Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Проточной цитометрии бимолекулярного флуоресценции Комплементация: Высокая пропускная способность Количественный метод изучения взаимодействия белок-белок

doi: 10.3791/50529 Published: August 15, 2013

Summary

Проточной цитометрии анализа флуоресценции Бимолекулярные Комплементация обеспечивает высокую пропускную количественный метод для изучения белок-белковых взаимодействий. Эта методика может применяться для отображения сайтов связывания белков и скрининга факторов, которые регулируют белок-белкового взаимодействия.

Abstract

Среди методов изучения белок-белковых взаимодействий внутри клеток, Бимолекулярные Комплементация флуоресценцию (BiFC) является относительно простым и чувствительным. BiFC основан на производство флуоресценции с использованием двух нефлуоресцентные фрагменты флуоресцентный белок (Венерой, желтый флуоресцентный вариант белка, используется здесь). Номера флуоресцентный Венера фрагментов (VN и VC) сливают с двух взаимодействующих белков (в данном случае, AKAP-Lbc и PDE4D3), что дает флуоресценции из-за VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 взаимодействие и формирование функциональный флуоресцентный белок внутри клеток.

BiFC предоставляет информацию о внутриклеточной локализации белковых комплексов и сила белковых взаимодействий на основе интенсивности флуоресценции. Тем не менее, BiFC анализа с использованием микроскопии для количественной оценки силы белок-белковых взаимодействий отнимает много времени и несколько субъективным из-за гетерогенности экспрессии белка и взаимодействия. Объединяя проточной цитометрииАнализ с методологией BiFC, BiFC флуоресцентный белок-белковое взаимодействие сигнал может быть точно измерена для большого количества клеток в течение короткого времени. Здесь мы демонстрируем применение этой методологии для сопоставления регионов PDE4D3, которые необходимы для взаимодействия с AKAP-Lbc. Эта высокая пропускная способность методика может быть применена к скрининг факторов, которые регулируют белок-белкового взаимодействия.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

650 000 белок-белковых взаимодействий, по оценкам, существуют в человеческом интерактома, играющих важнейшую роль в поддержании нормальной функции клеток 1,2. Кроме того коиммунопреципитации (со-IP) золотым стандартом для изучения белок-белковых взаимодействий от клеточного лизата, несколько анализов фрагмент белка дополнения (СПС) были разработаны для повышения чувствительности для обнаружения белок-белковых взаимодействий внутри клеток 3. Методы включают Ферстер резонансный перенос энергии (лад), биолюминесценция резонансный перенос энергии (BRET) и флуоресценции Бимолекулярные Комплементация (BiFC) 4,5. BiFC основана на облегченных объединение двух фрагментов флуоресцентный белок (здесь используется Венеры вариант YFP), которые каждый слитый с потенциальными партнерами взаимодействующих белков (в данном примере мы используем AKAP-Lbc и PDE4D3). Взаимодействие этих двух белков интерес внутри клеток приводит к функциональным флуоресценции, которые могут быть визуализированы еluorescence микроскопии с использованием прямой трансляции или в фиксированных клетках 6,7,8. По сравнению с другими СПС, BiFC чувствительны и менее технически сложных, с потенциалом для изучения клеточной локализации в живых клетках. Основным недостатком этого метода, однако, что как только образуется, флуоресцентный комплекс белок не может быть отменено. Поэтому это не является хорошим методом для изучения динамических белок-белкового взаимодействия. В данной работе мы используем BiFC для отображения взаимодействия сайтах PDE4D3 с AKAP-Lbc путем мониторинга интенсивности флуоресценции Венеры. По сравнению с традиционным анализом с помощью флуоресцентной микроскопии, которое является длительным и трудоемким (если не осуществляется с использованием автоматизированной машины высокой пропускной способностью), проточной цитометрии обеспечивает простой количественного анализа тысяч клеток в гетерогенную популяцию в течение короткого времени 9, 10. Здесь, путем проведения бок-о-бок сравнение проточной цитометрии-BiFC анализ и традиционных со-IP, мы показали, что две мethods представления сопоставимых данных, однако, проточной цитометрии BiFC анализ менее трудоемким и требует меньше материала, который может быть более полезным, когда клетки интерес ограничены.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Трансфекции клеток

  1. Пластина клеток за день до трансфекции, покрытие меньше клеток для иммунофлюоресценции.
    1. Для иммунофлюоресценции: в 6-луночный планшет, пальто скользит стеклянной крышкой (1 на лунку) с 0,02% желатина при 37 ° С в течение не менее 4 часов, мыть один раз средой, и для каждой скважины, знаки 1 х 10 5 НЕК 293Т клеток в 2 мл полной среды роста [среды Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM) с 10% FBS].
    2. Для проточной цитометрии и Вестерн-блоттинг: пластина 1,2 х 10 5 НЕК-293Т клеток / лунку в 2 мл полной среды роста в 6-луночный планшет (0,3 х 10 5 НЕК-293Т в 0,5 мл полной среды роста на лунку в 24-луночный планшет ).
  2. Подготовка ДНК для трансфекции в соответствии с протоколом изготовителя: Effectene (Qiagen) используется для иммунофлюоресценции. Транзит-LT1 (Mirus) используется для проточной цитометрии и Западной блоттинга. Количество ДНК использовали приведена ниже.
    24-луночный планшет (нг) 6-луночный планшет (нг)
    CFP-вектор 10 50
    В.Н. N-AKAP-Lbc 200 1000
    VC-N PDE4D3-ФЗ (полнометражный PDE4D3) 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 100
    VC N-PDE4D3-UCR1 (PDE4D3 N-концевого фрагмента, содержащего UCR1 домен) 100
    VC N-PDE4D3-UCR2 + CAT (PDE4D3 С-концевой фрагмент, содержащий UCR2 и каталитические домены) 100
    Трансфекция использованием Effectene (6-а)
    1. Добавить указанным количеством плазмидной ДНК + 4 мкл энхансера к 100 мкл буфера EC, перемешивают, и инкубируют в течение 5 мин при комнатной температуре.
    2. Добавьте 5 мкл Effectene, перемешать, и инкубировать в течение 10 мин прикомнатной температуре. Добавить по каплям к клеткам.
    Трансфекции с использованием транзитного LT1 (6-well/24-well):
    1. Добавить указанным количеством плазмидной ДНК в 250 мкл μl/50 Opti-MEM I бессывороточной среде в стерильную пробирку.
    2. Добавить Транзит-LT1 реагента к разбавленной смеси ДНК и пипеткой осторожно перемешать. (Транзит-LT1 реагент: ДНК соотношение 3 мкл Транзит-LT1 реагента на 1 мкг ДНК).
    3. Выдержите в течение 30 мин при комнатной температуре и добавляют по каплям к клеткам.

2. Подготовка клеток для проточной цитометрии, вестерн-блот и Иммунофлуоресценция

  1. 24 ч после трансфекции, проверьте флуоресценции под микроскопом эпифлуоресцентной до уборки клеток.
  2. Сотовые подготовки к проточной цитометрии:
    1. Вымойте клеток с 0,5 мл / 2 мл ледяной PBS для пластин 24-well/6-well.
    2. Отделить клетки с использованием 50 мкл μl/250 0,05% трипсина.
    3. Нейтрализовать трипсин 200 мкл / 1 мл DMEM среде.
    4. Collect 250 мкл клеток (как для 24-и и 6-луночный планшет) центрифугированием при 500 х г в течение 5 мин, используя оставшиеся клетки (1 мл) в течение Вестерн-блоттинга.
    5. Ресуспендируют клеток в 250 мкл буфера FACS [PBS + 0,5% (вес / объем) БСА + 2 мМ ЭДТА], хранить на льду в течение проточной цитометрии. Клетки также может быть установлена ​​в 1% параформальдегида (в ФБР), если анализ проточной цитометрии не будет немедленным.
  3. Клеточный препарат для вестерн-блоттинга: осуществляется параллельно с подготовкой к клетке анализа потока цитометрии.
    1. Мытье клетки 1x с 2 мл ледяного PBS, клетки лизируют путем добавления 100 мкл буфера для лизиса клеток [10 мМ натрий-фосфатным буфером, рН 6,95, 150 мМ NaCl, 5 мМ ЭДТА, 5 мМ EGTA, 1% Тритон Х-100] .
    2. Сбор клеточного лизата центрифугированием в течение 10 мин при 21000 х г при 4 ° С.
    3. Количественно концентрации белка с помощью анализа на протеин по Брэдфорду, нагрузка равные количества белка на полосу для SDS-PAGE и перенос т на нитроцеллюлозные для иммуноблоттинга.
    4. Сотовые подготовка к иммунофлюоресценции.
      1. Промыть клетки 3 раза по 2 мл PBS, фиксируют клеток в 1 мл 3,7% параформальдегида (в PBS) в течение 10 мин при комнатной температуре, затем промывают 3 раза по 2 мл PBS в течение 5 мин.
      2. Установить крышку скольжения на предметное стекло, используя монтажную среду. Печать покровного края, используя лак для ногтей, если необходимо.
      3. Хранить слайды при 4 ° С до экзамена.

    3. Проточной цитометрии и иммунофлюоресцентную микроскопию

    1. Проточная цитометрия выполняется с использованием Beckman Coulter Cyan ADP, оснащенный 488 нм, 405 нм и 642 нм твердотельные лазеры. Саммит программное обеспечение используется для сбора и анализа.
      1. Калибровка проточной цитометрии с использованием стандартных бисером.
      2. Участок прямого рассеяния (FSC) / бокового рассеяния (SSC) в линейном масштабе для стробирования живой клеточной популяции.
      3. Участок FSC / напряжения длительностью импульса стробирования неагрегированного живой клеточной популяции.
      4. Участок count/FL6 (СФП fluorescencе, 405 нм) по логарифмической шкале для стробирования неагрегированного живой CFP-положительных клеток.
      5. Участок count/FL1 (YFP флуоресценции, 488 нм) по логарифмической шкале для BiFC интенсивности.
      6. Выполнить YFP-CFP-двойных отрицательных образцов, отрегулируйте FSC, SSC, и FL1 FL6 ФЭУ (ФЭУ) напряжения для установки порога для каждого сигнала.
      7. Запуск одного положительного (как YFP + + и CFP) образцы для будущих автономно компенсации
      8. Приобрести не менее 10 000 закрытых мероприятиях (неагрегированного живой CFP + клеток) для анализа.
    2. Иммунофлуоресценция микроскопия выполняется с использованием Zeiss LSM 510 конфокальной микроскопии. Примечание: важно, чтобы все настройки (такие как зум, Пинхол, детектор усиления, смещения усилителя, размер кадра, скорость сканирования, сканирования среднего и лазерной мощности) между последовательной Образцы для правильного сравнение всех данных.

    4. Анализ данных (выполняется с помощью программного обеспечения саммита)

    1. Настройка анализа протокола, аналогичного, что для acquisitиона с надлежащей стробирования:
      Gate 1 в FSC / SSC точка участка для живых клеток.
      Gate 2 в FSC / ширина импульса для ворот 1 неагрегированного живых клеток.
      Gate 3 в подсчет / CFP Ворот 3 для неагрегированного CFP + живые клетки.
    2. Компенсировать YFP и CFP сигнала с использованием YFP + + и CFP одного положительного клеток.
    3. Повторного определения отключения линий для CFP / YFP-позитивных клеток.
    4. Экспорт YFP средней интенсивности флуоресценции (MFI) из CFP + клеток в Excel для построения данных.
    5. Нормализация YFP MFI на уровни экспрессии AKAP-Lbc, PDE4D3 и управления загрузкой α-тубулина, как определено Вестерн-блоттинга.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

AKAP-Lbc PDE4D3 и конструкции (рис. 1Б) были слиты с В.Н. и VC фрагменты, соответственно. Взаимодействие AKAP-Lbc PDE4D3 и приводит к функциональным YFP флуоресценции (рис. 1А). Здесь мы используем метод BiFC к карте AKAP-Lbc-связывающие сайты в PDE4D3. Upstream консервативная область 1 (UCR1), вверх по течению консервативной области 2 (UCR2) и каталитической области (КПП) являются консервативными ФДЭ4 белков семейства, поэтому, полная длина (Флорида), UCR1 и UCR2 Plus Кат были использованы для скрининга сайт связывания PDE4D3 к AKAP-Lbc. Выражение VN-AKAP-Lbc и VC-PDE4D3-фрагментов в клетки НЕК 293Т приводит к флуоресценции с разной интенсивностью (рис. 1в). BiFC означает, что оба UCR1 и UCR2 + CAT способствовать взаимодействию с PDE4D3 AKAP-Lbc. Большая интенсивность флуоресценции в результате AKAP-Lbc-UCR1 взаимодействие, по сравнению с AKAP-Lbc-UCR2 CAT + указывает, что ФДЭ-UCR1 связывается с AKAP-Lbc лучше, чем ФДЭ-UCR2 CAT +.

(2А) и агрегатов клеток были исключены с помощью SSC против широтно-импульсной двойной точки (фиг. 2В). Клетки с BiFC сигнала или CFP только экспрессии были UСЭД для определения компенсации и отключения для клетки без флуоресценции (рис. 2C-2F). CFP вектор совместно трансфицировали BiFC конструкции и CFP экспрессии использовали в качестве положительного маркер для указания успешной трансфекции. Только CFP + клетки использовали для измерения флуоресценции BiFC. Трансфекция увеличением количества PDE4D3 привело к увеличению Венерой (YFP) BiFC сигнал (фиг. 3А), в то время CFP сигнала остается неизменной (фигура 3В). Выражение VN-AKAP-Lbc и увеличением количества VC-PDE4D3 была подтверждена вестерн-блоттинга (фиг.3С). В целом, увеличить PDE выражение в результате линейное возрастание флуоресценции BiFC корреляции для PDE уровни экспрессии (рис. 3D). Эти результаты подтверждены использованием проточной цитометрии количественно AKAP-Lbc-PDE4D3 взаимодействие путем измерения средней интенсивности флуоресценции (MFI) от BiFC. Поэтому мы использовали эту методологию к карте AKAP-Lbc сайтов связывания в PDE4D3, используя VN-AKAP-Lbc и VC-PDE4D3 конструкций. В соответствии с нашим наблюдениям в рис. 1в, экспрессия VN-AKAP-Lbc и VC-PDE4D3-UCR2 + CAT привело к снижению BiFC сигнала по сравнению с VC-PDE4D3-ФЗ и VC-PDE4D3-UCR1 (рис. 4В). Похожие экспрессии белка наблюдалась во всех образцах потока (рис. 4С) и среднего флуоресценции нормализовали по относительным уровнем экспрессии AKAP-Lbc, PDE4D3 и α-тубулина. Поэтому нормированные BiFC MFI показывает, что нет никакой разницы в интенсивности флуоресценции между AKAP-Lbc-PDE4D3-ФЗ и AKAP-Lbc-PDE4D3-UCR1, но значительно ниже, сигнал для AKAP-Lbc-PDE4D3-UCR2 + CAT взаимодействия (рис. 4а ). Эти результаты позволяют предположить, что существует несколько регионов PDE4D3, которые взаимодействуют с AKAP-Lbc, и что PDE4D3-UCR1 является основной области взаимодействия с AKAP-Lbc. Этот результат был также подтвержден совместного IP, золотой стандарт для взаимодействия белок-белок (рис. 5).

Рисунок 1
Рисунок 1. BiFC анализ AKAP-Lbc-PDE4D3-фрагмент взаимодействия с помощью иммунофлуоресценции микроскопии. А) Схема представителя Бимолекулярные флуоресценции Комплементация (BiFC). Венера фрагменты, В. Н. и VC слиты AKAP-Lbc и PDE4D3 соответственно. AKAP-Lbc-PDE4D3 взаимодействие приводит к функциональным флуоресценции YFP. B) Принципиальная схема конструкции PDE4D3 использоваться для отображения.) Представитель BiFC сигналы трансфицирован клеток НЕК 293Т. Клетки были совместно трансфицированы VN-AKAP-Lbc и VC-PDE4D3 конструкции (-FL, UCR1-,-UCR2 + CAT) для BiFC анализа. CFP-вектор также совместно трансфицировали как трансфекция маркера. 24 часов после трансфекции клетки фиксировали для визуализации. BiFC сигнала показана на зеленый и CFP показано в красном псевдоцвете в объединенной цифрами. 9/50529fig1large.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок.

Рисунок 2
Рисунок 2. Определение ворота и компенсации для анализа FACS. ) FSC против SSC точка сюжета до ворот живых клеток и исключить мусор и мертвые клетки. B) боковое рассеяние против ширины импульса точки сюжета к воротам отдельных клеток и исключить агрегатов. C), экспрессирующие CFP (СФП + клеток) до компенсации. D ), экспрессирующие CFP (СФП + клеток) после компенсации YFP. Светотеневой границы для клеток с экспрессией YFP был повторно определен. E) клеток с BiFC сигнал (YFP + клеток) перед компенсацией. F) клеток с BiFC сигнал (YFP + клеток) после компенсации CFP. Светотеневой границы для ячеек с выражением CFP была вновь определена.целевых = "_blank"> Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок.

Рисунок 3
Рисунок 3. Анализ AKAP-Lbc-PDE4D3 взаимодействия с использованием BiFC-проточной цитометрии путем изменения количества PDE4D3 выражения. А) увеличение BiFC сигнала внутри клетки CFP + трансфицированными с увеличением количества VC-PDE4D3. Клетки трансфицировали CFP (10 нг), VN-AKAP-Lbc (200 нг) и увеличением количества VC-PDE4D3 (2,5 нг до 80 нг). Неагрегированного CFP + живые клетки были закрытого типа, и YFP флуоресценции показано как YFP против прямого рассеяния двойной участок точкой. YFP + клеток показаны на зеленый. Представитель данных из 5 нг, 20 нг, нг 80 и VC-PDE4D3 показано. B) CFP флуоресценции в живых клетках показана как CFP против прямого рассеяния двойном участке точка, с указанием последовательного флуоресценции CFP среди всех образцов. C) Вестерн-блоттинга демонстрирующих увеличение PDE4D3 expressioн с последовательным выражением AKAP-Lbc и α-тубулина (используемой в качестве управления загрузкой). D) Венерой (YFP) Среднее значение интенсивности флуоресценции (MFI) от CFP + клетках коррелирует с VC-PDE4D3 выражения. Повязку меняют обоих YFP ИТР от CFP + клеток откладывается по МФО с CFP кратное изменение от неагрегированного живых клеток. Относительные уровни экспрессии VC-PDE4D3 определяется Изображение J анализ иммуноблоттинга также нанесены. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 4
Рисунок 4. BiFC анализ AKAP-Lbc взаимодействия с PDE4D3-ФЗ, PDE4D3-UCR1, PDE4D3-UCR2 + CAT с использованием проточной цитометрии. А) AKAP-Lbc-PDE4D3-фрагмент взаимодействия количественно Венера-MFI нормированные на экспрессию белка (AKAP-Lbc, PDE4D3 фрагментов и управления загрузкой α-тубулина). Реifference в сигнал BiFC были рассмотрены один дисперсионного анализа (ANOVA) Значение р <0,01 считается очень значительным (**), в то время как значение р <0,05 считают незначительным (нс). B) представитель BiFC сигнал в трансфицированных НЕК-293Т клетках. НЕК 293Т котрансфицировали с CFP, VN-AKAP-Lbc и VC-PDE4D3 конструкции (-FL, UCR1-,-UCR2 + КПП). Неагрегированного живой CFP + клетки были ворота, и их BiFC флуоресценции показано на YFP против прямого рассеяния двойной участок точкой. C) Вестерн-блот указывает сопоставимых выражение AKAP-Lbc и PDE4D3-фрагментов. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 5
Рисунок 5. Подтверждение анализ потока цитометрии совместной иммунопреципитации. НЕК-293Т котрансфицировалидля выражения V5-AKAP-Lbc и GFP-PDE4D3 конструкции (-FL, UCR1-,-UCR2 + КПП). 48 ч после трансфекции AKAP-Lbc подвергали иммунопреципитации использованием V5-агарозы. Связывание PDE4D3-FL, UCR1 и UCR2 + CAT была обнаружена в ДСН-ПААГ и Вестерн-блоттинга с использованием анти-GFP первичного антитела. Соответствующие PDE4D3 вход, используемый для иммунопреципитации показано также, что указывает на аналогичное выражение для всех PDE4D3-фрагментов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

BiFC является простой и чувствительный метод для изучения белок-белковых взаимодействий. Этот метод не может быть использован для идентификации новых белок-белковых взаимодействий, однако, это особенно удобно, чтобы подтвердить белок-белковых взаимодействий внутри клетки и изучать функциональные свойства, такие, как внутриклеточной локализации белковых комплексов, отображение белок-белкового взаимодействия сайтов, а также для скрининга малых молекул / пептидов, которые могут модулировать белок-белкового взаимодействия. Потому В.Н. и VC фрагменты нефлуоресцентных, фоновой флуоресценции низкий, способствуя таким образом чувствительность этого анализа. Необходимо время для созревания / стабилизации VN-протеин-VC-белкового взаимодействия, при этом происходит задержка визуализации белок-белковых взаимодействий и оптимальное моменты времени могут, следовательно, должны быть определены эмпирически. Следует также отметить, что VN-протеин-VC-белкового взаимодействия не является обратимым, следовательно, к сожалению с текущим Венера BiFC строит этом анализе не подходит тО динамическом исследовании кинетики взаимодействия белок-белок.

Надлежащего контроля важны для BiFC анализа. Подходящий отрицательный контроль включает не взаимодействующих белков или неспецифическими пептидами в соответствующих BiFC вектор, или, если возможно, мутант, который разрушает белок-белкового взаимодействия. Пустой вектор BiFC не является хорошим управления, как это приводит к неспецифической высокой фоновой флуоресценции. Если BiFC не наблюдается в двух взаимодействующих белков, экспрессия должна быть проанализирована. Кроме того, BiFC сигнала может изменяться в зависимости от белок-белкового взаимодействия сайтов. Следует отметить, что пространственной модуляции взаимодействием В. Н. и VC также может влиять на интенсивность флуоресценции, поэтому изначально важно проводить BiFC эксперименты с использованием как С-концевой и N-концевой VN / VC экспрессирующие конструкции. Например, BiFC не может произойти, если белок-белковое взаимодействие блоков повторного ассоциирования фрагментов Венеры. Таким образом, несколько комбинаций В.Н. и VC строит Shoulбы быть проверены (т.е. как C и N слияния терминала белка).

Интенсивность флуоресценции BiFC пропорциональна силе белок-белковых взаимодействий, с более высокой интенсивностью BiFC указывает сильное взаимодействие и нижний интенсивности флуоресценции предполагая слабое взаимодействие. BiFC MFI, следовательно, используется как индикатор для белок-белкового взаимодействия. Для точного анализа белок-белкового взаимодействия BiFC, очень важно, чтобы Вестерн-блот анализ выполняется для обеспечения равного экспрессии различных конструкций и что никакие деградации белка не происходит, что может мешать правильной анализа. Лизат из тех же образцов Поэтому предпочтительно для вестерн-блот анализ, чтобы определить аналогичный экспрессии белка для всех анализируемых образцов. Кроме того, очень важно, чтобы определить соответствующее количество плазмид для трансфекции чтобы обеспечить линейное выражение и взаимодействие белков и среди этого диапазона, взаимодействие белка коррелирует шй интенсивности флуоресценции BiFC сигнала.

Низкое количество CFP плазмиду использовали в качестве маркера для успешной трансфекции, так что только CFP положительные клетки анализировали здесь. Различные флуоресцентные белки, такие как RFP могут быть использованы, чтобы минимизировать проступание между цветами 11. Для проточной цитометрии, один позитивные клетки должны быть включены для компенсации. Если это возможно, по крайней мере 10000 CFP положительные клетки подсчитывают для обеспечения хорошего размера образца.

Таким образом, здесь показано, что соединение BiFC методологии с проточной цитометрии можно использовать как хороший показатель белок-белковых взаимодействий внутри клеток. Традиционный анализ BiFC использованием иммунофлуоресцентного микроскопа требует много времени, и размер выборки значительно ниже, чем соответствующий проточной цитометрии. Таким образом, соединение проточной цитометрии с BiFC может быть полезным для анализа белок-белкового взаимодействия, когда эффективность трансфекции является низким. В этомДоклад, мы воспользовались BiFC-проточной цитометрии для отображения взаимодействия сайтов в PDE4D3 за связывание с AKAP-Lbc. Эта техника может быть также распространена на экран для молекул или пептиды, которые могут нарушить или усилить взаимодействие белок-белок, для открытия новых лекарств 12. Этот метод также может быть использован для изучения определенных физиологических событий, таких как лиганд-индуцированной интернализации 13 GPCR автора.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Мы благодарим O'Bryan лаборатории в МСЖД для критических экспериментальной оценки и обсуждения. Эта работа выполнена при поддержке Американской Ассоциации Сердца Грант 11SDG5230003 в ГКЦ и Национальный центр Продвижение Поступательное науки - МСЖД Центр клинических и трансляционных наук Грант UL1TR000050.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Dulbecco’s modified Eagle’s media (DMEM) Invitrogen 11965-092
Penicilin-Streptomycin (pen/strep), 100x Invitrogen 15070-063
Fetal Bovine Serum (FBS) Invitrogen 16000-044
Anti-Flag antibody Sigma M2, F1804
Anti-HA antibody Covance 16B12, MMS-101R
α-tubulin Sigma DM1A, T9026
Anti-GFP antibody Clontech 632569
Cell culture plates, 6-well tissue culture treated Thermo Fisher Scientific 130184
HEK 293T cells ATCC CRL-11268
Maxiprep plasmid purification kit, high speed Qiagen 12663
Dulbecco’s Phosphate-buffered saline (DPBS), sterile 1x Invitrogen 14190-144
Trypsin-EDTA, 0.05% (w/v) Gibco 25300
Polystyrene round-bottom tubes for FACS staining BD Biosciences 352052
Paraformaldehyde Fisher Scientific S74337MF
Prolong gold antifade reagent with DAPI Invitrogen P-36931
Superfrost plus Microscope slides Fisher Scientific 12-550-15
Fisherfinest premium cover glass Fisher Scientific 12-548-5P
EQUIPMENT
CO2 air-jacketed Incubator NuAIR DH autoflow
Confocal microscope LSM510 META Carl Zeiss, Inc
Electrophoresis and transfer unit Biorad
Cyan ADP Flow Cytometer Beckman Coulter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Collura, V., Boissy, G. From protein-protein complexes to interactomics. Subcell Biochem. 43, 135-183 (2007).
  2. Stumpf, M. P., et al. Estimating the size of the human interactome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6959-6964 (2008).
  3. Shekhawat, S. S., Ghosh, I. Split-protein systems: beyond binary protein-protein interactions. Curr. Opin. Chem. Biol. 15, 789-797 (2011).
  4. Dwane, S., Kiely, P. A. Tools used to study how protein complexes are assembled in signaling cascades. Bioeng. Bugs. 2, 247-259 (2011).
  5. Piehler, J. New methodologies for measuring protein interactions in vivo and in vitro. Curr. Opin. Struct. Biol. 15, 4-14 (2005).
  6. Kerppola, T. K. Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells. Nat. Protoc. 1, 1278-1286 (2006).
  7. Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay. Nat. Protoc. 3, 1693-1702 (2008).
  8. Wong, K. A., O'Bryan, J. P. Bimolecular fluorescence complementation. J. Vis. Exp. (50), e2643 (2011).
  9. Sugarbaker, E. V., Thornthwaite, J. T., Temple, W. T., Ketcham, A. S. Flow cytometry: general principles and applications to selected studies in tumor biology. Int. Adv. Surg. Oncol. 2, 125-153 (1979).
  10. Koshy, S., Alizadeh, P., Timchenko, L. T., Beeton, C. Quantitative measurement of GLUT4 translocation to the plasma membrane by flow cytometry. J. Vis. Exp. (45), e2429 (2010).
  11. Smith, C. L. Basic confocal microscopy. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 14, (Unit 14), 11 (2008).
  12. Westwick, J. K., Lamerdin, J. E. Improving drug discovery with contextual assays and cellular systems analysis. Methods Mol. Biol. 756, 61-73 (2011).
  13. Kilpatrick, L. E., Holliday, N. D. Dissecting the pharmacology of G protein-coupled receptor signaling complexes using bimolecular fluorescence complementation. Methods Mol. Biol. 897, 109-138 (2012).
Проточной цитометрии бимолекулярного флуоресценции Комплементация: Высокая пропускная способность Количественный метод изучения взаимодействия белок-белок
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, L., Carnegie, G. K. Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction. J. Vis. Exp. (78), e50529, doi:10.3791/50529 (2013).More

Wang, L., Carnegie, G. K. Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction. J. Vis. Exp. (78), e50529, doi:10.3791/50529 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter