Summary
二分子蛍光相補のフローサイトメトリー分析は、タンパク質 - タンパク質相互作用を研究するためのハイスループット定量方法を提供するものである。この方法は、マッピング·タンパク質結合部位およびタンパク質 - タンパク質相互作用を調節する因子をスクリーニングするために適用することができる。
Abstract
細胞内のタンパク質 - タンパク質相互作用を研究するための方法のうち、二分子蛍光相補（BIFC）は比較的簡単と小文字が区別されます。 BIFCは、蛍光タンパク質の二非蛍光フラグメント（金星、黄色蛍光タンパク質の変異体は、ここで使用されている）を使用した蛍光の生産に基づいている。非蛍光金星断片（VNとVC）が原因でVN-AKAP-LBC-VC-PDE4D3相互作用と機能的蛍光タンパク質の形成に蛍光降伏、2相互作用するタンパク質（この場合は、AKAP-LBC及びPDE4D3）に融合されている細胞内。
BIFCは、タンパク質複合体の細胞内局在と蛍光強度に基づいてタンパク質相互作用の強さについての情報を提供します。しかしながら、タンパク質 - タンパク質相互作用の強さを定量化するために顕微鏡を用いBIFC解析には時間がかかり、タンパク質発現と相互作用における不均一性に起因幾分主観的である。フローサイトメトリーを結合することによってBIFC方法論分析は、蛍光BIFCタンパク質 - タンパク質相互作用信号は、正確に短時間で細胞の大量のために測定することができる。ここでは、AKAP-LBCとの相互作用に必要とされるPDE4D3でマップ地域にこの方法論の適用を実証する。このハイスループット法は、タンパク質 - タンパク質相互作用を調節する因子のスクリーニングに適用することができる。
Introduction
65万タンパク質-タンパク質相互作用は、正常な細胞機能1,2を維持するために重要な役割を果たし、ヒトインタラクに存在することが推定される。他にも共免疫沈降（共IP）、細胞溶解物からのタンパク質-タンパク質相互作用を研究するための金本位、いくつかのタンパク質断片相補アッセイ（PCA）は、セル3の内部タンパク質-タンパク質相互作用の検出感度を向上させるために開発されてきた。技術はフェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）、生物発光共鳴エネルギー移動（BRET）、および二分子蛍光相補（BIFC）4,5が含まれています。それぞれの潜在的な相互作用タンパク質パートナー（この例では、我々はAKAP-LBC及びPDE4D3を使用してください）に融合されています。BIFCは蛍光タンパク質（YFP変異体ここでは金星を使用します）の二つの断片の促進協会に基づいています。 fで可視化することができる機能的な蛍光の細胞結果内部の関心の二つのタンパク質の相互作用ライブまたは固定された細胞の6,7,8を使用luorescence顕微鏡。他のPCAに比べ、BIFCは、生きた細胞で細胞内局在を検討する可能性のある、高感度かつ少ない技術的に困難である。この技術の主な欠点は、しかしながら、一度形成された蛍光タンパク質複合体が逆転することができないことである。したがって、動的なタンパク質 - タンパク質相互作用を研究するための優れた方法ではない。本稿では、金星の蛍光強度をモニターすることによってAKAP-LBCでPDE4D3の相互作用部位をマッピングするBIFC使用。 （自動ハイスループット機械を用いて行われていない場合）、時間がかかり、労働集約的である蛍光顕微鏡を用いた従来の分析と比較して、フローサイトメトリーは、短時間9上で不均一な集団における細胞の数千の簡単な定量的な分析を提供10。ここで、フローサイトメトリー分析 - BIFCおよび共IP伝統的なサイドバイサイドの比較を行うことにより、我々は、2メートル示すethodsは、比較可能なデータを提供するが、フローサイトメトリー分析は、BIFC少ない時間がかかり、目的の細胞に限られている場合に、より有用であり得る少ない材料を使用する。
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Protocol
1。細胞トランスフェクション
- プレート細胞トランスフェクションの前日に、免疫のために少数の細胞をプレーティングする。
- 免疫蛍光の場合：6ウェルプレート、コートガラスカバースリップ（1ウェルあたり）少なくとも4時間、37℃で0.02％ゼラチンで、培地で1回洗浄し、各ウェルのために、プレート1×10 5 HEK 293T 2ミリリットル完全増殖培地中の細胞[ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を加えた10％FBS]。
- 6ウェルプレート（0.3×10 5 HEK 293T細胞を、24ウェルプレートのウェルあたり0.5ミリリットル完全増殖培地中で2ミリリットル完全増殖培地中でウェルプレート1.2×10 5 HEK 293T細胞/：フローサイトメトリーおよびウェスタンブロット分析のために）。
- 製造業者のプロトコールに従ってトランスフェクションのためにDNAを準備のEffectene（キアゲン）を免疫するために使用されます。通過LT1（MIRUS）をフローサイトメトリーおよびウェスタンブロット分析のために使用される。使用されるDNAの量を以下に示す。
トランスフェクションのEffectene（6ウェル）を用いた。24ウェルプレート（NG） 6ウェルプレート（ngの） CFP-ベクトル 10 50 VN N-AKAP-LBC 200 1000年 VC N-PDE4D3-FL（フルレングスPDE4D3） 2.5、5、10、20、40、80 100 VC N-PDE4D3-UCR1（UCR1ドメインを含むPDE4D3 N末端 断片） 100 VC N-PDE4D3-UCR2 + CAT（UCR2と触媒ドメインを含むPDE4D3 C末端断片） 100 - プラスミドDNAの指示された量+ 100μlのBuffer EC〜4μlのエンハンサー、ミックスを追加し、室温で5分間インキュベートする。
- 5μLのEffectene、ミックスを追加し、10分でインキュベート室温。細胞に滴下追加。
- 滅菌チューブ内のOpti-MEM I無血清培地の250μl/50μlにプラスミドDNAの指示量を追加します。
- 穏やかに混合するために希釈したDNA混合物およびピペットに移行-LT1試薬を追加します。 （TRANSIT-LT1試薬：DNA比はDNA1μgの当たりTRANSIT-LT1試薬3μlのです）。
- 室温で30分間インキュベートし、細胞に滴下加える。
2。フローサイトメトリー、ウェスタンブロットや免疫細胞のための準備
- 24時間トランスフェクション後、細胞を採取する前に、落射蛍光顕微鏡下で蛍光を確認してください。
- フローサイトメトリー解析のための細胞調製：
- 24-well/6-wellプレートは0.5ミリリットル/ 2ミリリットル氷冷PBSで細胞を洗浄します。
- 50μl/250μlの0.05％トリプシンを用いて細胞を切り離し。
- 200μL/ 1ミリリットルDMEM培地でトリプシンを中和。
- 共同5分間500×gで遠心分離によってllect250μlの細胞（両方とも、24ウェルおよび6ウェルプレートの場合）、ウェスタンブロット分析のために残っている細胞（1ml）を使用する。
- フローサイトメトリー分析のための氷の上で250μlのFACSバッファー[PBS + 0.5％（w / v）のBSA + 2mMのEDTA]、店舗で再懸濁した細胞。フローサイトメトリー分析が即時ならない場合細胞もまた（PBS中）を1％ホルムアルデヒド中で固定することができる。
- ウェスタンブロット分析のための細胞調製する：フローサイトメトリー分析のための細胞調製物を並行して行う。
- 2 mlの氷冷PBSで1×細胞を洗浄、細胞溶解緩衝液[10mMリン酸ナトリウムバッファー、pH 6.95、150mMのNaCl、5mMのEDTA、5mMのEGTA、1％トリトンX-100]の100μLを添加して細胞を溶解する。
- 4℃で21,000×gで10分間遠心分離によって細胞溶解物を収集℃で
- 、ブラッドフォードタンパク質アッセイによりタンパク質濃度を定量、SDS-PAGE用レーンあたり等量のタンパク質をロードし、イムノ用ニトロセルロースに移す。
- 免疫用細胞調製。
- 2ミリリットルPBSで3倍の細胞を洗浄し、室温で10分間、3.7％パラホルムアルデヒド（PBS中）1mlに細胞を固定し、その後5分間2ミリリットルPBSで3回洗浄する。
- 封入剤を使用して、スライドガラス上にスリップをカバーマウント。必要に応じて、マニキュアを使用してカバースリップの端をシールします。
- 4でスライドを保管°C検査の前に。
3。フローサイトメトリーおよび免疫蛍光顕微鏡
- フローサイトメトリーは488nmで、波長405nm、及び642 nmの固体レーザーを備えたベックマン·コールター（シアン）ADPを使用して行われる。サミットソフトウェアは、取得および分析のために使用されている。
- 標準ビーズを用いたフローサイトメーターのキャリブレーションを行います。
- ゲー生細胞集団のためのリニアスケールでプロット前方散乱（FSC）/脇散乱（SSC）。
- ゲー非集約生細胞集団のためにプロット電圧/ FSCパルス幅。
- プロットcount/FL6（CFP fluorescencゲー非集約ライブCFP-陽性細胞のログスケールでE、405 nm）を。
- BIFC強度のログスケールでプロットcount/FL1（YFP蛍光488 nm）を。
- FSC、SSC、FL1とFL6光電子増倍管（PMT）各信号のしきい値を設定するには、電圧を調整、YFP-CFP-ダブルネガティブサンプルを実行します。
- 将来オフライン補償単一の正（両方YFP +とCFP +）サンプルを実行する
- 分析のために少なくとも10,000ゲーテッドイベント（非集約ライブCFP +細胞）を取得。
- 免疫蛍光顕微鏡ツァイスLSM 510共焦点顕微鏡を用いて行われる注：それは間のすべての設定（ズーム等、ピンホール、検出器利得は、増幅器のオフセット、フレームサイズ、走査速度、走査平均値、およびレーザパワー）一貫性を保つために重要であるすべてのデータの適切な比較のためのサンプル。
4。データ解析（サミット·ソフトウェアを使用して実行）
- acquisitと同様の分析プロトコルを設定する適切なゲーティングのイオン：
生きた細胞のためのFSC / SSCドットプロットにゲート1。
非集約生細胞のゲート1のFSC /パルス幅でゲート2。
非集約CFP +生細胞のゲート3のカウント/ CFPでゲート3。 - YFP +とCFP +シングルポジティブ細胞を用いYFPとCFP信号を補償します。
- CFP / YFP陽性細胞に再決定するカットオフのライン。
- エクスポートYFPはCFPの蛍光強度（MFI）+データプロットするためのExcelへの細胞を意味する。
- AKAP-LBC、PDE4D3の発現レベルにYFP MFIを正規化し、ウェスタンブロットによって決定されるように、α-チューブリン制御を読み込む。
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Representative Results
AKAP-LBCとPDE4D3構築物（ 図1B）はそれぞれ、VNおよびVC断片と融合させた。 AKAP-LBCと機能YFP蛍光（ 図1A）でPDE4D3結果の相互作用。ここでは、PDE4D3でAKAP-LBC-結合部位をマッピングするBIFCメソッドを使用します。上流に保存された領域1（UCR1）、上流の保存された領域2（UCR2）と触媒領域（CAT）PDE4D3の結合部位をスクリーニングするために使用されたため、完全長（FL）、UCR1とUCR2プラスCAT、PDE4ファミリータンパク質間で保存されているAKAP-LBCへ。 VN-AKAP-LBC及びVC-PDE4D3フラグメント異なる強度（ 図1C）と蛍光のHEK 293T細胞の結果での発現。 BIFCはUCR1とUCR2両方+ CAT AKAP-LBCでPDE4D3の相互作用に寄与することを示しています。 AKAP-LBC-UCR1相互作用から生じる大きな蛍光強度は、AKAP-LBC-UCR2 + CATと比較した場合、PDE-UCR1はPDE-UCR2 + CATより良いAKAP-LBCに結合することを示しています。
図2A）、および細胞凝集体SSC対パルス幅二点（ 図2B）を使用して除外されたを用いて分析から除外した。独りBIFC信号またはCFP式を持つ細胞は、uだったSEDは、補償を決定し、蛍光（ 図2C-2F）せずにセルにカットオフする。 CFPベクトルはBIFC構築物およびCFP発現がトランスフェクションの成功を示すために、正のマーカーとして使用したと共トランスフェクトした。のみCFP +細胞をBIFC蛍光の測定に使用した。 CFP信号（ 図3B）横ばいながらPDE4D3の増加量のトランスフェクションは、増加した金星（YFP）BIFC信号（ 図3A）となりました。 VN-AKAP-LBCの発現およびVC-PDE4D3の増加量はウェスタンブロット（ 図3C）によって確認した。全体的に、PDEの発現レベル（ 図3D）に相関BIFC蛍光の直線的な増加をもたらしたPDEの発現を増加させた。これらの結果は、BIFCの平均蛍光強度（MFI）を測定することによりAKAP-LBC-PDE4D3の相互作用を定量化するためのフローサイトメトリーの使用を検証。そこでPDE4D内マップAKAP-LBC結合部位には、この方法論を使用3 VN-AKAP-LBC及びVC-PDE4D3コンストラクトを使用。 VC-PDE4D3-FLおよびVC-PDE4D3-UCR1（ 図4B）と比較した場合、 図1Cに我々の観察と一致して、VN-AKAP-LBC及びVC-PDE4D3-UCR2の発現+ CATは、低BIFC信号をもたらした。類似のタンパク質発現はすべてのフローのサンプルで観察（ 図4C）と蛍光が相対発現AKAP-LBCのレベル、PDE4D3、α-チューブリンに正規化されたことを意味しました。したがって、正規BIFC MFIはAKAP-LBC-PDE4D3-FLとAKAP-LBC-PDE4D3-UCR1間の蛍光強度の差がないことを示していますが、AKAP-LBC-PDE4D3-UCR2 + CAT相互作用（ 図4Aのためにはるかに低い信号）。これらの結果は、AKAP-LBCと対話PDE4D3で複数の領域が存在することを示唆している、とPDE4D3-UCR1はAKAP-LBCとの相互作用の主要な領域である。この結果は、タンパク質-タンパク質相互作用のためのゴールドスタンダード（ 図5）、共IPにより確認した。
図1。免疫蛍光顕微鏡によるAKAP-LBC-PDE4D3-フラグメントの相互作用のBIFC分析。二分子蛍光相補（BIFC）のA）は概略代表。金星フラグメント; VNとVCは、それぞれAKAP-LBC及びPDE4D3に融合されています。機能YFP蛍光のAKAP-LBC-PDE4D3インタラクション結果。マッピングに使用PDE4D3コンストラクトB）模式図。トランスフェHEK 293T細胞のC）代表BIFC信号。細胞は、VN-AKAP-LBC及びBIFC解析用VC-PDE4D3コンストラクト（-FL、-UCR1、-UCR2 + CAT）で同時トランスフェクトした。 CFP-ベクターはまた、トランスフェクションマーカーとして同時トランスフェクトした。 24時間トランスフェクション後、細胞は、イメージングのために修正されました。 BIFC信号は緑色で示されており、CFPは、マージされた図面で擬似カラー赤で示されています。 9/50529fig1large.jpg "ターゲット=" _blank ">より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください。
図2。ゲートとFACS分析のための補償の決定。 A）ゲート生細胞へのFSC対SSCドットプロットと破片や死細胞を除外する。ゲート単一細胞にB）側方散乱対パルス幅ドットプロットおよび集計を除外する。C）は細胞が補償前CFPを（CFP +細胞）を発現する。Dは YFP補償した後、CFP（CFP +細胞）を発現する）細胞。 YFP発現を有する細胞のカットオフのラインが再決定された。E）補償前BIFC信号（YFP +細胞）を持つ細胞。F）細胞BIFC信号（YFP +細胞）とCFP補償後。 CFP発現を有する細胞のためのカットオフラインを再決定した。ターゲット= "_blank">より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください。
図3。 PDE4D3の発現量を変化させることによってBIFC、フローサイトメトリーを用いAKAP-LBC-PDE4D3相互作用を分析する。 ）VC-PDE4D3の増加量でトランスフェクションCFP +細胞内BIFC信号を増加させました。細胞は、CFP（10ngの）、VN-AKAP-LBC（200 ngの）およびVC-PDE4D3の増加量（80ngの〜2.5 ngの）トランスフェクションした。非集約CFP +生きている細胞は、ゲーティングとYFP蛍光がフォワードYFP対散布ダブルドットプロットとして表示されていた。 YFP +細胞は、緑色で表示されます。実証5 ngの、20 ngの、80 ngのVC-PDE4D3からの代表的なデータは。B）生細胞におけるCFPの蛍光は全てのサンプルの間で一貫したCFPの蛍光を示す、CFP対前方散乱ダブルドットプロットとして表示され表示されます。C）はウエスタンブロット分析増加PDE4D3 expressioN AKAP-LBC及びα-チューブリン（ローディングコントロールとして使用される）の一貫した表現で。D）ヴィーナス（YFP）がCFP +細胞の蛍光強度（MFI）を平均VC-PDE4D3発現と相関している。 CFP +細胞からYFP MFI両方の倍の変化は、非集約生細胞からCFP MFI倍の変化と一緒にプロットされます。ウェスタンブロットの画像J分析により決定VC-PDE4D3の相対発現レベルもプロットされています。 大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。
図4。 PDE4D3-FL、PDE4D3-UCR1、PDE4D3-UCR2 + CATは、フローサイトメトリーを用いたAKAP-LBC相互作用のBIFC分析。 A）AKAP-LBC-PDE4D3フラグメント間相互作用は、タンパク質発現（AKAP-LBC、PDE4D3断片とロードコントロールα-チューブリン）に正規化された金星-MFIにより定量した。 DBIFC信号内ifferenceは分散の一方向分析（ANOVA）のp値が0.05（ns）で有意ではないと考えられている<AP値は間0.01（**）が非常に重要と考えられている>ので調べた。トランスフェHEK 293TのB）代表BIFC信号細胞。 HEK 293T細胞は、CFP、VN-AKAP-LBCおよびVC-PDE4D3構築物（FL-、-UCR1、-UCR2 + CAT）と共トランスフェクトした。非集約ライブCFP +細胞がゲーティングし、そのBIFC蛍光はフォワードYFP対に散布ダブルドットプロットが示されている。C）AKAP-LBC及びPDE4D3フラグメントの同等の表現を示すウェスタンブロット。 より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。
図5。免疫共沈降によるフローサイトメトリー解析の確認。HEK 293T細胞を同時トランスフェクトしたV5-AKAP-LBC及びGFP-PDE4D3コンストラクト（-FL、-UCR1、-UCR2 + CAT）の発現のために。 48時間のトランスフェクション後、AKAP-LBCは、V5-アガロースビーズを用いて免疫沈降させた。 PDE4D3-FLの結合、UCR1とUCR2 + CATを、抗-GFP一次抗体を用いてSDS-PAGEおよびウェスタンブロットにより検出した。免疫沈降のために使用される対応PDE4D3入力は、すべてPDE4D3-フラグメント類似表現を示す示されている。
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Discussion
BIFCは、タンパク質 - タンパク質相互作用を研究するためのシンプルかつ高感度な方法である。この方法は、新しいタンパク質 - タンパク質相互作用を識別するために使用することができない、しかし、それは細胞内タンパク質 - タンパク質相互作用を確認することと機能的特性を研究するために特に便利である等のタンパク質複合体の細胞内局在として、タンパク質 - タンパク質相互作用部位のマッピング、およびタンパク質 - タンパク質相互作用を調節することができる小分子/ペプチドのスクリーニング。 VNとVC断片は、非蛍光性であるため、バックグラウンド蛍光は、このように、このアッセイの感度を助ける低い。時間はVN-タンパク質-VC-タンパク質相互作用を成熟/安定化させるために必要とされる、このようにしてタンパク質 - タンパク質相互作用の可視化に遅延があり、最適なの時点従って、経験的に決定する必要があるかもしれません。これは、VN-タンパク質-VC-タンパク質相互作用は可逆的ではないことにも注意すべきで、そのため残念ながら、現在の金星BIFCとこのアッセイがtは適していません構築oがタンパク質 - タンパク質相互作用の動的な動力学を研究する。
適切なコントロールはBIFC分析のために重要である。適切な陰性対照は、非作用タンパク質または関連するBIFCベクター中の非特異的ペプチド、又は可能であれば、タンパク質 - タンパク質相互作用を破壊する突然変異を含む。それ以外の特定の高バックグラウンド蛍光の結果として空のBIFCベクトルが良いコントロールではありません。 BIFCは、2つの相互作用タンパク質で観察されなかった場合、発現を分析すべきである。また、BIFC信号は、タンパク質 - タンパク質相互作用部位に応じて変えることができる。なお、VNおよびVCの相互作用の空間変調はまた、蛍光強度に影響を及ぼす可能性があることに留意すべきであるので、それはC末端およびN末端VN / VC発現構築物の両方を使用してBIFC実験を行うために最初に重要である。例えば、BIFCは、タンパク質 - タンパク質相互作用をブロックする場合金星断片の再会合を発生しないことがあります。したがって、VNとVCの複数の組み合わせがshoul構築（CおよびN末端 タンパク質融合両方即ち ）試験されると思います。
BIFCの蛍光強度が強く相互作用と弱い相互作用を示唆して低い蛍光強度を示すBIFCより高い強度を有する、タンパク質 - タンパク質相互作用の強さに比例する。 BIFC MFI従って、タンパク質 - タンパク質相互作用の指標として用いられる。 BIFCによるタンパク質 - タンパク質相互作用の正確な分析のために、ウエスタンブロット分析は、異なる構築物の同等の発現を確実ず、タンパク質分解が正しい分析を妨害する可能性がある、発生していないことが行われることが非常に重要である。同じサンプルからの溶解物は、したがって、分析したすべてのサンプルについて同様のタンパク質発現を決定するために、ウエスタンブロット分析のために好ましい。さらに、タンパク質の一次式との相互作用を確実にするために、トランスフェクションのためのプラスミドの適切な量を決定することが重要であり、この範囲の中で、タンパク質相互作用の相関ウィスコンシンBIFC信号の目の蛍光強度。
プラスミドCFPの低い量は、これだけCFP陽性細胞を解析した、トランスフェクションの成功のためのマーカーとして使用される。例えば、RFPなどの異なる蛍光タンパク質は、ブリードスルーカラー11との間を最小限にするために使用することができる。フローサイトメトリーのために、単一の陽性細胞は、補償のために含まれることが必要とされている。可能であれば、少なくとも10,000 CFP陽性細胞は、良好なサンプルサイズを確保するためにカウントされる。
要約すると、ここでは、フローサイトメトリー分析との結合BIFC方法は細胞内タンパク質 - タンパク質相互作用の良好な指標として用いることができることを実証している。免疫蛍光顕微鏡を用いてBIFC従来の分析には時間がかかり、サンプルサイズは、フローサイトメトリー解析するために、対応するよりもはるかに低い。トランスフェクション効率が低いとき、したがって、BIFCをフローサイトメトリーを結合するタンパク質間相互作用の分析のために有利であり得る。この中で報告書は、我々はAKAP-LBCへの結合についてPDE4D3における相互作用部位をマッピングするBIFC-フローサイトメトリーを利用した。この技術は、創薬12に対して、タンパク質-タンパク質相互作用を妨害するか、または増強し得る分子またはペプチドをスクリーニングするために拡張することができる。この方法はまた、GPCRの13のリガンド誘発性内在化などの特定の生理学的事象を研究するために使用することができる。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
我々は、重要な実験的な評価と議論のためUICでオブライアンラボに感謝します。臨床およびトランスレーショナルサイエンスグラントUL1TR000050ためのUICセンター - この作品は、トランスレーショナル研究を進めるためのGKCとナショナルセンターに米国心臓協会グラント11SDG5230003によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Dulbecco’s modified Eagle’s media (DMEM) | Invitrogen | 11965-092 | |
| Penicilin-Streptomycin (pen/strep), 100x | Invitrogen | 15070-063 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 16000-044 | |
| Anti-Flag antibody | Sigma | M2, F1804 | |
| Anti-HA antibody | Covance | 16B12, MMS-101R | |
| α-tubulin | Sigma | DM1A, T9026 | |
| Anti-GFP antibody | Clontech | 632569 | |
| Cell culture plates, 6-well tissue culture treated | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| Maxiprep plasmid purification kit, high speed | Qiagen | 12663 | |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered saline (DPBS), sterile 1x | Invitrogen | 14190-144 | |
| Trypsin-EDTA, 0.05% (w/v) | Gibco | 25300 | |
| Polystyrene round-bottom tubes for FACS staining | BD Biosciences | 352052 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | S74337MF | |
| Prolong gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P-36931 | |
| Superfrost plus Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Fisherfinest premium cover glass | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| EQUIPMENT | |||
| CO2 air-jacketed Incubator | NuAIR DH autoflow | ||
| Confocal microscope LSM510 META | Carl Zeiss, Inc | ||
| Electrophoresis and transfer unit | Biorad | ||
| Cyan ADP Flow Cytometer | Beckman Coulter | ||
References
- Collura, V., Boissy, G. From protein-protein complexes to interactomics. Subcell Biochem. 43, 135-183 (2007).
- Stumpf, M. P., et al. Estimating the size of the human interactome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6959-6964 (2008).
- Shekhawat, S. S., Ghosh, I. Split-protein systems: beyond binary protein-protein interactions. Curr. Opin. Chem. Biol. 15, 789-797 (2011).
- Dwane, S., Kiely, P. A. Tools used to study how protein complexes are assembled in signaling cascades. Bioeng. Bugs. 2, 247-259 (2011).
- Piehler, J. New methodologies for measuring protein interactions in vivo and in vitro. Curr. Opin. Struct. Biol. 15, 4-14 (2005).
- Kerppola, T. K. Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells. Nat. Protoc. 1, 1278-1286 (2006).
- Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay. Nat. Protoc. 3, 1693-1702 (2008).
- Wong, K. A., O'Bryan, J. P. Bimolecular fluorescence complementation. J. Vis. Exp. (50), e2643 (2011).
- Sugarbaker, E. V., Thornthwaite, J. T., Temple, W. T., Ketcham, A. S. Flow cytometry: general principles and applications to selected studies in tumor biology. Int. Adv. Surg. Oncol. 2, 125-153 (1979).
- Koshy, S., Alizadeh, P., Timchenko, L. T., Beeton, C. Quantitative measurement of GLUT4 translocation to the plasma membrane by flow cytometry. J. Vis. Exp. (45), e2429 (2010).
- Smith, C. L. Basic confocal microscopy. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 14 (Unit 14), 11 (2008).
- Westwick, J. K., Lamerdin, J. E. Improving drug discovery with contextual assays and cellular systems analysis. Methods Mol. Biol. 756, 61-73 (2011).
- Kilpatrick, L. E., Holliday, N. D. Dissecting the pharmacology of G protein-coupled receptor signaling complexes using bimolecular fluorescence complementation. Methods Mol. Biol. 897, 109-138 (2012).
