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Biology

双分子荧光互补流式细胞仪分析:高通量的定量方法研究蛋白质 - 蛋白质相互作用

doi: 10.3791/50529 Published: August 15, 2013

Summary

流式细胞仪分析双分子荧光互补提供了一种高通量定量研究蛋白质相互作用的方法。此方法可用于测绘的蛋白结合位点,并用于筛选调节蛋白 - 蛋白相互作用的因素。

Abstract

其中的方法来研究细胞内蛋白质相互作用,双分子荧光互补(附设)是相对简单和敏感。附设是根据生产的荧光使用两个非荧光的荧光蛋白的片段(金星,黄色荧光蛋白的变型中,这里使用的是)。非荧光金星片段的(VN和VC)的两个相互作用的蛋白质(在这种情况下,AKAP-LBC和PDE4D3)稠合,得到的荧光由于VN-AKAP-LBC-VC-的PDE4D3相互作用和形成荧光蛋白的功能细胞内。

附设提供的蛋白质复合物的亚细胞定位和蛋白质相互作用的强度,根据荧光强度的信息。但是,附设分析用显微镜量化蛋白 - 蛋白相互作用的强度是耗时且有些主观的,因为蛋白表达的异质性和相互作用。通过耦合流式细胞仪分析与附设的方法,荧光附设的蛋白 - 蛋白相互作用的信号可以精确地测量在短时间内大量的细胞。在这里,我们展示了这种方法的应用程序AKAP-LBC的互动所需要的地区PDE4D3映射。这种高的通过方法可以应用于筛选因子,调节蛋白 - 蛋白相互作用。

Introduction

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650000蛋白质-蛋白质相互作用,估计存在于人类的相互作用组,发挥着重要的角色,在维持正常的细胞功能1,2。除了 ​​免疫共沉淀(CO-IP)的黄金标准蛋白质相互作用研究从细胞裂解物,一些蛋白质片段互补分析(PCA)已发展到提高灵敏度检测细胞内的蛋白质相互作用3。这些技术包括福斯特共振能量转移(FRET),生物发光共振能量转移(BRET),和双分子荧光互补(附设)4,5。附设是基于荧光蛋白的两个片段(在这里我们使用金星,YFP变种),分别融合到一个潜在的相互作用的蛋白伙伴(在本示例中,我们使用AKAP - LBC和PDE4D3)促进协会。相互作用的两种蛋白质在细胞内的查询结果以功能性荧光的兴趣,它可以是由f可视化luorescence显微镜可以使用活的或固定的细胞6,7,8。相较于其他的PCA,附设敏感的和技术上的挑战,有潜力在活细胞中的细胞定位研究。然而,这种技术的主要缺点是,一旦形成,荧光蛋白复合物不能被逆转。因此,它是不是一个很好的方法来研究动态蛋白质相互作用。在本文中,我们使用附设映射AKAP - LBC PDE4D3的相互作用位点监测的荧光强度金星。相比传统的分析,使用荧光显微镜,这是费时和劳动密集的(如果不进行使用自动化高通过机械),流式细胞术十万个单元格在一个异构的人口提供了一个简单的定量分析,在很短的时间9, 10。在这里,我们开展了流式细胞附设分析和传统的合作IP并排侧比较,表明2米然而,ethods提供可比数据的流式细胞仪附设分析耗时少,并使用更少的材料是有限的感兴趣的细胞时,这可能是更有用的。

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Protocol

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1。细胞转染

  1. 板细胞转染前一天,电镀免疫细胞较少。
    1. 的免疫:在6孔的板,涂层的玻璃盖玻片(1)用0.02%的明胶在37℃下至少4小时,洗一次的介质,并为每个反应孔,板1×10 5 HEK 293T细胞在2毫升的完整的​​生长培养基[Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中加10%FBS]。
    2. 对于流式细胞术和Western blot分析:板1.2×10 5 HEK 293T细胞/孔,在2毫升完全培养基的6孔板(0.3×10 5的HEK 293T细胞在0.5ml完全培养基的24孔板中,每孔)。
  2. 准备用于转染的DNA,根据制造商的协议:Effectene(Qiagen公司)用于免疫荧光。中转-LT1(Mirus公司)用于流式细胞仪和Western blot分析。下面列出了所使用的DNA量。
    24孔培养板(纳克) 6孔板(纳克)
    CFP矢量 10 50
    VN N-AKAP - LBC 200 1000
    VC的N-PDE4D3-FL(PDE4D3全长) 2.5,5,10,20,40,80 100
    VC N-PDE4D3 UCR1(PDE4D3含有UCR1域的N-末端片段) 100
    VC N-PDE4D3 UCR2 + CAT(PDE4D3 UCR2和催化结构域的C-末端片段) 100
    转用(6)Effectene:
    1. 添加指示的质粒DNA量+ 4微升增强到100微升缓冲EC,混合,在室温下孵育5分钟。
    2. 添加5微升Effectene,混合,和孵育10分钟室温。添加逐滴细胞。
    转公交LT1(6-well/24-well):
    1. 指定量的质粒DNA加入到250μl/50微升的Opti-MEM I的无血清培养基的无菌管中。
    2. 添加过境-LT1试剂的稀释的DNA混合物和吸管轻轻混合。 (过境LT1试剂:DNA比例是3微升过境LT1试剂的每1微克DNA)。
    3. 在室温下孵育30分钟,并逐滴加入细胞。

2。流式细胞仪,免疫印迹,免疫细胞制备方法

  1. 染后24小时,检查前收获细胞荧光落射荧光显微镜下。
  2. 流式细胞仪分析细胞的准备:
    1. 用0.5毫升/ 2毫升为24-well/6-well板冰冷的PBS洗涤细胞。
    2. 使用50μl/250微升0.05%胰蛋白酶分离细胞。
    3. 用200μl/ 1毫升的DMEM培养基中和胰蛋白酶。
    4. 合作250微升细胞llect(24孔和6孔板),在500×g离心5分钟,通过离心分离,用Western印迹分析的其它细胞(1毫升)。
    5. 细胞重悬于250微升FACS缓冲[PBS + 0.5%(W / V)BSA + 2毫米EDTA],储存在冰流式细胞仪分析。细胞也可以固定在1%多聚甲醛(在PBS中),不会立即生效,如果流式细胞分析。
  3. 平行进行的Western印迹分析的细胞制备方法:用流式细胞仪分析细胞制备方法。
    1. 用2ml冰冷的PBS 1X洗涤细胞,裂解细胞,加入100μl的细胞裂解缓冲液[10mM磷酸钠缓冲液,pH值为6.95,150 mM氯化钠,5mM的EDTA,5mM的EGTA,1%的Triton X-100] 。
    2. 通过离心收集细胞裂解液在4℃下以21,000×g的10分钟
    3. 量化Bradford蛋白检测蛋白浓度,装入等量的每通道蛋白SDS-PAGE,并转​​移到硝酸纤维素免疫。
    4. 免疫细胞制备。
      1. 用2ml PBS冲洗细胞3次,在1毫升的3.7%多聚甲醛(在PBS中)在室温下10分钟固定细胞,然后用2毫升的PBS洗涤3次,持续5分钟。
      2. 挂载,盖玻片载玻片上,用安装介质。如果需要使用指甲油密封盖玻片边缘。
      3. 将在4℃检查前的幻灯片。

    3。流式细胞仪和免疫荧光显微镜

    1. 使用的Beckman Coulter公司青色ADP,装有488纳米,405纳米,642纳米的固态激光器的流式细胞术进行。峰会软件用于采集和分析。
      1. 校准流式细胞仪使用标准的珠子。
      2. 剧情前向散射(FSC)/侧向散射(SSC)的线性浇注活细胞人口规模。
      3. 剧情FSC /电压脉冲宽度选通非聚合活细胞群体。
      4. 剧情count/FL6(CFP fluorescencE,405 nm)的非聚集现场浇注CFP阳性细胞对数刻度。
      5. 的的剧情count/FL1(YFP的荧光,488 nm)的对数刻度附设强度。
      6. 运行YFP-CFP-双阴性样品,调整FSC,SSC,FL1和FL6光电倍增管(PMT)电压来设置每个信号的阈值。
      7. 跑单阳性(两个YFP +和CFP +)样品未来离线补偿
      8. 获得至少10,000门事件(非聚合现场CFP +细胞)进行分析。
    2. 免疫荧光显微镜使用蔡司​​LSM 510共聚焦显微镜注:重要的是要保持所有的设置(如变焦,针孔探测器的增益,放大器的失调,帧大小,扫描速度快,扫描平均,和激光功率)之间的一致样品进行适当比较的所有数据。

    4。数据分析(使用首脑软件执行)

    1. 设置分析本收类似协议正确的门控离子:
      1号门FSC / SSC点图活细胞。
      2号门在FSC /脉冲宽度1号门非聚合活细胞中。
      3号门,3号门计数/ CFP非聚合CFP +活细胞。
    2. 补偿YFP和CFP信号的使用YFP +和CFP +单阳性细胞。
    3. 重新确定切断线CFP / YFP的阳性细胞。
    4. 进出口YFP的平均荧光强度(MFI)CFP +细胞到Excel的数据绘制。
    5. 标准化YFP MFI AKAP - LBC,PDE4D3表达水平,并装载控制α-微管蛋白,Western blot检测。

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Representative Results

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AKAP-LBC和PDE4D3的结构( 图1B)的融合VN和VC片段,分别AKAP - LBC和PDE4D3结果功能YFP的荧光( 图1A)的相互作用。在这里,我们使用地图AKAP - LBC结合位点PDE4D3附设的方法。 PDE4家族蛋白中上游保守区域1(UCR1),,上游保守区域2(UCR2)和催化区(CAT)是保守的,因此,全长度(FL),UCR1和UCR2加CAT被用于筛选结合部位的PDE4D3 AKAP-LBC。 VN-AKAP-LBC和VC-PDE4D3片段在HEK 293T细胞荧光结果的表达,用不同的强度( 图1C)。附设表明UCR1和UCR2 + CAT向AKAP-LBC PDE4D3的相互作用。更大的荧光强度造成AKAP - LBC-UCR1互动,AKAP - LBC-UCR2 + CAT相比,表明PDE-UCR1结合AKAP-LBC优于PDE-UCR2 + CAT。

图2A),细胞聚集体被排除通过使用SSC与脉冲宽度双点( 图2B),从分析中排除。附设信号或单独CFP表达细胞üsed来确定补偿,切断细胞无荧光( 图2C-2F)。 CFP矢量附设构造的CFP的表达被用来作为一个正标记,以指示已成功转染,共转染。只有CFP +细胞用测量附设荧光。 PDE4D3的增加量的转染导致增加金星(YFP)附设信号( 图3A)中,,而CFP信号保持不变( 图3B)。通过Western blot证实VN-AKAP LBC和越来越多的VC-PDE4D3表达( 图3C)。总体而言,PDE的表达增加导致PDE的表达水平( 图3D)附设荧光关联的线性增加。这些结果证实了使用流式细胞仪定量测定的平均荧光强度(MFI)的附设AKAP LBC-PDE4D3交互。因此,我们用这种方法地图AKAP LBC结合位点内PDE4D3使用:VN-AKAP-LBC和VC-PDE4D3结构的。 VN AKAP - LBC和VC的PDE4D3 UCR2表达图1C,与我们的观察+ CAT附设信号较低时相比,VC-PDE4D3-FL和VC-PDE4D3 UCR1( 图4B)。相似的蛋白质的表达,观察在所有的流量样本( 图4C),并进行归一化的平均荧光AKAP-LBC,PDE4D3,α-微管蛋白的相对表达水平。因此,归附设MFI表示AKAP - LBC-PDE4D3-FL和AKAP - LBC-PDE4D3 UCR1之间的荧光强度没有任何区别,但低得多的信号AKAP-LBC-PDE4D3 UCR2 + CAT互动( 图4A )。这些结果表明,有PDE4D3 AKAP-LBC与多个区域,和PDE4D3-UCR1 AKAP-LBC与相互作用的主要区域。这个结果也证实了合作的IP,蛋白质相互作用的金标准( 图5)。

图1
图1。附设分析AKAP - LBC-PDE4D3片段相互作用的荧光显微镜。一)示意图代表双分子荧光互补(附设)。金星片段; VN和VC分别融合AKAP - LBC和PDE4D3。 AKAP - LBC-PDE4D3的YFP荧光功能相互作用的结果。代表附设B)用于映射PDE4D3结构示意图C)信号转染HEK 293T细胞。细胞共转染VN AKAP - LBC和VC的PDE4D3结构(FL,UCR1,UCR2 + CAT)附设分析。 CFP载体共转染转染标记。转染后24小时,将细胞固定成像。附设信号显示在绿色和CFP所示的伪彩色红,在合并后的数字。 9/50529fig1large.jpg“目标=”_blank“>点击这里查看大图。

图2
图2。门和赔偿流式细胞仪分析测定。 A)FSC与SSC点情节门活细胞和排除碎片和死细胞。B)侧分散与脉冲宽度点情节门单细胞和排除聚集。Ç)细胞表达CFP(CFP +细胞)之前的补偿。ð )细胞表达CFP(CFP +细胞)后YFP的补偿。的明暗截止线与YFP的表达的细胞被重新确定。E)用:附设的信号(YFP +细胞)的细胞才补偿,F)与CFP补偿之后:附设的信号(YFP +细胞)的细胞。为与CFP表达细胞截止线被重新确定。目标=“_blank”>点击这里查看大图。

图3
图3。 AKAP - LBC-的PDE4D3互动附设流式细胞仪通过改变PDE4D3表达量的分析。 A)增加了越来越多的VC-PDE4D3附设CFP +细胞内的信号转。细胞转染与CFP(10毫微克),VN-AKAP 200纳克(LBC)和越来越多的VC-PDE4D3(2.5毫微克至80毫微克)。控和非聚集CFP +活细胞YFP荧光YFP与正向散射双点图所示。 YFP +细胞显示为绿色。有代表性的数据显示5毫微克,20毫微克和80毫微克VC-PDE4D3 B)CFP在活细胞中的荧光显示为CFP与前向散射双点情节,在所有样品中的荧光指示一致CFP C)Western blot分析证明增加PDE4D3表达AKAP - LBC和α-微管蛋白(作为装载控制)n和一致的表达。D)金星(YFP)平均荧光强度(MFI),CFP +,细胞与VC-PDE4D3表达。 YFP MFI两折的变化CFP +细胞绘制随着CFP的MFI倍变化非聚合活细胞。相对表达水平也绘制图像J Western blot检测分析由VC-PDE4D3 点击这里查看大图

图4
图4。附设PDE4D3-FL,PDE4D3 PDE4D3 UCR1,UCR2 + CAT用流式细胞仪的AKAP LBC互动分析。 A)AKAP - LBC-PDE4D3片段相互作用进行量化金星-MFI归蛋白表达(AKAP - LBC,PDE4D3碎片和装载控制α-微管蛋白)。 ð附设信号。差分单程方差分析(ANOVA)检验P值<0.01被认为是非常显着(**),而AP值> 0.05被认为是不显着(NS)B)代表附设信号转染HEK 293T细胞。共转染HEK 293T细胞与CFP,VN-的AKAP LBC和VC-PDE4D3结构(-FL-UCR1,-UCR2 + CAT)。非聚集现场CFP +细胞门,其附设的荧光YFP与正向散射双点图所示。C)AKAP - LBC和的PDE4D3-片段的比较表达Western blot检测表明。 点击这里查看大图

图5
图5。流式细胞仪分析确认通过免疫共沉淀。HEK 293T细胞共转染表达的V5 AKAP - LBC和GFP的PDE4D3结构(FL,UCR1,UCR2 + CAT)。转染后48小时,AKAP-LBC使用V5-琼脂糖珠进行免疫沉淀。结合PDE4D3-FL,UCR1和UCR2 + CAT SDS-PAGE和Western blot检测使用抗GFP主要抗体。相应的PDE4D3输入用于免疫沉淀也显示,表示类似的表达PDE4D3片段。

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Discussion

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附设一个简单而敏感的方法来研究蛋白质相互作用。然而,此方法可以不被使用,以确定新的蛋白质 - 蛋白质相互作用,它是特别方便的,以确认细胞内的蛋白 - 蛋白相互作用和学习功能性质,如细胞内的本地化的蛋白质复合物,蛋白质 - 蛋白质相互作用的网站的映射,并筛查,可以调节蛋白质相互作用的小分子/肽。 ,因为VN和VC片段的非荧光,荧光背景低,从而帮助检测灵敏度。需要时间来成熟/稳定VN-蛋白-VC-蛋白质相互作用,从而延迟可视化蛋白质相互作用,并因此可能凭经验确定最佳的时间点。还应当指出的是,VN-蛋白质-VC-蛋白质相互作用是不可逆的,因此,不幸的是,与目前的金星附设构造,该法是不适合吨Ø研究动态蛋白质 - 蛋白质相互作用动力学。

附设分析适当的控制是非常重要的。一个合适的阴性对照包括非相互作用的蛋白质,或在相关的附设矢量的非特异性肽,或者如果可能的话,会破坏的突变体蛋白 - 蛋白相互作用。空附设载体是不是一个很好的控制,因为它会导致非特异性高背景荧光。如果附设中没有观察到两个相互作用的蛋白质,表达进行分析。此外,附设信号可能取决于蛋白质 - 蛋白质相互作用位点。应当指出的是,也可能会影响的VN和VC相互作用的空间调制的荧光强度,因此,它最初是重要的进行附设实验中使用的C-末端和N-末端VN / VC表达构建。例如,可能不会发生附设如果蛋白质相互作用块重新关联金星片段。因此,VN和VC的多个组合的构建应该D是测试( C和N端融合蛋白)。

附设的荧光强度的蛋白 - 蛋白相互作用的强度成正比,具有较高的强度附设表示更强的相互作用和低级提示的相互作用较弱的荧光强度。因此,作为附设MFI指标蛋白质相互作用。有关蛋白质相互作用附设的精确分析,它是非常重要的Western blot分析执行,以确保平等表达不同的结构,没有蛋白质发生降解,这可能会干扰正确的分析。因此,优选从相同的样品裂解液进行Western印迹分析,分析的所有样本来确定相似的蛋白的表达。此外,它是重要的,以确定合适的质粒转染量,以确保线性的表达和蛋白质的相互作用,此范围之内,蛋白质的相互作用相关联的Wi次附设信号的荧光强度。

低的数量的CFP资格质粒的作为一个标记为成功的转染这里所以只CFP阳性细胞进行分析。可以使用一种不同的荧光蛋白,如RFP,以尽量减少泄放通过颜色11。流式细胞仪,单阳性细胞被列入赔偿。如果可能的话,至少为10,000的CFP阳性细胞进行计数,以确保良好的样本大小。

总之,在这里,我们表明,耦合的附设的方法与流式细胞仪分析,可以作为细胞内蛋白质相互作用的一个很好的指标。附设传统的分析,免疫荧光显微镜是耗时的,样本大小是比相应的低得多,以流式细胞仪分析。因此,耦合附设流式细胞仪分析蛋白质 - 蛋白质相互作用可能是有利的,当转染效率低。在这种报告中,我们趁着附设流式细胞仪映射的互动网站PDE4D3结合AKAP-LBC。这种技术也可以被扩展到屏幕可能会破坏或增强蛋白-蛋白相互作用,为药物发现12的分子或肽。此方法也可用于研究某些生理事件,如配体诱导的G蛋白偶联受体的内在化13。

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Disclosures

作者宣称,他们有没有竞争经济利益。

Acknowledgments

我们感谢奥布赖恩在UIC实验室关键的实验评价和讨论。这项工作是由美国心脏协会授予11SDG5230003威乐和国家推进转化科学中心 - UIC批准UL1TR000050临床和转化科学中心。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Dulbecco’s modified Eagle’s media (DMEM) Invitrogen 11965-092
Penicilin-Streptomycin (pen/strep), 100x Invitrogen 15070-063
Fetal Bovine Serum (FBS) Invitrogen 16000-044
Anti-Flag antibody Sigma M2, F1804
Anti-HA antibody Covance 16B12, MMS-101R
α-tubulin Sigma DM1A, T9026
Anti-GFP antibody Clontech 632569
Cell culture plates, 6-well tissue culture treated Thermo Fisher Scientific 130184
HEK 293T cells ATCC CRL-11268
Maxiprep plasmid purification kit, high speed Qiagen 12663
Dulbecco’s Phosphate-buffered saline (DPBS), sterile 1x Invitrogen 14190-144
Trypsin-EDTA, 0.05% (w/v) Gibco 25300
Polystyrene round-bottom tubes for FACS staining BD Biosciences 352052
Paraformaldehyde Fisher Scientific S74337MF
Prolong gold antifade reagent with DAPI Invitrogen P-36931
Superfrost plus Microscope slides Fisher Scientific 12-550-15
Fisherfinest premium cover glass Fisher Scientific 12-548-5P
EQUIPMENT
CO2 air-jacketed Incubator NuAIR DH autoflow
Confocal microscope LSM510 META Carl Zeiss, Inc
Electrophoresis and transfer unit Biorad
Cyan ADP Flow Cytometer Beckman Coulter

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References

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双分子荧光互补流式细胞仪分析:高通量的定量方法研究蛋白质 - 蛋白质相互作用
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Cite this Article

Wang, L., Carnegie, G. K. Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction. J. Vis. Exp. (78), e50529, doi:10.3791/50529 (2013).More

Wang, L., Carnegie, G. K. Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction. J. Vis. Exp. (78), e50529, doi:10.3791/50529 (2013).

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