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Biology

Bimolecular प्रतिदीप्ति complementation का प्रवाह cytometric विश्लेषण: प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक उच्च Throughput मात्रात्मक विधि

Published: August 15, 2013 doi: 10.3791/50529
Automatic Translation
1, 1
1Department of Pharmacology, University of Illinois at Chicago

Summary

Bimolecular प्रतिदीप्ति complementation का प्रवाह cytometric विश्लेषण प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक उच्च throughput मात्रात्मक तरीका प्रदान करता है. इस पद्धति मानचित्रण प्रोटीन बाध्यकारी साइटों के लिए और प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत नियंत्रित करने वाले कारकों स्क्रीनिंग के लिए लागू किया जा सकता है.

Abstract

कोशिकाओं के अंदर प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने के तरीकों के अलावा, Bimolecular प्रतिदीप्ति complementation (BiFC) अपेक्षाकृत सरल और संवेदनशील है. BiFC एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन के दो गैर फ्लोरोसेंट टुकड़े (वीनस, एक पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन संस्करण, यहाँ प्रयोग किया जाता है) का उपयोग कर प्रतिदीप्ति के उत्पादन पर आधारित है. गैर फ्लोरोसेंट वीनस टुकड़े (वी.एन. और कुलपति) के कारण वी.एन.-AKAP-एलबीसी-उपकुलपति PDE4D3 बातचीत और एक कार्यात्मक फ्लोरोसेंट प्रोटीन के गठन के लिए प्रतिदीप्ति उपज, दो बातचीत प्रोटीन (इस मामले में, AKAP-एलबीसी और PDE4D3) से जुड़े हुए हैं कोशिकाओं के अंदर.

BiFC प्रोटीन परिसरों के subcellular स्थानीयकरण और प्रतिदीप्ति तीव्रता के आधार पर प्रोटीन बातचीत की शक्ति के बारे में जानकारी प्रदान करता है. हालांकि, प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की शक्ति यों के लिए माइक्रोस्कोपी का उपयोग BiFC विश्लेषण समय लेने वाली और प्रोटीन अभिव्यक्ति और बातचीत में विविधता के कारण कुछ हद तक व्यक्तिपरक है. Cytometric प्रवाह युग्मनBiFC पद्धति के साथ विश्लेषण, फ्लोरोसेंट BiFC प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के संकेत सही एक कम समय में कोशिकाओं की एक बड़ी मात्रा के लिए मापा जा सकता है. यहाँ, हम AKAP-एलबीसी के साथ बातचीत के लिए आवश्यक हैं कि PDE4D3 में क्षेत्रों नक्शा करने के लिए इस पद्धति की एक आवेदन प्रदर्शन. यह उच्च throughput कार्यप्रणाली प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत विनियमित कि स्क्रीनिंग कारकों के लिए लागू किया जा सकता है.

Introduction

650,000 प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत सामान्य कोशिका कार्यों 1,2 को बनाए रखने में महत्वपूर्ण भूमिका निभा रहा है, मानव interactome में मौजूद होने का अनुमान है. सह immunoprecipitation इसके अलावा (सह आईपी), सोने के मानक (पीसीए) 3 कोशिकाओं के अंदर प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का पता लगाने में संवेदनशीलता में सुधार करने के लिए विकसित किया गया है, सेल lysate से कई प्रोटीन टुकड़ा पूरक assays के प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने के लिए. तकनीक Forster प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट), bioluminescence प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (ब्रेट), और Bimolecular प्रतिदीप्ति complementation (BiFC) 4,5 शामिल हैं. हर एक संभावित बातचीत प्रोटीन साथी (इस उदाहरण में हम AKAP-एलबीसी और PDE4D3 उपयोग) के लिए जुड़े हुए हैं कि, BiFC एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन के दो टुकड़े (एक YFP संस्करण यहाँ हम वीनस का उपयोग करें) की मदद की सहयोग पर आधारित है. च से देखे जा सकते हैं जो कार्यात्मक प्रतिदीप्ति में कोशिकाओं के परिणाम के अंदर ब्याज की दो प्रोटीन की बातचीतरहते हैं या तय कोशिकाओं 6,7,8 या तो उपयोग कर luorescence माइक्रोस्कोपी. अन्य PCAs की तुलना में, BiFC जीवित कोशिकाओं में सेलुलर स्थानीयकरण का अध्ययन करने की क्षमता के साथ, संवेदनशील और कम तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है. इस तकनीक का एक प्रमुख दोष यह है कि हालांकि एक बार का गठन, फ्लोरोसेंट प्रोटीन जटिल उलट नहीं किया जा सकता है. इसलिए यह गतिशील प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक अच्छा तरीका नहीं है. इस पत्र में, हम वीनस की प्रतिदीप्ति तीव्रता निगरानी द्वारा AKAP-एलबीसी के साथ PDE4D3 की बातचीत साइटों नक्शा करने BiFC का उपयोग करें. (स्वचालित उच्च throughput मशीनरी का उपयोग किया जाता है, अगर नहीं) समय लेने वाली और श्रम प्रधान है जो प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर परंपरागत विश्लेषण की तुलना में, प्रवाह cytometry, एक कम समय 9 से अधिक एक विषम जनसंख्या में कोशिकाओं के हजारों की एक सरल मात्रात्मक विश्लेषण प्रदान करता है 10. इधर, प्रवाह cytometric-BiFC विश्लेषण और सह आईपी पारंपरिक का एक पक्ष द्वारा साइड तुलना बाहर ले जाने से, हमें पता चलता है कि दो मीटरethods तुलनीय डेटा प्रदान करते हैं, तथापि, प्रवाह cytometric BiFC विश्लेषण में काफ़ी समय कम है और ब्याज की कोशिकाओं को सीमित कर रहे हैं जब अधिक उपयोगी हो सकता है जो कम सामग्री का उपयोग करता है.

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Protocol

1. सेल अभिकर्मक

  1. अभिकर्मक पहले प्लेट कोशिकाओं दिन, immunofluorescence के लिए कम कोशिकाओं चढ़ाना.
    1. Immunofluorescence के लिए: 6 अच्छी तरह से थाली, कोट गिलास को कवर फिसल जाता है में (1 अच्छी तरह से प्रति) कम से कम 4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 0.02% जिलेटिन के साथ, मध्यम के साथ एक बार धोने, और प्रत्येक के लिए अच्छी तरह, प्लेट 1 एक्स 10 5 HEK 293T 2 मिलीलीटर पूरा मध्यम विकास में कोशिकाओं [Dulbecco संशोधित ईगल मीडिया (DMEM) प्लस 10% एफबीएस].
    2. प्रवाह cytometric और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए: थाली 1.2 5 HEK 293T कोशिकाओं / अच्छी तरह से 6 अच्छी तरह से थाली (24 अच्छी तरह से थाली में अच्छी तरह से प्रति 0.5 मिलीग्राम पूरा मध्यम विकास में 0.3 एक्स 10 5 HEK 293T कोशिकाओं में 2 मिलीलीटर पूरा मध्यम विकास में x 10 ).
  2. निर्माण के प्रोटोकॉल के अनुसार अभिकर्मक के लिए डीएनए तैयार: Effectene (Qiagen) immunofluorescence के लिए प्रयोग किया जाता है. पारगमन LT1 (Mirus) प्रवाह cytometric और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए प्रयोग किया जाता है. इस्तेमाल किया डीएनए की मात्रा नीचे सूचीबद्ध है.
    24 अच्छी तरह से थाली (एनजी) 6 अच्छी तरह से थाली (एनजी)
    पाकिस्तानी वेक्टर 10 50
    वी.एन. एन AKAP-एलबीसी 200 1000
    कुलपति एन PDE4D3-FL (पूर्ण लंबाई PDE4D3) 2.5, 5, 10, 20, 40, 80 100
    कुलपति एन PDE4D3-UCR1 (UCR1 डोमेन युक्त PDE4D3 एन टर्मिनल टुकड़ा) 100
    कुलपति एन PDE4D3-UCR2 + कैट (UCR2 और उत्प्रेरक डोमेन युक्त PDE4D3 सी टर्मिनल टुकड़ा) 100
    अभिकर्मक Effectene (6 अच्छी तरह से) का उपयोग:
    1. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए संकेत प्लास्मिड डीएनए की राशि + 4 μl बढ़ाने 100 μl बफर चुनाव आयोग के लिए, मिश्रण, और सेते जोड़ें.
    2. पर 10 मिनट के लिए 5 μl Effectene, मिश्रण, और सेते जोड़ेंकमरे के तापमान. जोड़ें कोशिकाओं को छोड़ के लिहाज से.
    : ट्रांजिट-LT1 (6-well/24-well) का उपयोग अभिकर्मक
    1. एक बाँझ ट्यूब में Opti-सदस्य मैं सीरम मुक्त माध्यम से 250 μl/50 μl को प्लाज्मिड डीएनए के संकेत राशि जोड़ें.
    2. पतला डीएनए मिश्रण करने के लिए पारगमन LT1 अभिकर्मक जोड़ें और मिश्रण को धीरे विंदुक. (पारगमन LT1 अभिकर्मक: डीएनए अनुपात डीएनए की 1 ग्राम प्रति पारगमन LT1 अभिकर्मक के 3 μl है).
    3. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते हैं और कोशिकाओं को छोड़ के लिहाज से जोड़ें.

2. फ्लो, वेस्टर्न ब्लाट, और इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए सेल तैयार

  1. 24 घंटे बाद अभिकर्मक, कोशिकाओं कटाई से पहले epifluorescence खुर्दबीन के नीचे प्रतिदीप्ति जांच ले.
  2. प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए सेल की तैयारी:
    1. 24-well/6-well प्लेटों के लिए 0.5 मिलीग्राम / 2 मिलीलीटर ठंडा पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें.
    2. 50 μl/250 μl 0.05% trypsin का उपयोग कोशिकाओं को अलग करें.
    3. 200 μl / 1 मिलीलीटर DMEM मध्यम के साथ trypsin बेअसर.
    4. सह5 मिनट के लिए 500 XG पर centrifugation द्वारा llect 250 μl कोशिकाओं (दोनों 24 अच्छी तरह से और 6 अच्छी तरह से थाली के लिए), पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए शेष कोशिकाओं (1 एमएल) का उपयोग करें.
    5. 250 μl FACS बफर में कोशिकाओं Resuspend [पीबीएस + 0.5% (w / v) बीएसए 2 मिमी EDTA] प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए बर्फ पर दुकान. प्रवाह cytometry विश्लेषण तत्काल नहीं होगा यदि कोशिकाओं को भी (पीबीएस में) 1% paraformaldehyde में तय किया जा सकता है.
  3. पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए सेल की तैयारी: प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए सेल तैयारी के साथ समानांतर में किए गए.
    1. 2 मिलीलीटर ठंडा पीबीएस के साथ 1x कोशिकाओं को धो लें, सेल lysis बफर के 100 μl [10 मिमी सोडियम फास्फेट बफर, पीएच 6.95, 150 मिमी NaCl, 5 मिमी EDTA, 5 मिमी EGTA, 1% ट्राइटन X-100] जोड़कर कोशिकाओं lyse .
    2. 4 पर 21,000 XG पर 10 मिनट के लिए centrifugation द्वारा सेल lysate लीजिए डिग्री सेल्सियस
    3. , ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख द्वारा प्रोटीन एकाग्रता यों एसडीएस पृष्ठ के लिए लेन प्रति प्रोटीन के बराबर मात्रा में लोड, और immunoblotting के लिए nitrocellulose को हस्तांतरण.
    4. Immunofluorescence के लिए सेल तैयारी.
      1. 2 मिलीलीटर पीबीएस के साथ 3x कोशिकाओं कुल्ला, कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 3.7% paraformaldehyde (पीबीएस में) के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं को ठीक है, तो 5 मिनट के लिए 2 मिलीलीटर पीबीएस के साथ 3x धो लो.
      2. बढ़ते माध्यम का उपयोग कर, एक गिलास स्लाइड पर पर्ची कवर माउंट. यदि आवश्यक हो तो नेल पॉलिश का उपयोग coverslip किनारों को सील.
      3. परीक्षा डिग्री सेल्सियस से पहले 4 में स्लाइड्स स्टोर.

    3. फ्लो और Immunofluorescence माइक्रोस्कोपी

    1. प्रवाह cytometry एक Beckman कल्टर सियान 488 एनएम से लैस ADP,, 405 एनएम और 642 एनएम ठोस राज्य पराबैंगनीकिरण प्रयोग किया जाता है. शिखर सम्मेलन सॉफ्टवेयर के अधिग्रहण और विश्लेषण के लिए प्रयोग किया जाता है.
      1. मानक मोती का उपयोग कर प्रवाह cytometer जांचना.
      2. Gating के जीवित कोशिका आबादी के लिए एक रेखीय पैमाने पर प्लॉट फॉरवर्ड तितर बितर (एफएससी) / बगल की ओर तितर बितर (एसएससी).
      3. Gating के गैर एकत्रित रहते सेल आबादी के लिए प्लॉट वोल्टेज / FSC पल्स चौड़ाई.
      4. प्लॉट count/FL6 (पाकिस्तानी fluorescencgating के गैर एकत्रित जीवित पाकिस्तानी पॉजिटिव कोशिकाओं के लिए एक लॉग पैमाने पर ई, 405 एनएम).
      5. BiFC तीव्रता के लिए एक लॉग पैमाने पर प्लॉट count/FL1 (YFP प्रतिदीप्ति, 488 एनएम).
      6. एफएससी, एसएससी, FL1 और FL6 फोटो गुणक ट्यूब (पीएमटी) प्रत्येक संकेत के लिए सीमा निर्धारित करने के लिए वोल्टेज समायोजित, YFP-पाकिस्तानी डबल नकारात्मक नमूने चलाएँ.
      7. भागो (दोनों YFP + और पाकिस्तानी) के लिए नमूने भविष्य बंद लाइन मुआवजा सकारात्मक एकल
      8. विश्लेषण के लिए कम से कम 10,000 गेटेड घटनाओं (गैर एकत्रित जीवित पाकिस्तानी + कोशिकाओं) का मोल.
    2. . Immunofluorescence माइक्रोस्कोपी एक Zeiss LSM 510 confocal खुर्दबीन नोट का उपयोग किया जाता है: यह सभी सेटिंग्स के बीच लगातार (जैसे ज़ूम, पिनहोल, डिटेक्टर लाभ, एम्पलीफायर ऑफसेट, फ्रेम आकार, स्कैन गति, स्कैन औसत, और लेजर शक्ति के रूप में) रखने के लिए महत्वपूर्ण है सभी डेटा की उचित तुलना के लिए नमूने.

    4. डेटा विश्लेषण (शिखर सम्मेलन सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रदर्शन)

    1. Acquisit के लिए है कि इसी तरह विश्लेषण प्रोटोकॉल सेट करेंउचित gating के साथ आयन:
      जीवित कोशिकाओं के लिए एफएससी / एसएससी डॉट साजिश में गेट 1.
      गैर एकत्रित जीवित कोशिकाओं के लिए 1 गेट के एफएससी / पल्स चौड़ाई में गेट 2.
      गैर एकत्रित पाकिस्तानी + रहते कोशिकाओं के लिए गेट 3 की गिनती / रवांडा में गेट 3.
    2. YFP और YFP + और पाकिस्तानी + एकल सकारात्मक कोशिकाओं का उपयोग पाकिस्तानी संकेत क्षतिपूर्ति.
    3. पाकिस्तानी / YFP पॉजिटिव कोशिकाओं के लिए फिर से निर्धारित कट ऑफ लाइनों.
    4. निर्यात YFP रवांडा के प्रतिदीप्ति तीव्रता (एमएफआई) + डेटा की साजिश रचने के लिए एक्सेल में कोशिकाओं का मतलब.
    5. AKAP-एलबीसी, PDE4D3 की अभिव्यक्ति के स्तर को YFP एमएफआई मानक के अनुसार, और पश्चिमी धब्बा द्वारा निर्धारित रूप में, α-ट्यूबिलिन नियंत्रण लोड हो रहा है.

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Representative Results

AKAP-एलबीसी और PDE4D3 निर्माणों (चित्रा 1 बी) क्रमशः, वी.एन. और कुलपति टुकड़े के लिए जुड़े हुए थे. AKAP-एलबीसी और कार्यात्मक YFP प्रतिदीप्ति (चित्रा 1 ए) में PDE4D3 परिणाम की बातचीत. यहाँ हम PDE4D3 में नक्शा AKAP-एलबीसी बाध्यकारी साइटों के लिए BiFC विधि का उपयोग करें. अपस्ट्रीम संरक्षित क्षेत्र 1 (UCR1), नदी के ऊपर संरक्षित क्षेत्र 2 (UCR2) और उत्प्रेरक क्षेत्र (कैट) PDE4D3 के बंधन साइट स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया गया है, इसलिए पूरी लंबाई (FL), UCR1 और UCR2 प्लस कैट, PDE4 परिवार प्रोटीन के बीच में संरक्षित कर रहे हैं AKAP-एलबीसी के लिए. अलग तीव्रता (चित्रा 1C) के साथ वी.एन.-AKAP-एलबीसी और प्रतिदीप्ति में HEK 293T कोशिकाओं परिणामों में कुलपति PDE4D3-टुकड़े की अभिव्यक्ति. BiFC UCR1 और UCR2 दोनों + कैट AKAP-एलबीसी के साथ PDE4D3 की बातचीत में योगदान इंगित करता है. AKAP-एलबीसी-UCR1 बातचीत से उत्पन्न ग्रेटर प्रतिदीप्ति तीव्रता, AKAP-एलबीसी-UCR2 + कैट की तुलना में जब, PDE-UCR1 PDE-UCR2 + कैट से बेहतर AKAP-एलबीसी बांध को इंगित करता है.

(2A चित्रा), और सेल समुच्चय एसएससी बनाम पल्स चौड़ाई डबल डॉट (चित्रा 2 बी) का उपयोग करके बाहर रखा गया है का उपयोग कर विश्लेषण से बाहर रखा गया है. अकेले BiFC संकेत या CFP अभिव्यक्ति के साथ कोशिकाओं यू थेपता मुआवजा निर्धारण और प्रतिदीप्ति (आंकड़े -2 सी 2 एफ) के बिना कोशिकाओं के लिए कट ऑफ के लिए. पाकिस्तानी वेक्टर BiFC निर्माणों और पाकिस्तानी अभिव्यक्ति सफल अभिकर्मक इंगित करने के लिए एक सकारात्मक मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया गया था के साथ सह ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था. केवल पाकिस्तानी + कोशिकाओं BiFC प्रतिदीप्ति की माप के लिए इस्तेमाल किया गया. पाकिस्तानी संकेत (3B चित्रा) अपरिवर्तित रहा जबकि PDE4D3 की बढ़ती मात्रा के अभिकर्मक, बढ़ वीनस (YFP) BiFC संकेत (चित्रा 3) में हुई. वी.एन.-AKAP-एलबीसी और उपकुलपति PDE4D3 की बढ़ती मात्रा की अभिव्यक्ति पश्चिमी धब्बा (चित्रा -3 सी) के द्वारा पुष्टि की गई. कुल मिलाकर, बढ़ PDE अभिव्यक्ति PDE अभिव्यक्ति के स्तर (चित्रा 3 डी) के लिए correlating BiFC प्रतिदीप्ति की एक रेखीय वृद्धि हुई. इन परिणामों BiFC का मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता (एमएफआई) को मापने के द्वारा AKAP-एलबीसी-PDE4D3 बातचीत यों तो प्रवाह cytometry का उपयोग मान्य. इसलिए हम PDE4D भीतर नक्शा AKAP-एलबीसी बाध्यकारी साइटों के लिए इस पद्धति का इस्तेमाल किया3 वी.एन.-AKAP-एलबीसी और उपकुलपति PDE4D3 निर्माणों का उपयोग कर. कुलपति PDE4D3-FL और उपकुलपति PDE4D3-UCR1 (चित्रा 4 बी) की तुलना में जब चित्रा 1C, वी.एन.-AKAP-एलबीसी और उपकुलपति PDE4D3-UCR2 की अभिव्यक्ति में हमारी टिप्पणियों के साथ संगत + कैट कम BiFC संकेत में हुई. इसी तरह के प्रोटीन अभिव्यक्ति सभी प्रवाह नमूने (चित्रा 4C) में मनाया और प्रतिदीप्ति AKAP-एलबीसी, PDE4D3, और α-ट्यूबिलिन के रिश्तेदार अभिव्यक्ति के स्तर को सामान्यीकृत था मतलब था. इसलिए, सामान्यीकृत BiFC एमएफआई AKAP-एलबीसी-PDE4D3-FL और AKAP-एलबीसी-PDE4D3-UCR1 बीच प्रतिदीप्ति तीव्रता में कोई अंतर नहीं है कि इंगित करता है, लेकिन AKAP-एलबीसी-PDE4D3-UCR2 + कैट बातचीत (चित्रा -4 ए के लिए बहुत कम संकेत ). इन परिणामों AKAP-एलबीसी के साथ बातचीत कि PDE4D3 में कई क्षेत्रों सुझाव है कि वहाँ है, और PDE4D3-UCR1 AKAP-एलबीसी के साथ बातचीत का प्राथमिक क्षेत्र है. इस परिणाम में भी प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के लिए सोने के मानक (चित्रा 5), सह आईपी द्वारा पुष्टि की गई.

चित्रा 1
चित्रा 1. Immunofluorescence माइक्रोस्कोपी द्वारा AKAP-एलबीसी-PDE4D3 टुकड़ा बातचीत की BiFC विश्लेषण. Bimolecular प्रतिदीप्ति complementation के ए) योजनाबद्ध प्रतिनिधि (BiFC). वीनस टुकड़े, वी.एन. और कुलपति क्रमशः AKAP-एलबीसी और PDE4D3 के लिए जुड़े हुए हैं. कार्यात्मक YFP प्रतिदीप्ति में AKAP-एलबीसी-PDE4D3 बातचीत का परिणाम है. मैपिंग के लिए इस्तेमाल किया PDE4D3 निर्माणों की बी) योजनाबद्ध आरेख. सी) ट्रांसफ़ेक्ट HEK 293T कोशिकाओं के प्रतिनिधि BiFC संकेत. प्रकोष्ठों वी.एन.-AKAP-एलबीसी और BiFC विश्लेषण के लिए कुलपति PDE4D3 निर्माणों (FL, UCR1, UCR2 + कैट) के साथ सह ट्रांसफ़ेक्ट थे. पाकिस्तानी वेक्टर भी एक अभिकर्मक मार्कर के रूप में सह ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था. 24 घंटे बाद अभिकर्मक, कोशिकाओं इमेजिंग के लिए तय किया गया. हरे और पाकिस्तानी मर्ज किए गए आंकड़े में pseudocolor लाल रंग में दिखाया गया है में BiFC संकेत दिखाया गया है. 9/50529fig1large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
चित्रा 2. फाटकों और FACS विश्लेषण के लिए मुआवजे का निर्धारण. मुआवजा. डी से पहले साउदी (पाकिस्तानी + कोशिकाओं) व्यक्त ए) FSC बनाम एसएससी डॉट गेट जीवित कोशिकाओं को साजिश और मलबे और मृत कोशिकाओं को बाहर. बी) साइड तितर बितर बनाम पल्स चौड़ाई डॉट साजिश गेट एकल कक्षों के लिए और करने के समुच्चय को बाहर. सी) कक्ष YFP के मुआवजे के बाद पाकिस्तानी (पाकिस्तानी + कोशिकाओं) व्यक्त) कक्ष. YFP अभिव्यक्ति के साथ कोशिकाओं के लिए कट ऑफ लाइन को फिर से निर्धारित किया गया था. ई) मुआवजा. एफ से पहले BiFC संकेत (YFP + कोशिकाओं) के साथ कोशिकाओं) पाकिस्तानी मुआवजे के बाद BiFC संकेत (YFP + कोशिकाओं) के साथ कोशिकाओं. पाकिस्तानी अभिव्यक्ति के साथ कोशिकाओं के लिए कट ऑफ लाइन को फिर से निर्धारित किया गया था.लक्ष्य = "_blank"> बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
चित्रा 3. PDE4D3 अभिव्यक्ति की राशि अलग से BiFC-फ्लो का उपयोग कर AKAP-एलबीसी-PDE4D3 बातचीत का विश्लेषण. ए) के कुलपति PDE4D3 की बढ़ती मात्रा के साथ ट्रांसफ़ेक्ट पाकिस्तानी + कोशिकाओं के अंदर BiFC संकेत में वृद्धि. प्रकोष्ठों साउदी (10 एनजी), वी.एन.-AKAP-एलबीसी (200 एनजी) और उपकुलपति PDE4D3 की बढ़ती मात्रा (2.5 एनजी 80 एनजी) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे. गैर एकत्रित पाकिस्तानी + रहते कोशिकाओं gated थे और YFP प्रतिदीप्ति फॉरवर्ड YFP बनाम स्कैटर डबल डॉट साजिश के रूप में दिखाया गया है. YFP + कोशिकाओं हरे रंग में दिखाया गया है. प्रदर्शन 5 एनजी, 20 एनजी, और 80 एनजी कुलपति PDE4D3 से प्रतिनिधि डेटा. बी) जीवित कोशिकाओं में पाकिस्तानी प्रतिदीप्ति सभी नमूनों के बीच लगातार पाकिस्तानी प्रतिदीप्ति संकेत है, पाकिस्तानी बनाम आगे तितर बितर डबल डॉट साजिश के रूप में दिखाया गया है दिखाया गया है. सी) पश्चिमी धब्बा विश्लेषण PDE4D3 expressio में वृद्धिएन AKAP-एलबीसी और α-ट्यूबिलिन (एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है) के अनुरूप अभिव्यक्ति के साथ. डी) वीनस (YFP) पाकिस्तानी की प्रतिदीप्ति तीव्रता (एमएफआई) मीन + कोशिकाओं कुलपति PDE4D3 अभिव्यक्ति के साथ जोड़ा जाता है. पाकिस्तानी + कोशिकाओं से YFP एमएफआई दोनों के गुना परिवर्तन गैर एकत्रित जीवित कोशिकाओं से पाकिस्तानी एमएफआई गुना परिवर्तन के साथ साजिश रची है. वेस्टर्न ब्लॉट की छवि जम्मू विश्लेषण द्वारा निर्धारित कुलपति PDE4D3 के सापेक्ष अभिव्यक्ति के स्तर को भी योजना बनाई है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 4
4 चित्रा. PDE4D3-FL, PDE4D3-UCR1, PDE4D3-UCR2 + कैट फ्लो का उपयोग करने के साथ AKAP-एलबीसी बातचीत की BiFC विश्लेषण. ए) AKAP-एलबीसी-PDE4D3 टुकड़ा बातचीत प्रोटीन अभिव्यक्ति (AKAP-एलबीसी, PDE4D3 टुकड़े और लदान नियंत्रण α-ट्यूबिलिन) के लिए सामान्यीकृत वीनस-एमएफआई द्वारा मात्रा निर्धारित किया गया था. डीBiFC संकेत में ifference विचरण का एक तरह से विश्लेषण (एनोवा) द्वारा जांच की गई एक पी मूल्य 0.05 ट्रांसफ़ेक्ट HEK 293T में नहीं महत्वपूर्ण (एन एस). बी) के प्रतिनिधि BiFC संकेत माना जाता है <एपी मूल्य जबकि 0.01 (**) बहुत ही महत्वपूर्ण माना जाता है> कोशिकाओं. HEK 293T कोशिकाओं रवांडा, वी.एन.-AKAP-एलबीसी और उपकुलपति PDE4D3 निर्माणों (FL, UCR1, UCR2 + कैट) के साथ सह ट्रांसफ़ेक्ट थे. गैर एकत्रित जीवित पाकिस्तानी + कोशिकाओं gated थे, और उनके BiFC प्रतिदीप्ति फॉरवर्ड YFP बनाम में तितर बितर डबल डॉट साजिश दिखाया गया है. सी) AKAP-एलबीसी और PDE4D3-टुकड़े के तुलनीय अभिव्यक्ति का संकेत पश्चिमी धब्बा. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 5
चित्रा 5. सह immunoprecipitation द्वारा फ्लो विश्लेषण की पुष्टि. HEK 293T कोशिकाओं सह ट्रांसफ़ेक्ट गयावी 5-AKAP-एलबीसी और GFP PDE4D3 निर्माणों (FL, UCR1, UCR2 + कैट) की अभिव्यक्ति के लिए. 48 घंटे बाद अभिकर्मक, AKAP-एलबीसी वी 5-agarose मोती का उपयोग कर immunoprecipitated था. PDE4D3-FL के बंधन, UCR1 और UCR2 + कैट विरोधी GFP प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग एसडीएस पृष्ठ और पश्चिमी धब्बा द्वारा खोजा गया था. immunoprecipitation के लिए इस्तेमाल इसी PDE4D3 इनपुट भी सभी PDE4D3-टुकड़े के लिए इसी तरह की अभिव्यक्ति का संकेत देते हुए दिखाया गया है.

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Discussion

BiFC प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक सरल और संवेदनशील तरीका है. इस विधि नए प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की पहचान करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है, तथापि, यह कोशिकाओं के अंदर प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की पुष्टि करने और कार्यात्मक गुणों का अध्ययन करने के लिए विशेष रूप से सुविधाजनक है, जैसे प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत साइटों के मानचित्रण प्रोटीन परिसरों के subcellular स्थानीयकरण, के रूप में, और प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत न्यूनाधिक कर सकते हैं कि छोटे अणुओं / पेप्टाइड्स की स्क्रीनिंग के लिए. वी.एन. और कुलपति टुकड़े गैर फ्लोरोसेंट होते हैं, क्योंकि पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति इस प्रकार इस परख की संवेदनशीलता सहायता, कम है. समय वी.एन. प्रोटीन कुलपति, प्रोटीन बातचीत परिपक्व / स्थिर करने की जरूरत है, इस प्रकार के प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत दृश्यमान करने के लिए देरी है, और इष्टतम समय अंक इसलिए अनुभव से निर्धारित किया जा सकता है. यह वी.एन. प्रोटीन कुलपति, प्रोटीन बातचीत प्रतिवर्ती नहीं है कि यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए, इसलिए दुर्भाग्य से वर्तमान वीनस BiFC साथ इस परख टी उपयुक्त नहीं है constructsप्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की ओ अध्ययन गतिशील कैनेटीक्स.

उचित नियंत्रण BiFC विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण हैं. एक उपयुक्त नकारात्मक नियंत्रण गैर बातचीत प्रोटीन या प्रासंगिक BiFC वेक्टर में गैर विशिष्ट पेप्टाइड्स, या यदि संभव हो तो, प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत बाधित कि एक उत्परिवर्ती भी शामिल है. यह गैर विशिष्ट उच्च पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति में परिणाम के रूप में खाली BiFC वेक्टर एक अच्छा नियंत्रण नहीं है. BiFC दो बातचीत प्रोटीन में नहीं मनाया जाता है, तो अभिव्यक्ति विश्लेषण किया जाना चाहिए. इसके अलावा, BiFC संकेत प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत साइटों के आधार पर भिन्न हो सकते हैं. यह वी.एन. और कुलपति बातचीत के स्थानिक मॉडुलन भी प्रतिदीप्ति तीव्रता को प्रभावित कर सकता है कि ध्यान दिया जाना चाहिए, इसलिए यह सी टर्मिनल और एन टर्मिनल वी.एन. / कुलपति अभिव्यक्ति निर्माणों दोनों का उपयोग कर BiFC प्रयोगों से बाहर ले जाने के लिए शुरू में महत्वपूर्ण है. उदाहरण के लिए, BiFC प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत ब्लॉक वीनस टुकड़े की फिर से संघ तो नहीं हो सकता है. इसलिए, वी.एन. और कुलपति के कई संयोजनों shoul निर्माणों(सी और एन टर्मिनल प्रोटीन fusions के दोनों IE) का परीक्षण किया जाना चाहते हैं.

BiFC के प्रतिदीप्ति तीव्रता मजबूत बातचीत और कमजोर बातचीत का सुझाव एक कम प्रतिदीप्ति तीव्रता का संकेत उच्च BiFC तीव्रता के साथ, प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की शक्ति के लिए आनुपातिक है. BiFC एमएफआई इसलिए प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के लिए संकेत के रूप में प्रयोग किया जाता है. BiFC से प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का सटीक विश्लेषण के लिए, पश्चिमी धब्बा विश्लेषण कोई प्रोटीन गिरावट सही विश्लेषण के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं, जो हो रहा है विभिन्न निर्माणों के बराबर अभिव्यक्ति सुनिश्चित करने के लिए प्रदर्शन किया और कहा कि है कि बहुत महत्वपूर्ण है. एक ही नमूनों से lysate इसलिए विश्लेषण सभी नमूनों के लिए इसी तरह के प्रोटीन अभिव्यक्ति का निर्धारण करने के लिए पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए पसंद किया जाता है. इसके अतिरिक्त, यह रेखीय अभिव्यक्ति और प्रोटीन की बातचीत सुनिश्चित करने के लिए अभिकर्मक के लिए plasmids के उपयुक्त राशि निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है, और इस श्रृंखला के बीच में, प्रोटीन की बातचीत वाई संबद्धBiFC संकेत वें प्रतिदीप्ति तीव्रता.

प्लाज्मिड रवांडा की कम राशि तो केवल पाकिस्तानी सकारात्मक कोशिकाओं यहाँ विश्लेषण किया गया, सफल अभिकर्मक के लिए एक मार्कर के रूप में प्रयोग किया जाता है. ऐसे आरएफपी के रूप में एक अलग फ्लोरोसेंट प्रोटीन, खून के माध्यम से कम करने के लिए रंग 11 के बीच में इस्तेमाल किया जा सकता है. फ्लो के लिए, एक सकारात्मक कोशिकाओं को मुआवजे के लिए शामिल किए जाने की जरूरत है. यदि संभव हो, कम से कम 10,000 पाकिस्तानी सकारात्मक कोशिकाओं एक अच्छा नमूना आकार सुनिश्चित करने के लिए गिने जाते हैं.

संक्षेप में, यहाँ हम प्रवाह cytometric विश्लेषण के साथ युग्मन BiFC कार्यप्रणाली कोशिकाओं के अंदर प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का एक अच्छा संकेत के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है कि प्रदर्शित करता है. इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग BiFC की पारंपरिक विश्लेषण समय लेने वाली है, और नमूने का आकार cytometric विश्लेषण प्रवाह करने के लिए है कि इसी की तुलना में काफी कम है. अभिकर्मक दक्षता कम होने पर इस प्रकार, BiFC साथ प्रवाह cytometry युग्मन प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के विश्लेषण के लिए फायदेमंद हो सकता है. इस मेंरिपोर्ट में, हम AKAP-एलबीसी के लिए बाध्य करने के लिए PDE4D3 में बातचीत साइटों नक्शा करने BiFC-फ्लो का फायदा उठाया. इस तकनीक को भी अणु या दवाओं की खोज के लिए 12, प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत को बाधित करने या बढ़ाने के लिए हो सकता है कि पेप्टाइड्स के लिए स्क्रीन के लिए बढ़ाया जा सकता है. इस विधि को भी इस तरह के GPCR के 13 के ligand प्रेरित internalization के रूप में कुछ शारीरिक घटनाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

हम महत्वपूर्ण प्रायोगिक मूल्यांकन और चर्चा के लिए यूआईसी पर O'Bryan प्रयोगशाला धन्यवाद. नैदानिक ​​और translational विज्ञान अनुदान UL1TR000050 के लिए यूआईसी केंद्र - इस काम translational विज्ञान में आगे बढ़ने के लिए GKC और राष्ट्रीय केन्द्र के लिए अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन अनुदान 11SDG5230003 द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Dulbecco’s modified Eagle’s media (DMEM) Invitrogen 11965-092
Penicilin-Streptomycin (pen/strep), 100x Invitrogen 15070-063
Fetal Bovine Serum (FBS) Invitrogen 16000-044
Anti-Flag antibody Sigma M2, F1804
Anti-HA antibody Covance 16B12, MMS-101R
α-tubulin Sigma DM1A, T9026
Anti-GFP antibody Clontech 632569
Cell culture plates, 6-well tissue culture treated Thermo Fisher Scientific 130184
HEK 293T cells ATCC CRL-11268
Maxiprep plasmid purification kit, high speed Qiagen 12663
Dulbecco’s Phosphate-buffered saline (DPBS), sterile 1x Invitrogen 14190-144
Trypsin-EDTA, 0.05% (w/v) Gibco 25300
Polystyrene round-bottom tubes for FACS staining BD Biosciences 352052
Paraformaldehyde Fisher Scientific S74337MF
Prolong gold antifade reagent with DAPI Invitrogen P-36931
Superfrost plus Microscope slides Fisher Scientific 12-550-15
Fisherfinest premium cover glass Fisher Scientific 12-548-5P
EQUIPMENT
CO2 air-jacketed Incubator NuAIR DH autoflow
Confocal microscope LSM510 META Carl Zeiss, Inc
Electrophoresis and transfer unit Biorad
Cyan ADP Flow Cytometer Beckman Coulter

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References

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आण्विक जीवविज्ञान अंक 78 जैव रसायन सेलुलर जीव विज्ञान जेनेटिक्स औषध विज्ञान प्रोटीन फ्लो Bimolecular प्रतिदीप्ति complementation BiFC quantative विश्लेषण प्रोटीन प्रोटीन बातचीत Forster प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण Bioluminescence प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण ब्रेट प्रोटीन झल्लाहट सेल अभिकर्मक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी
Bimolecular प्रतिदीप्ति complementation का प्रवाह cytometric विश्लेषण: प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक उच्च Throughput मात्रात्मक विधि
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Wang, L., Carnegie, G. K. Flow… More

Wang, L., Carnegie, G. K. Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction. J. Vis. Exp. (78), e50529, doi:10.3791/50529 (2013).

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