Summary
تحليل تدفق cytometric من التكملة الإسفار ثنائي الجزيء يوفر طريقة الكمية الإنتاجية العالية لدراسة التفاعل البروتين البروتين. ويمكن تطبيق هذه المنهجية لرسم الخرائط مواقع الربط البروتين ولفحص العوامل التي تنظم التفاعل البروتين البروتين.
Abstract
بين أساليب لدراسة التفاعل البروتين البروتين داخل الخلايا، التكملة الإسفار ثنائي الجزيء (BiFC) هو بسيط نسبيا وحساسة. ويستند BiFC على إنتاج مضان باستخدام اثنين من شظايا غير فلوري من بروتين فلوري (يتم استخدام فينوس، أصفر نيون البديل البروتين، هنا). وتنصهر شظايا فينوس غير الفلورسنت (VN وVC) لاثنين من البروتينات المتفاعلة (في هذه الحالة، AKAP-LBC وPDE4D3)، مما أسفر عن مضان بسبب التفاعل VN-AKAP-LBC-VC-PDE4D3 وتشكيل بروتين فلوري وظيفية داخل الخلايا.
يوفر BiFC المعلومات على توطين التحت خلوية من المجمعات البروتين وقوة تفاعلات البروتين على أساس كثافة مضان. ومع ذلك، تحليل BiFC باستخدام المجهر لقياس قوة التفاعل البروتين البروتين هو مضيعة للوقت وغير موضوعي إلى حد ما بسبب عدم التجانس في تعبير البروتين والتفاعل. بواسطة اقتران تدفق cytometricتحليل مع منهجية BiFC، وفلوري BiFC البروتين البروتين إشارة التفاعل يمكن قياسها بدقة للحصول على كمية كبيرة من الخلايا في وقت قصير. هنا، علينا أن نظهر تطبيق هذه المنهجية لرسم خريطة المناطق في PDE4D3 التي مطلوبة من أجل التفاعل مع AKAP-LBC. ويمكن تطبيق هذه المنهجية إنتاجية عالية لعوامل الفرز التي تنظم التفاعل البروتين البروتين.
Introduction
وتقدر 650،000 البروتين البروتين التفاعلات في الوجود في interactome الإنسان، ولعب أدوارا حاسمة في الحفاظ على وظائف الخلية العادية 1،2. وبالاضافة الى المشارك مناعي (CO-IP)، المعيار الذهبي لدراسة التفاعل البروتين البروتين من الخلايا المحللة، العديد من البروتين شظية المقايسات تكامل (PCA) تم تطويرها لتحسين حساسية في الكشف عن تفاعل البروتين البروتين داخل الخلايا 3. وتشمل تقنيات الرنين فورستر نقل الطاقة (الحنق)، تلألؤ بيولوجي بالرنين نقل الطاقة (BRET)، والتكملة الإسفار ثنائي الجزيء (BiFC) 4،5. ويستند BiFC على جمعية تيسير اثنين من أجزاء من بروتين فلوري (هنا نستخدم فينوس؛ البديل YFP) التي تنصهر فيها كل لإمكانات شريك البروتين التفاعلي (في هذا المثال نستخدم AKAP-LBC وPDE4D3). التفاعل بين اثنين من البروتينات ذات الاهتمام داخل خلايا النتائج في مضان وظيفية، والتي يمكن أن تصور كتبها fالمجهر luorescence باستخدام خلايا حية أو الثابتة 6،7،8. مقارنة PCAs أخرى، BiFC حساس وأقل تحديا من الناحية التقنية، مع القدرة على دراسة توطين الخلوية في الخلايا الحية. والعيب الرئيسي لهذا الأسلوب ولكن هو أنه بمجرد تشكيل، مجمع بروتين فلوري لا يمكن عكسها. ولذلك فإنه ليس طريقة جيدة لدراسة ديناميكية التفاعل البروتين البروتين. في هذه الورقة، ونحن نستخدم BiFC لرسم خريطة للمواقع التفاعل من PDE4D3 مع AKAP-LBC خلال رصد كثافة مضان من كوكب الزهرة. بالمقارنة مع التحليل التقليدي باستخدام المجهر مضان، التي تستغرق وقتا طويلا وتتطلب عمالة مكثفة (إذا لم تنفذ باستخدام آلات مؤتمتة عالية الإنتاجية)، ويوفر التدفق الخلوي تحليل كمي مباشرة الآلاف من الخلايا في السكان غير متجانسة على مدى فترة زمنية قصيرة 9، 10. هنا، من خلال تنفيذ مقارنة جنبا إلى جنب من تحليل تدفق cytometric-BiFC والتقليدية المشارك IP، علينا أن نظهر أن اثنين من مethods توفير بيانات قابلة للمقارنة، ومع ذلك، تدفق تحليل BiFC cytometric هو أقل استهلاكا للوقت ويستخدم أقل من المواد التي قد تكون أكثر فائدة عندما يتم خلايا الفائدة محدودة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ترنسفكأيشن الخلية
- لوحة الخلايا في اليوم قبل ترنسفكأيشن، والطلاء أقل من الخلايا للالمناعي.
- لالمناعي: في 6 جيدا لوحة، ومعطف زلات غطاء زجاجي (1 لكل بئر) مع 0.02٪ الجيلاتين عند 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 4 ساعة، ويغسل مرة واحدة مع المتوسطة، ولكل بئر، لوحة 1 × 10 5 كلوة الجنين البشري 293T الخلايا في 2 مل كاملة النمو المتوسطة [وسائل الإعلام Dulbecco لتعديل النسر (DMEM)، بالإضافة إلى 10٪ FBS].
- لتدفق تحليلات لطخة cytometric والغربية: لوحة 1.2 × 10 5 خلايا 293T كلوة الجنين البشري / جيد في 2 مل متوسطة النمو الشامل في لوحة 6 جيدا (0.3 × 10 5 كلوة الجنين البشري 293T الخلايا في 0.5 مل كاملة النمو المتوسطة لكل بئر في لوحة 24 أيضا ).
- إعداد الحمض النووي لترنسفكأيشن وفقا لبروتوكول المصنع: Effectene (QIAGEN) يستخدم لالمناعي. يستخدم العابر LT1 (MIRUS) لتدفق تحليلات لطخة cytometric والغربية. يتم سرد كمية من الحمض النووي المستخدمة أدناه.
ترنسفكأيشن باستخدام Effectene (6 أيضا):24 لوحة جيدا (NG) لوحة 6 جيدا (NG) CFP ناقلات 10 50 VN-N-AKAP LBC 200 1000 VC N-PDE4D3-FL (كامل طول PDE4D3) 2.5، 5، 10، 20، 40، 80 100 VC-N-PDE4D3 UCR1 (أ PDE4D3 N-محطة جزء يحتوي على نطاق UCR1) 100 VC-N-PDE4D3 UCR2 + CAT (أ PDE4D3 جزء C-محطة تحتوي على المجالات UCR2 والحفاز) 100 - إضافة المبلغ المشار إليه من الحمض النووي البلازميد + 4 ميكرولتر محسن إلى 100 ميكرولتر العازلة EC، مزيج، واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة 5 ميكرولتر Effectene، مزيج، واحتضان لمدة 10 دقيقة فيدرجة حرارة الغرفة. إضافة الإفلات من الحكمة إلى الخلايا.
- إضافة المبلغ المشار إليه من الحمض النووي البلازميد إلى 250 μl/50 ميكرولتر من غروب-MEM I المتوسطة المصل خالية في أنبوب العقيمة.
- إضافة العابر LT1 كاشف إلى خليط الحمض النووي المخفف وماصة بلطف لمزج. (العابر LT1 الكاشف: نسبة الحمض النووي هو 3 ميكرولتر من العابر LT1 كاشف لكل 1 ميكروغرام من الحمض النووي).
- احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وإضافة قطرة من الحكمة إلى الخلايا.
2. التحضير لخلية التدفق الخلوي، وصمة عار الغربية، والمناعي
- 24 ساعة ترنسفكأيشن آخر، تحقق مضان تحت المجهر epifluorescence قبل حصاد الخلايا.
- إعداد الخلايا لتحليل تدفق cytometric:
- غسل الخلايا مع 0.5 مل / 2 مل من الجليد الباردة PBS لوحات 24-well/6-well.
- فصل الخلايا باستخدام 50 ميكرولتر μl/250 0.05٪ التربسين.
- تحييد التربسين مع 200 ميكرولتر / 1 مل DMEM المتوسطة.
- بسllect 250 خلية ميكرولتر (لكل من 24 لوحة جيدا و6 أيضا) بواسطة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق، واستخدام الخلايا المتبقية (1 مل) للتحليل لطخة غربية.
- Resuspend الخلايا في 250 FACS العازلة ميكرولتر [PBS + 0.5٪ (W / V) BSA + 2 مم EDTA]، متجر على الجليد لتحليل تدفق cytometric. ويمكن أيضا أن تكون ثابتة في الخلايا 1٪ بارافورمالدهيد (في برنامج تلفزيوني) إذا سوف تحليل التدفق الخلوي لا يكون فوريا.
- إعداد خلية للتحليل لطخة غربية: نفذت بالتوازي مع إعداد خلية للتحليل التدفق الخلوي.
- غسل الخلايا مع 1X 2 مل الجليد الباردة PBS، ليز الخلايا بإضافة 100 ميكرولتر من العازلة تحلل الخلية [10 ملي العازلة فوسفات الصوديوم، ودرجة الحموضة 6.95، 150 ملي مول كلوريد الصوديوم، 5 ملي EDTA، 5 ملي EGTA، 1٪ تريتون X-100] .
- جمع الخلايا المحللة بواسطة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في XG 21،000 في 4 درجات مئوية.
- قياس تركيز البروتين برادفورد فحص البروتين، وتحميل كميات متساوية من البروتين لكل حارة لSDS-PAGE، ونقل إلى النيتروسليلوز لimmunoblotting.
- إعداد الخلايا لالمناعي.
- شطف الخلايا 3X مع 2 مل PBS، إصلاح الخلايا في 1 مل من بارافورمالدهيد 3.7٪ (في برنامج تلفزيوني) لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ثم يغسل 3X مع 2 مل برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
- جبل تغطية زلة على شريحة زجاجية، وذلك باستخدام المتوسطة المتزايدة. ختم حواف ساترة باستخدام طلاء الأظافر إذا لزم الأمر.
- تخزين الشرائح في 4 درجات مئوية قبل الفحص.
3. التدفق الخلوي المناعي والمجهر
- يتم تنفيذ التدفق الخلوي باستخدام بيكمان كولتر سماوي ADP، ومجهزة 488 نانومتر، 405 نانومتر، و642 نانومتر ليزر الحالة الصلبة. ويستخدم برنامج قمة لاقتناء وتحليل.
- معايرة عداد الكريات تدفق باستخدام الخرز القياسية.
- مؤامرة مبعثر إلى الأمام (FSC) / Sideward مبعثر (SSC) على مقياس خطي لتبوب السكان الخلية الحية.
- مؤامرة FSC / الجهد العرض نبض لتبوب غير المجمعة السكان الخلية الحية.
- مؤامرة count/FL6 (CFP fluorescencه، 405 نانومتر) على نطاق وسجل لتبوب غير المجمعة إيجابية الخلايا CFP الحية.
- مؤامرة count/FL1 (YFP مضان، 488 نانومتر) على نطاق وسجل لشدة BiFC.
- تشغيل العينات سلبية YFP-CFP المزدوج، وضبط FSC، SSC، FL1 وFL6 صورة أنبوب المضاعف (PMT) الجهد لضبط عتبة لكل إشارة.
- تشغيل واحدة إيجابية (سواء YFP + + وCFP) عينات للمستقبل التعويض خارج الخط
- الحصول على ما لا يقل عن 10،000 الأحداث بوابات (غير مجمعة الحية CFP + الخلايا) للتحليل.
- يتم إجراء الفحص المجهري المناعي باستخدام زايس LSM 510 المجهر متحد البؤر ملاحظة: من المهم للحفاظ على جميع الإعدادات (مثل التكبير، والثقب، واكتساب كاشف، مكبر للصوت تعويض، حجم الإطار، سرعة المسح الضوئي والمسح الضوئي المتوسط، وقوة الليزر) متسقة بين عينات للمقارنة السليم لجميع البيانات.
4. تحليل البيانات (تنفيذها باستخدام برمجيات القمة)
- إعداد بروتوكول تحليل مماثلة لتلك التي لacquisitأيون مع تبوب المناسبة:
بوابة 1 في FSC / SSC نقطة مؤامرة للخلايا الحية.
بوابة 2 في FSC / عرض النبضة من بوابة 1 للخلايا الحية غير المجمعة.
بوابة 3 في العد / CFP من بوابة 3 لCFP غير المجمعة + الخلايا الحية. - تعويض YFP وإشارة CFP YFP باستخدام + + وCFP الخلايا إيجابية واحدة.
- إعادة تحديد خطوط وقف انتاج المواد الانشطارية للخلايا CFP / YFP إيجابية.
- تصدير YFP يعني كثافة مضان (MFI) من CFP + الخلايا إلى Excel للالتآمر البيانات.
- تطبيع YFP مؤسسة التمويل الأصغر إلى مستويات التعبير عن AKAP-LBC، PDE4D3، والسيطرة التحميل α-تويولين، على النحو الذي يحدده لطخة غربية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وتنصهر AKAP-LBC وPDE4D3 بنيات (1B الشكل) إلى VN وشظايا VC، على التوالي. تفاعل AKAP-LBC وPDE4D3 النتائج في وظيفية YFP مضان (الشكل 1A). هنا نستخدم طريقة BiFC إلى خريطة مواقع AKAP-LBC ملزم في PDE4D3. منطقة الحفظ المنبع 1 (UCR1)، منطقة الحفظ المنبع 2 (UCR2) والمنطقة الحفاز (CAT) يتم حفظها بين PDE4 البروتينات الأسرة، بالتالي، طول كامل (FL)، UCR1 وUCR2 زائد القطة كانت تستخدم لفحص موقع ملزم من PDE4D3 لAKAP-LBC. التعبير عن VN-AKAP-LBC وVC-PDE4D3-شظايا في كلوة الجنين البشري 293T الخلايا النتائج في مضان مع كثافة مختلفة (الشكل 1C). BiFC يشير إلى أن كلا UCR1 وUCR2 + CAT تسهم في التفاعل من PDE4D3 مع AKAP-LBC. كثافة مضان الكبرى الناتجة عن التفاعل AKAP-LBC-UCR1، بالمقارنة مع AKAP-LBC-UCR2 + CAT، يشير إلى أن PDE-UCR1 بربط AKAP-LBC أفضل من PDE-UCR2 + CAT.
= "jove_content"> التعبير غير متجانسة من يبني BiFC وCFP في الخلية transfected يتطلب تحليل عدد كبير من الخلايا لتفسير دقيق للنتائج. ومع ذلك، التحليل التقليدي بواسطة المجهر المناعي هو كثيفة العمالة والذاتية. هذا دفعنا للاستفادة من التدفق الخلوي، لتطوير أسلوب لتحليل بسرعة التفاعل البروتين البروتين في عينة من السكان كبيرة. في البداية، أجرينا التجارب للتأكد من أن BiFC يمكن استخدامها لقياس شدة AKAP-LBC والتفاعل PDE4D3. وخلايا 293T كلوة الجنين البشري مع كمية قليلة من CFP (10 نانوغرام)، VN-AKAP-LBC (200 نانوغرام)، وكميات متزايدة من VC-PDE4D3 (2.5 نانوغرام، 5 نانوغرام، 10 نانوغرام، 20 نانوغرام، 40 نانوغرام، 80 نانوغرام). تم استبعاد الخلايا الميتة والحطام الخلية من التحليل باستخدام FSC مقابل SSC نقطة مزدوجة (الشكل 2A)، والمجاميع خلية تم استبعاد باستخدام SSC مباراة نبض العرض دوت مزدوجة (الشكل 2B). كانت الخلايا مع إشارة BiFC أو CFP التعبير وحدها Uااا لتحديد التعويض ووقف انتاج المواد الانشطارية للخلايا دون مضان (أرقام 2C-2F). CFP ناقلات وقد شارك في transfected مع ثوابت BiFC، وكان يستخدم التعبير CFP كعلامة إيجابية للإشارة ترنسفكأيشن ناجحة. واستخدمت فقط + الخلايا CFP لقياس BiFC مضان. أدى ترنسفكأيشن من كميات متزايدة من PDE4D3 في زيادة فينوس (YFP) BiFC إشارة (الشكل 3A)، في حين ظلت دون تغيير إشارة CFP (الشكل 3B). وأكد التعبير عن VN-AKAP-LBC وكميات متزايدة من VC-PDE4D3 عن طريق ويسترن صمة عار (الشكل 3C). أدى الشاملة، وزيادة PDE التعبير في زيادة خطية من BiFC مضان ربط لمستويات التعبير PDE (الشكل 3D). التحقق من صحة هذه النتائج استخدام التدفق الخلوي لقياس التفاعل AKAP-LBC-PDE4D3 عن طريق قياس كثافة مضان يعني (MFI) من BiFC. ولذلك استخدمنا هذه المنهجية إلى خريطة مواقع الربط AKAP-LBC ضمن PDE4D3 باستخدام VN-AKAP-LBC ويبني VC-PDE4D3. وتمشيا مع ملاحظاتنا في الشكل 1C، التعبير عن VN-AKAP-LBC وVC-PDE4D3-UCR2 أسفرت + CAT في إشارة BiFC أقل بالمقارنة مع VC-PDE4D3-FL وVC-PDE4D3-UCR1 (الشكل 4B). ولوحظ مماثلة تعبير البروتين في جميع العينات تدفق (الشكل 4C) ويعني تم تطبيع مضان إلى مستويات التعبير النسبية للAKAP-LBC، PDE4D3، وα-تويولين. وبالتالي، تطبيع BiFC مؤسسات التمويل الأصغر يشير إلى أنه لا يوجد أي اختلاف في كثافة مضان بين AKAP-LBC-PDE4D3-FL-LBC وAKAP-PDE4D3-UCR1، ولكن إشارة أقل من ذلك بكثير لAKAP-LBC-PDE4D3-UCR2 + التفاعل CAT (الشكل 4A ). هذه النتائج تشير إلى أن هناك مناطق متعددة في PDE4D3 التي تتفاعل مع AKAP-LBC، والتي PDE4D3-UCR1 هي المنطقة الأساسية للتفاعل مع AKAP-LBC. وقد أكد هذه النتيجة أيضا من خلال المشاركة في الملكية الفكرية، والمعيار الذهبي للتفاعل البروتين البروتين (الشكل 5).
الشكل 1. تحليل BiFC التفاعل AKAP-LBC-PDE4D3-FRAGMENT بواسطة المجهر المناعي. A) ممثل تخطيطي من التكملة الإسفار ثنائي الجزيء (BiFC). وتنصهر VN وVC-LBC إلى AKAP وPDE4D3 على التوالي؛ شظايا فينوس. AKAP-LBC-PDE4D3 نتائج التفاعل في وظيفية YFP مضان. B) رسم تخطيطي من PDE4D3 بنيات تستخدم لرسم الخرائط. C) الإشارات BiFC الممثل من الخلايا transfected 293T كلوة الجنين البشري. الخلايا وشارك في transfected مع VN-AKAP-LBC وVC-PDE4D3 بنيات (-FL، UCR1-،-UCR2 + CAT) للتحليل BiFC. CFP ناقلات وأيضا شارك في transfected كعلامة ترنسفكأيشن. تم إصلاح 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن، وخلايا للتصوير. ويظهر إشارة BiFC هو مبين في الأخضر وCFP في pseudocolor الأحمر في الأرقام المدمجة. 9/50529fig1large.jpg "الهدف =" _blank "> اضغط هنا لعرض أكبر شخصية.
الشكل 2. تقرير من البوابات والتعويض عن تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية. A) FSC مقابل SSC نقطة مؤامرة لالخلايا الحية بوابة واستبعاد الحطام والخلايا الميتة. B) الجانب مبعثر مقابل عرض النبضة نقطة مؤامرة لخلايا بوابة واحدة واستبعاد المجاميع. C) خلايا معربا عن CFP (+ الخلايا CFP) قبل التعويض. D ) الخلايا معربا عن CFP (+ الخلايا CFP) بعد التعويض YFP. خط وقف انتاج المواد الانشطارية للخلايا مع YFP التعبير أعيد تحديدها. E) الخلايا مع BiFC إشارة (+ الخلايا YFP) قبل التعويض. F) الخلايا مع BiFC إشارة (+ الخلايا YFP) بعد التعويض CFP. خط وقف انتاج المواد الانشطارية للخلايا مع CFP التعبير أعيد تحديدها.الهدف = "_blank"> اضغط هنا لعرض أكبر شخصية.
الشكل (3). تحليل التفاعل AKAP-LBC-PDE4D3 باستخدام الخلوي BiFC التدفق من خلال تغيير كمية من PDE4D3 التعبير. أ) زيادة إشارة BiFC داخل + الخلايا CFP transfected مع كميات متزايدة من VC-PDE4D3. وخلايا مع CFP (10 نانوغرام)، VN-AKAP-LBC (200 نانوغرام) وكميات متزايدة من VC-PDE4D3 (2.5 نانوغرام إلى 80 نانوغرام). كانت الخلايا CFP + لايف غير المجمعة بوابات ويظهر YFP مضان كما YFP مباراة الأمام مبعثر مزدوجة مؤامرة نقطة. وتظهر الخلايا YFP + باللون الأخضر. وتظهر بيانات ممثل من 5 نانوغرام، 20 نانوغرام، و 80 نانوغرام VC-PDE4D3. ب) ويرد CFP مضان في الخلايا الحية كما CFP مباراة الأمام مبعثر مزدوجة مؤامرة نقطة، مشيرا متسقة مضان CFP بين جميع العينات. C) مما يدل تحليل لطخة غربية زيادة PDE4D3 expressioن مع التعبير ثابت من AKAP-LBC وα-تويولين (تستخدم كعنصر تحكم التحميل). D) فينوس (YFP) متوسط كثافة مضان (MFI) من CFP + يرتبط الخلايا مع VC-PDE4D3 التعبير. يتم رسم تغيير أضعاف من كلا YFP مؤسسات التمويل الأصغر من + الخلايا CFP جنبا إلى جنب مع مؤسسات التمويل الأصغر CFP تغيير أضعاف من الخلايا الحية غير المجمعة. يتم رسم مستويات التعبير النسبية للVC-PDE4D3 يحدده تحليل الصور J من لطخة غربية أيضا. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
الشكل 4. تحليل BiFC التفاعل AKAP-LBC مع PDE4D3-FL، PDE4D3-UCR1، PDE4D3-UCR2 + CAT باستخدام التدفق الخلوي. A) وكان كميا التفاعل AKAP-LBC-PDE4D3-FRAGMENT بواسطة فينوس-MFI تطبيع للتعبير البروتين (AKAP-LBC، PDE4D3 شظايا وتحميل سيطرة α-تويولين). Dتم فحص ifference في إشارة BiFC من جانب واحد تحليل التباين الأحادي (ANOVA) قيمة P <0.01 تعتبر هامة جدا (**) بينما AP قيمة> يعتبر 0.05 يست كبيرة (NS). B) الممثل إشارة BiFC في transfected كلوة الجنين البشري 293T الخلايا. الخلايا 293T كلوة الجنين البشري وقد شارك في transfected مع CFP، VN-AKAP-LBC وVC-PDE4D3 بنيات (-FL، UCR1-،-UCR2 + CAT). كانت غير المجمعة الحية CFP + الخلايا المغلقة، ويظهر مضان بهم BiFC YFP في مباراة الأمام مبعثر مزدوجة مؤامرة نقطة. C) لطخة غربية تشير إلى التعبير مشابه من AKAP-LBC وPDE4D3-شظايا. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
الشكل 5. تأكيدا لتحليل التدفق الخلوي من قبل المشترك مناعي. كلوة الجنين البشري خلايا 293T وشارك في transfectedللتعبير عن V5-AKAP-LBC وGFP-PDE4D3 بنيات (-FL، UCR1-،-UCR2 + CAT). 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن، كان immunoprecipitated AKAP-LBC باستخدام الخرز V5-الاغاروز. تم الكشف ملزم من PDE4D3-FL، UCR1 وUCR2 + CAT بواسطة SDS-PAGE وصمة عار الغربية استخدام الألغام المضادة للGFP الأجسام المضادة الأولية. ويظهر أيضا في المقابلة PDE4D3 المدخلات المستخدمة لمناعي، مما يشير تعبير مماثلة لجميع شظايا PDE4D3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
BiFC هو وسيلة بسيطة وحساسة لدراسة التفاعل البروتين البروتين. هذا الأسلوب لا يمكن أن تستخدم لتحديد البروتين البروتين التفاعلات الجديدة، ومع ذلك، وأنها مريحة خاصة لتأكيد التفاعل البروتين البروتين داخل الخلايا ودراسة الخصائص الفنية؛ مثل توطين التحت خلوية من المجمعات البروتين، ورسم خرائط لمواقع التفاعل البروتين البروتين، و للكشف عن جزيئات صغيرة / الببتيدات التي يمكن أن تعدل التفاعل البروتين البروتين. لأن VN VC وشظايا غير قابلة للفلوري، مضان الخلفية منخفضة، مما يساعد حساسية هذا الاختبار. هناك حاجة لوقت حتى تنضج / استقرار التفاعل VN-البروتين VC-البروتين، وبالتالي هناك تأخير لتصور التفاعل البروتين البروتين، وبالتالي قد يكون نقاط الوقت الأمثل لأن تحدد تجريبيا. كما تجدر الإشارة إلى أن التفاعل VN-البروتين VC-البروتين لا يمكن عكسها، ولذلك للأسف مع فينوس الحالي BiFC يبني هذا الاختبار غير مناسب رس دراسة حركية ديناميكية للتفاعل البروتين البروتين.
الضوابط المناسبة مهمة لتحليل BiFC. يتضمن جهاز التحكم السلبية مناسبة البروتينات غير متفاعلة أو الببتيدات غير محددة في ناقلات BiFC ذات الصلة، أو إذا كان ذلك ممكنا، متحولة أن يعطل التفاعل البروتين البروتين. ناقلات BiFC فارغة ليس سيطرة جيدة كما أنه يؤدي إلى ارتفاع غير محددة مضان الخلفية. إن لم يكن لوحظ BiFC في اثنين من البروتينات المتفاعلة، ينبغي تحليل التعبير. أيضا، قد تختلف إشارة BiFC اعتمادا على مواقع التفاعل البروتين البروتين. وتجدر الإشارة إلى أن التشكيل المكاني للVN وVC التفاعل قد تؤثر أيضا على كثافة مضان، وبالتالي فإنه من المهم في البداية لإجراء تجارب BiFC باستخدام كل من C-N-محطة ومحطة VN / VC بنيات التعبير. على سبيل المثال، BiFC قد لا تحدث إذا البروتين البروتين التفاعل كتل إعادة رابطة شظايا فينوس. لذلك، تركيبات متعددة من VN وVC يبني شولد فحصها (أي كل من C و N محطة اندماج بروتين).
كثافة مضان من BiFC يتناسب مع قوة من التفاعل البروتين البروتين، مع كثافة BiFC الأعلى تشير إلى تفاعل أقوى وكثافة مضان أقل مما يشير إلى التفاعل أضعف. ولذلك يتم استخدام BiFC MFI كمؤشر للتفاعل البروتين البروتين. للتحليل الدقيق للتفاعل البروتين البروتين بواسطة BiFC، فمن المهم جدا أن يتم إجراء تحليل لطخة غربية لضمان التعبير متساوية من بنيات مختلفة وأن أي تدهور البروتين يحدث، والتي قد تتداخل مع التحليل الصحيح. المحللة من نفس عينات لذلك يفضل للتحليل لطخة غربية لتحديد بروتين تعبير مماثلة لجميع العينات التي تم تحليلها. بالإضافة إلى ذلك، فمن الأهمية بمكان لتحديد كمية مناسبة من البلازميدات لترنسفكأيشن لضمان التعبير الخطي والتفاعل من بروتينات، وبين هذا النطاق، تفاعل بروتين يرتبط وايال كثافة مضان من إشارة BiFC.
يتم استخدام كمية قليلة من CFP البلازميد كعلامة للترنسفكأيشن ناجحة، وقد تم تحليل الخلايا إيجابية حتى CFP فقط هنا. بروتين فلوري مختلفة، مثل طلب تقديم العروض يمكن أن تستخدم لتقليل تنزف من خلال الألوان بين 11. لالتدفق الخلوي، وهناك حاجة إلى الخلايا إيجابية واحدة ليتم تضمينها للحصول على تعويض. إذا كان ذلك ممكنا، يتم عد لا يقل عن 10،000 الخلايا إيجابية CFP لضمان حجم عينة جيدة.
وخلاصة القول، هنا علينا أن نظهر أن اقتران منهجية BiFC مع تحليل تدفق cytometric يمكن استخدامها كمؤشر جيد للتفاعل البروتين البروتين داخل الخلايا. التحليل التقليدي من BiFC باستخدام المجهر المناعي هو مضيعة للوقت، وحجم العينة أقل من ذلك بكثير المقابلة لتحليل تدفق cytometric. وبالتالي، اقتران التدفق الخلوي مع BiFC قد يكون من المفيد لتحليل التفاعل البروتين البروتين عندما كفاءة ترنسفكأيشن منخفضة. في هذاالتقرير، فإننا اتخذنا الاستفادة من الخلوي BiFC التدفق لرسم خريطة للمواقع التفاعل في PDE4D3 للربط إلى AKAP-LBC. ويمكن أيضا أن تمتد هذه التقنية للكشف عن جزيئات أو الببتيدات التي قد تعطل أو تعزيز التفاعل البروتين البروتين، لمكافحة المخدرات واكتشاف 12. ويمكن أيضا استخدام هذا الأسلوب لدراسة بعض الأحداث الفسيولوجية، مثل استيعاب يجند التي يسببها من 13 GPCR لل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
نشكر المختبر O'Bryan في UIC للتقييم التجريبي النقدي والمناقشة. وأيد هذا العمل من قبل جمعية القلب الأمريكية منحة 11SDG5230003 إلى مركز GKC والوطنية للنهوض بالحركة العلوم - مركز UIC للعلوم السريرية وبالحركة المنح UL1TR000050.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Dulbecco’s modified Eagle’s media (DMEM) | Invitrogen | 11965-092 | |
| Penicilin-Streptomycin (pen/strep), 100x | Invitrogen | 15070-063 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 16000-044 | |
| Anti-Flag antibody | Sigma | M2, F1804 | |
| Anti-HA antibody | Covance | 16B12, MMS-101R | |
| α-tubulin | Sigma | DM1A, T9026 | |
| Anti-GFP antibody | Clontech | 632569 | |
| Cell culture plates, 6-well tissue culture treated | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| Maxiprep plasmid purification kit, high speed | Qiagen | 12663 | |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered saline (DPBS), sterile 1x | Invitrogen | 14190-144 | |
| Trypsin-EDTA, 0.05% (w/v) | Gibco | 25300 | |
| Polystyrene round-bottom tubes for FACS staining | BD Biosciences | 352052 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | S74337MF | |
| Prolong gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P-36931 | |
| Superfrost plus Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Fisherfinest premium cover glass | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| EQUIPMENT | |||
| CO2 air-jacketed Incubator | NuAIR DH autoflow | ||
| Confocal microscope LSM510 META | Carl Zeiss, Inc | ||
| Electrophoresis and transfer unit | Biorad | ||
| Cyan ADP Flow Cytometer | Beckman Coulter | ||
References
- Collura, V., Boissy, G. From protein-protein complexes to interactomics. Subcell Biochem. 43, 135-183 (2007).
- Stumpf, M. P., et al. Estimating the size of the human interactome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6959-6964 (2008).
- Shekhawat, S. S., Ghosh, I. Split-protein systems: beyond binary protein-protein interactions. Curr. Opin. Chem. Biol. 15, 789-797 (2011).
- Dwane, S., Kiely, P. A. Tools used to study how protein complexes are assembled in signaling cascades. Bioeng. Bugs. 2, 247-259 (2011).
- Piehler, J. New methodologies for measuring protein interactions in vivo and in vitro. Curr. Opin. Struct. Biol. 15, 4-14 (2005).
- Kerppola, T. K. Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells. Nat. Protoc. 1, 1278-1286 (2006).
- Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay. Nat. Protoc. 3, 1693-1702 (2008).
- Wong, K. A., O'Bryan, J. P. Bimolecular fluorescence complementation. J. Vis. Exp. (50), e2643 (2011).
- Sugarbaker, E. V., Thornthwaite, J. T., Temple, W. T., Ketcham, A. S. Flow cytometry: general principles and applications to selected studies in tumor biology. Int. Adv. Surg. Oncol. 2, 125-153 (1979).
- Koshy, S., Alizadeh, P., Timchenko, L. T., Beeton, C. Quantitative measurement of GLUT4 translocation to the plasma membrane by flow cytometry. J. Vis. Exp. (45), e2429 (2010).
- Smith, C. L. Basic confocal microscopy. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 14 (Unit 14), 11 (2008).
- Westwick, J. K., Lamerdin, J. E. Improving drug discovery with contextual assays and cellular systems analysis. Methods Mol. Biol. 756, 61-73 (2011).
- Kilpatrick, L. E., Holliday, N. D. Dissecting the pharmacology of G protein-coupled receptor signaling complexes using bimolecular fluorescence complementation. Methods Mol. Biol. 897, 109-138 (2012).
