panicle av den kvinnliga föräldern och fäst vid basen med en twist-slips efter pollinering tills frö skörd.
5. Bord
- Harvest frön efter 2 veckor (14-16 dagar) från dagen för pollinering. Placera taggen i samma påse av fröna. Frön som har röda markeringar på båda sidor representerar de frön som resulterade från det kontrollerade genetiska korset. Dessa förväntas bli utparning avkomma.
- Kasta frön utan röda markeringar som de representerarfrön som är resultatet av nyutvecklade blommor efter kastrering. Frön med röda markeringar endast på ena sidan kommer sannolikt representerar utsäde från självpollinering eftersom de inte blommar vid den tidpunkt då de kontrollerade korsningar utfördes.
- Torra frön vid 30 ° C i 2 dagar i ett frö torktumlare. Store torkades fröna i labbet (T: 24,06 ° C ± 0,13 ° C, RH: 21,79% ± 1,15%) eller i ett frö kammaren (T: 4,0 ° C ± 1,0 ° C, RH: 20% ± 1%).
Representative Results
I denna studie har vi använt sekvense S. viridis anslutning A10.1 som den kvinnliga föräldern, och en transgen S. viridis linje (även A10.1) innehåller GUS reportergenen 4 som den manliga föräldern för alla pollinations. En optimerad tillväxt ordning användes för att synkronisera blomning såsom visas i fig. 1. Vi har testat ett antal kombinationer av temperatur och tid för värmebehandlingen för kastrering och observerades att omkring 40 till 80% av blommorna behållas på kastrerad vippans blommade på 2: a dagen, medan återstoden blommas på den 3: e dag (Figur 2). Om emellertid värmebehandlingen var alltför svår, för ett exempel, 49 ° C under 4 min, mycket få eller inga blommor blommade på 2: a dagen. Korspollinering utfördes på 2: a eller 3: e dagen efter kastrering, som var beroende av den maximala tiden för blomning av manliga föräldrar.
Det var observerbaraed att unga blommor fortsatte att utvecklas efter kastrering, mognat och själv pollineras 3-6 dagar efter kontrollerade pollinations. Efter 7-10 dagar efter pollinering, blommor som är vita till färgen syns på panicle. Dessa vita blommor är obefruktade grund av antingen värmeskador eller dålig pollinering. Samtidigt, de blommor som har framgångsrikt pollineras börja bära mörka frön och börja splittras efter 14 dagar. De mörka frön med röda markeringar som skördats på den 14: e dagen efter pollinering kan tydligt särskiljas från frön utan röda markeringar som fortfarande var gröna och inte splittras. Om skörden är försenad, den anthecium av fröna med och utan röda markeringar både bli mörk, vilket gör det svårt att snabbt skilja fröna med röda markeringar i skördade pooler.
För att optimera de passage protokoll flera värmebehandlingsexperiment utfördes såsom sammanfattas i tabell 1. Ett genomsnitt av0-10 frön / vippans utvanns från olika värmebehandlingsexperiment. Efter skörd var frön torkades vid 30 ° C under 2 dagar i ett frö tork, följt av avlägsnandet av den anthecium använder en anthecium remover. Efter anthecium togs bort, var förmodade F1 frön färgas med GUS-färgningslösning, och utparning avkomma färgas blå färg i 1-2 timmar (Figur 2F). Baserat på dessa resultat rekommenderar vi en värmebehandling på 48 ° C i 3-6 minuter. Dessutom rekommenderar vi att kors utföras på både dag 2 och dag 3 efter kastrering.
För att undersöka effekten av denna teknik i att utföra korsningar med andra Setaria anslutningar eller arter, korsningar mellan S. viridis A10.1 och åtta skiftande S. viridis anslutningar och en S. pumila anslutningen utfördes. Även dagar till blomning varierad bland anslutningarna fann vi att blommor av alla åtta S. viridis anslutningar och en S.pumila anslutning börja öppna mellan 10:00 till 11:00 med en topp öppningstid kl 10:20 till 11:00 efter predawn kylbehandling. Detta indikerar att predawn kylbehandling kan tillämpas på olika Setaria anslutningar. En värmebehandling vid 48 ° C under 5-6 min användes för att försvaga S. viridis A10.1 som användes som den kvinnliga föräldern för alla korsningar utförda. Vi återhämtat sig från en till 12 frön från korsningar mellan A10.1 och tre av de olika S. viridis anslutningar och sex frön från en korsning mellan S. viridis A10.1 och en enda S. pumila anslutning. Men vid den här tiden har vi inte fastställt om dessa frö resultatet av en lyckad testcross eller var resultatet av själv-smitta. Oavsett dessa preliminära resultat tyder på att tillväxtförhållanden som används för S. viridis A10.1 kan användas för att generera kors med varierande S. viridis anslutningar och eventuellt andra arter av Setaria.
| Temp värmebehandling (° C) | Tids värmebehandling (min) | # korsningar | Avg. # Av blommor efter trim | Dag för pollinering (dagen efter emasc) | Avg. # frön (röd) / vippans (medel) | Avg. % Gus (+) / frön (röd) | Avg. # HYB frön (Gus +) | Min # HYB frön | Max # HYB frön |
| 47 | 10 | 2 | 27 | 2: a dagen | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 48 | 3 | 3 | 36 | 2: a dagen | 5 | 60 | 3 | 1 | 5 |
| 4 | 3 | 25 | 3: e dag | 10 | 50 | 5 | 3 | 7 | |
| 5 | 8 | 25 | 2: a dagen | 5 | 60 | 3 | 1 | 6 | |
| 6 | 3 | 25 | 2: a dagen | 4 | 75 | 3 | 0 | 4 | |
| 7 | 4 | 24 | 2: a dagen | 3 | 33 | 1 | 0 | 4 | |
| 7 | 1 | 25 | 3: e dag | 4 | 75 | 3 | N / A | N /ETT | |
| 49 | 1 | 3 | 23 | 2: a dagen | 5 | 25 | 1 | 0 | 2 |
| 2 | 7 | 26 | 2: a dagen | 8 | 25 | 2 | 0 | 4 | |
| 3 | 5 | 22 | 2: a dagen | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | |
| 4 | 4 | 25 | 2: a dagen | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
Tabell 1. Optimering av värmebehandling för kastrering. Resultat ändra både temperaturen och tiden för värmebehandlingen. Pollinations utfördes en (2: a dag) eller två dagar (3: e dag) efter kastrering och framgångsrika utparningar sfyllda med GUS-färgning
Figur 1. Optimerade tillväxtkammaren förhållanden med en före gryningen kylbehandling. Temperatur-och tidsperioder för optimal tillväxt och synkronisering av blomma produktion visas. Gröna och röda pilarna visar optimal fönster för att utföra kors och kastrering, respektive.
Figur 2. Panicle förberedelse för passage och GUS färgning av utparning avkomma. (A) En panicle av Setaria viridis A10.1 innan trimning, visar ungefär 1/10 av blommor öppnade. De fyra avsnitt och riktverkan i progression av antes längs panicle visas.
Figur 3. Flödesschema för protokollet En schematisk representation av de major stegen i att utföra S. viridis korsar.
Discussion
Vikten av före gryningen behandling
För att få en hög frekvens av utparning avkomma är det viktigt att ha högt synkron anthesis av manliga och kvinnliga föräldrar. Till en början cyklade vi temperatur och ljusregimer (31 ° C/22 ° C, dag / natt) och använde S. viridis anslutningen A10.1 för alla pollinations. Under dessa förhållanden, de flesta blommorna öppnar tidigt på morgonen innan temperaturen stiger till 31 ° C, även om några blommor öppna slumpvis mellan 08:00-8: 12:00. Tidigare studier i S. italica indikera att tiden på dygnet, plats och årstid bidrar till variation i blomning 7,15,16. Siles et al. 6 noterade att antes var associerad med snabba förändringar i temperatur och luftfuktighet, men inte med låg temperatur och hög luftfuktighet, i sig, som avslutades i tidigare studier 7,15. Därför använde vi en pre-dawn kylbehandling av 15 ° C i 30 minuter (från 8:30-9: 12:00) för att efterliknaden naturliga före gryningen tillstånd. Denna före gryningen kylbehandling hjälp att synkronisera anthesis i föräldrarnas. Vi observerade att trots att sätta kammaren för relativa fuktighetsnivåer av 50%, den relativa fuktigheten inuti kammaren ökas till en nivå över 70% när temperaturen sjönk från 22 ° C till 15 ° C och fortsatte att ligga över 70% till dess att temperaturen gradvis steg till 31 ° C efter 09:30. Vid 09:00, kastrerad kvinnliga föräldrar och växter av manliga föräldern kommer till labbet (T: 24,06 ° C ± 0,13 ° C, RH: 21.79% ± 1,15%). Blommor av de manliga föräldrar börjar öppna runt 10:10, och pollinering kan utföras vid 10:30-11: 12:00. En detaljerad lista på alla reagenser och utrustning som finns i tabell 2.
Betydelsen av vippans förberedelse för kastrering
Enligt kammarförhållandena i denna studie (figur 1), hur länge primär panicle blommande varierade från2-3 dagar. Typiskt blommor placerade på den distala mitten av blomställning (figur 2A) öppna första och öppning föregår proximalt och distalt. Det ideala antalet blommor som ska behållas på panicle är 20-30. Försiktighet bör iakttas vid avlägsnandet av omogna blommor så att endast välutvecklade blommor (den översta blomman eller största på Småax 17) behålls. Märkning med röd markering på båda sidor av blommor hjälper att effektivt skilja förmodade outcross avkomma från frön från nyutvecklade blommor efter kastrering. Dessutom är det viktigt att lämna borsten på vippor innan kastrering för att skydda buketter från omfattande värmeskador, men som ett alternativ, de kan tas bort efter kastrering med hjälp av fjäder sax för att underlätta pollinering, speciellt när en vippans bindande Tekniken används (figur 2C och 2D).
Optimerad temperatur end behandlingstid för varmvattenbehandling
Grunden för kastrering genom varmt vatten doppning är att pollen är mer känsliga för värme än stigmatiserad yta. Dock får varaktigheten och temperaturen för värmebehandlingar varierar bland Setaria arter och anslutningar. I allmänhet kommer en högre temperatur med en kortare behandlingstid eller en lägre temperatur med en längre behandlingstid ha samma effekt på kastrering. Det har rapporterats att en värmebehandling vid 42 ° C under 20 min 10 eller 47 ° C under 10 min 14 renderade S. italica pollen icke-livskraftiga, men effektiviteten av dessa behandlingar var inte bestämd. Vi har utvecklat våra protokoll efter hypotesen att det enligt en optimerad temperatur och behandlingstid, pollen av alla blommor kvar på den kvinnliga föräldern kommer att vara icke-hållbara och samtidigt pistillmärken förblir mottaglig. Men efter att ha jämfört och analysera effekterna av olika temperaturer ochbehandlingsperioder (tabell 1), fann vi att känsligheten för värmebehandlingen varierar bland blommorna som behålls varje panicle, därför är det svårt att helt eliminera utsäde från självpollinering. Vi drar slutsatsen att effektiviteten vid produktionen utparning avkomma är störst när behandlingar utförs vid 48 ° C under 3-6 min i S. viridis anslutningen A10.1.
Peak tiden för blomningen och korspollinering
När blommorna nå mognad och är på väg att öppna, ståndarknappar är gulvit i färgen och pollen är skjulet så snart ståndarknappar exsert från blommorna 8. Ståndarknappar småningom bli brun efter pollen är skjulet som blommorna börjar stänga. När släpps, är livskraft pollen okänd. Därför är det viktigt att använda pollen från att öppnas eller nyöppnade blommor på den manliga föräldern så snart som möjligt. Under våra kammar förhållanden (Figur 1), majoriteten av flowers av de manliga föräldrar börjar öppna vid 10:10 och de öppnade blommorna skjul pollen vid 10:30. Således är det önskvärt fönstret för att utföra pollinering från 10:30 till 11:00. Pistillmärken förblir utanför glumes efter blommor nära och kan vara mottaglig för pollen. Detta har tidigare observerats och bekräftats i S. italica att pistillmärken är mottagliga för ca 48 h efter blomma öppning genom Siles et al. 6, så det är viktigt att väskan vippor efter värmebehandling och efter att ha utfört kontrollerade korsningar. Såsom diskuterats ovan, rekommenderar vi att prestanda pollinations på både dag 2 och dag 3 efter kastrering.
Metoder för pollinering
Vi jämförde effektiviteten hos tre pollinering tekniker. Om blommande blommor inte är begränsande, är vippans till vippans pollinering den mest effektiva tekniken och kommer att generera ett högre antal utparning avkomma. Om blommande vippor är begränsande, en högre frekvens av outcross avkomma kommer att produceras när den anther-till-stigma metod används. Vi har fått utparning avkomma från båda metoderna framgångsrikt. Den "bindande vippor" Metoden har använts i korsning S. italica 6 men vi hittade den här metoden för att vara den minst effektiva metoden som tidsfönster för pollen utsöndring av den manliga föräldern är kort. Dessutom finns det mindre kontroll över pollinering och borsten på S. viridis vippor kan också hindra förflyttning av pollen på stigmatiserad ytan.
Seed skörd, torkning och lagring
Efter skörden skall frön torkas vid 30-33 ° C under 2 dagar. Anthecium bör avlägsnas för GUS-färgning, om nödvändigt. Frön ska förvaras på en torr, sval plats (T: 24,06 ° C ± 0,13 ° C, RH: 21.79% ± 1,15%) för korttidsförvaring (mindre än två år) eller i ett frö kammare (T: 4,0- 10 ° C ± 1,0 ° C, RH: 20% ± 1%) för långtidsförvaring.Dåliga lagringsförhållanden kan leda till låga lönsamhets priser 8. Vi har observerat att grobarheten av S. viridis A10.1 är cirka 5%, när sått 4 dagar efter skörden, men kan ökas till 90 till 96% efter lagring i laboratoriet (T: 24,06 ° C ± 0,13 ° C, RH: 21,79% ± 1,15%) för 110 dagar efter skörd, följt av en tre-dagars skiktning vid -80 ° C för att bryta frö dvala. För stratifieringen vid -80 ° C, kan torra frön placeras i en lufttät behållare (t.ex. mikro-centrifugrör eller mynt kuvert i en förseglad plastpåse) och hölls vid -80 ° C under 3 dagar före plantering. Efter 16 månaders lagring i laboratoriet (T: 24,06 ° C ± 0,13 ° C, RH: 21.79% ± 1,15%), kan grobarhet procentsatser av 90-95% fortfarande erhållas. Dessutom, för att bryta den dvala, frön kan torkas vid 30-33 ° C under 2 dagar efter skörd, och sedan ges tre dagars skiktning vid -80 ° C följt av avlägsnande avanthecium före plantering. Efter dessa behandlingar, kan frögroning hastigheter på upp till 33% kan uppnås.
Fördelar, begränsningar och eventuella ändringar
Här ger vi den första standardprotokoll för att utföra kors i S. viridis A10.1 genom användning av en värmebehandling för kastrering. I motsats till fysisk kastrering, är detta protokoll mindre invasiv och relativt lätt att etablera sig i ett labb. Det brukar ta ungefär 15 minuter att trimma en Vippa och ca 15 vippor kan trimmas och korsade / person / dag. Om man antar ett genomsnitt av 3-5 utparning avkomma / vippans kan återvinnas under optimerade förhållanden, kan produceras totalt 45-75 utparning avkomma av en person på en enda dag. Dessutom kan denna teknik appliceras på kors i andra Setaria arter, även om ytterligare optimeringar kommer att vara sannolik. Om tillväxten kammarutrymme är begränsat, kan växterna odlas i växthus eller odlingsrum utan en före gryningen treatment tills panicle framträder innan de flyttas till de optimerade kammarförhållanden.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi tackar Sankalpi Warnasooriya och Amy Humboldt för kritisk läsning och redigering av manuskriptet. Detta arbete har finansierats med bidrag från Department of Energy (DE-SC0008769) och National Science Foundation (IOS-1.127.017).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Scissors, spring | World Precision Instruments, Inc | 14126 | |
| Forceps, Dumostar Biology Polished | SPI Supplies | TD5BP-XD | |
| Surgical Scissors | F.S.T (Fine Science Tools) | 14005-12 | |
| Europack Clear Polypropylene Micro-Perforated Crusty Bread Bags 6"x28" | http://www.pjpmarketplace.com | 361001 | |
| Flats | T.O. Plastics | 715401C | |
| metro mix 360 | Hommert International | 10-0356-1 | |
| Jack's 15-16-17 | Hommert International | 07-5925-1 | |
| Kimwipes | VWR International | 34120 | |
| Sharpie Ultra Fine Point Permanent Markers, Red | Staples | 37002 | |
| Donegan DA-10 OptiVisor Headband Magnifier, 3.5x Magnification, 4" Focal Length | Amazon | DA-10, B0015IP380 | |
| 12"24/7 Packaging Hand Impulse Sealer Heat Seal Machine Poly Sealing Free Element Grip | Amazon | N/A | |
| water bath | VWR scientific | Model: 1166 | |
| BDW walk in plant growth chamber | Conviron | BDW 40 |
References
- Bennetzen, J. L., et al. Reference genome sequence of the model plant Setaria. Nat Biotechnol. 30, 555-561 (2012).
- Zhang, G., et al. Genome sequence of foxtail millet (Setaria italica) provides insights into grass evolution and biofuel potential. Nat Biotechnol. 30, 549-554 (2012).
- Li, P., Brutnell, T. P. Setaria viridis and Setaria italica, model genetic systems for the Panicoid grasses. J Exp Bot. 62, 3031-3037 (2011).
- Brutnell, T. P., et al. Setaria viridis: a model for C4 photosynthesis. Plant Cell. 22, 2537-2544 (2010).
- Doust, A. N., Kellogg, E. A., Devos, K. M., Bennetzen, J. L. Foxtail millet: a sequence-driven grass model system. Plant Physiol. 149, 137-141 (2009).
- Siles, M. M., Baltensperger, D. D., Nelson, L. A. Technique for artificial hybridization of foxtail millet [Setaria italica (L.) Beauv.]. Crop Sci. 41, 1408-1412 (2001).
- Li, H. W., Meng, C. J., Liu, T. N. Problems in the Breeding of Millet (Setaria Italica (L.) Beauv.). Agron. J. 27, 963-970 (1935).
- Willweber-Kishimoto, E. Interspecific relationships in the genus setaria. Contributions from the Biological Laboratory, Kyoto University. 14, 1-41 (1962).
- Chang, L. P. Studies on flowering and hybridization technique in Setaria. Nungyeh-hsueh Pao (Jour. Agric.) Act. Agric. Sin. 9, 68-76 (1958).
- Darmency, H., Pernes, J. Use of wild Setaria viridis (L.) Beauv. to improve triazine resistance in cultivated S. italica (L.) by hybridization. Weed Research. 25, 175-179 (1985).
- Sakai, S., Shin, C. Artificial hybridization of Setaria italica by hot water treatment. Bull. Fac. Agric. Kagoshima Univ. , 28-37 (1955).
- Malm, N. R., Rachie, K. O. Setaria millets: A review of the world literature S.B. , University of Nebraska, Lincoln. 513-529 (1971).
- Miyaji, Y., Samura, T. The influence of atmospheric humidity on flowering and pollination in Setaria italica. Bull. Fac. Agric. Kagoshima Univ. , 1-6 (1954).
- Wang, Z. M., Devos, K. M., Liu, C. J., Wang, R. Q., Gale, M. D. Construction of RFLP-based maps of foxtail millet, Setaria italica (L.). P. Beauv. Theoret. Appl. Genetics. 96, 31-36 (1998).
- RangaswamiAyyangar, G. N., Narayanan, T. R., Seshadri Sarma, P. Studies in Setaria italica (Beauv.), the Italian millet. Part I. Indian J. Agr. Sci. , 561-571 (1933).
- Heh, C. M., Mei, T. F., Yang, S. S. Anthesis of Millet, Setaria Italica (L.) Beauv. Agron. J. 29, 845-853 (1937).
- Doust, A. N., Devos, K. M., Gadberry, M. D., Gale, M. D., Kellogg, E. A. The genetic basis for inflorescence variation between foxtail and green millet (poaceae). Genetics. 169, 1659-1672 (2005).
