Summary
Durchflusszytometrieanalyse bimolekularer Fluoreszenz Komplementation bietet einen hohen Durchsatz quantitative Methode zur Protein-Protein-Wechselwirkung zu untersuchen. Diese Methode kann zur Zuordnung Proteinbindungsstellen und zum Screening von Faktoren, die Protein-Protein-Interaktion reguliert angewendet werden.
Abstract
Unter den Verfahren zur Protein-Protein-Wechselwirkungen in Zellen zu studieren, ist Bimolekulare Fluoreszenz Komplementation (BiFC) relativ einfach und empfindlich. BiFC ist auf die Erzeugung von Fluoreszenz mit zwei nicht-fluoreszierenden Fragmente eines fluoreszierenden Proteins (Venus, gelb fluoreszierendes Protein Variante wird hier verwendet werden). Nicht fluoreszierende Venus Fragmente (VN und VC) mit zwei interagierende Proteine (in diesem Fall AKAP-Lbc und PDE4D3) fusioniert, wodurch Fluoreszenz aufgrund VN-AKAP-LBC-VC-PDE4D3 Interaktion und der Bildung eines funktionellen fluoreszierendes Protein innerhalb der Zellen.
BiFC liefert Informationen über die subzelluläre Lokalisation von Proteinkomplexen und der Stärke der Protein-Wechselwirkungen auf Fluoreszenzintensität. Allerdings ist BiFC Analyse unter Verwendung der Mikroskopie, die Stärke der Protein-Protein-Interaktion zu quantifizieren zeitaufwendig und etwas subjektiv durch Heterogenität in der Proteinexpression und Interaktion. Durch die Kopplung durchflusszytometrischenAnalyse BiFC Methodik kann die fluoreszierende BiFC Protein-Protein-Wechselwirkung Signal genau für eine große Anzahl von Zellen in einer kurzen Zeit gemessen werden. Hier zeigen wir eine Anwendung dieser Methode auf Regionen in PDE4D3, die für die Interaktion mit AKAP-Lbc erforderlich sind, abzubilden. Dieser hohe Durchsatz-Screening Methode können Faktoren, die Protein-Protein-Interaktion reguliert angewendet werden.
Introduction
650.000 Protein-Protein-Wechselwirkungen werden geschätzt, um in den menschlichen interactome existieren, spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der normalen Zellfunktionen 1,2. Neben Co-Immunopräzipitation (Co-IP), der Goldstandard Protein-Protein-Interaktion von Zelllysat studieren, mehrere Proteinfragments Komplementierungsassays (PCA) wurden entwickelt, um die Empfindlichkeit bei der Erkennung von Protein-Protein-Interaktion innerhalb der Zellen 3 verbessern. Techniken umfassen Förster-Resonanz-Energie-Transfer (FRET), Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer (BRET) und Fluoreszenz-Komplementation Bimolekulare (BiFC) 4,5. , Die jeweils zu einem potenziellen Partner interagierende Protein (in diesem Beispiel verwenden wir AKAP-Lbc und PDE4D3) verschmolzen sind; BiFC auf dem erleichtert Assoziation von zwei Fragmente eines fluoreszierenden Proteins (YFP eine Variante hier benutzen wir Venus) basiert. Wechselwirkung der beiden Proteine von Interesse in den Zellen führt zu Funktionsstörungen Fluoreszenz, die sichtbar gemacht werden kann fluorescence Mikroskopie mit entweder live oder fixierten Zellen 6,7,8. Im Vergleich zu anderen PKA ist BiFC empfindlicher und weniger technisch anspruchsvoll, mit Potenzial, die zelluläre Lokalisation in lebenden Zellen zu studieren. Ein wesentlicher Nachteil dieses Verfahrens ist jedoch, daß einmal gebildet, das fluoreszierende Protein-Komplex kann nicht rückgängig gemacht werden. Daher ist es nicht eine gute Methode, um dynamische Protein-Protein-Wechselwirkung zu untersuchen. In diesem Papier, verwenden wir, um die Interaktion BiFC Websites von PDE4D3 mit AKAP-Lbc Karte durch die Überwachung der Fluoreszenz-Intensitäten der Venus. Im Vergleich zu herkömmlichen Analyse mittels Fluoreszenzmikroskopie, die zeitaufwendig und arbeitsintensiv (falls nicht mit automatisierten Hochdurchsatz-Maschinen durchgeführt) ist, bietet die Durchflusszytometrie eine einfache quantitative Analyse von Tausenden von Zellen in einer heterogenen Population über eine kurze Zeit 9, 10. Hier wird durch die Durchführung einer Side-by-Side-Vergleich der Durchflusszytometrie-Analyse und BiFC traditionellen Ko-IP, zeigen wir, dass die beiden methoden vergleichbare Daten ist jedoch durchflusszytometrische Analyse BiFC weniger zeitaufwendig und benötigt weniger Material, das nützlicher sein kann, wenn die Zellen von Interesse sind begrenzt.
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Protocol
1. Zelltransfektion
- Teller Zellen am Tag vor der Transfektion Plattieren weniger Zellen für Immunfluoreszenz.
- Für Immunfluoreszenz: in einer 6-Well-Platte, Mantel Glasdeckgläschen (1 pro Well) mit 0,02% Gelatine bei 37 ° C für mindestens 4 Stunden, einmal abwaschen mit Medium und für jeden gut, Platte 1 x 10 5 HEK 293T Zellen in 2 ml komplettem Wachstumsmedium [Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% FBS].
- Für Durchflusszytometrie und Western-Blot-Analysen: Platte 1,2 x 10 5 HEK 293T Zellen / Vertiefung in 2 ml komplettem Wachstumsmedium in 6-Well-Platte (0,3 x 10 5 HEK 293T-Zellen in 0,5 ml komplettem Wachstumsmedium pro Vertiefung in 24-Well-Platte ).
- Bereiten DNA für die Transfektion gemäß Herstellerangaben Protokoll: Effectene (Qiagen) zur Immunfluoreszenz eingesetzt. TRANSIT-LT1 (Mirus) ist für durchflusszytometrische und Western-Blot-Analysen verwendet. Anzahl der DNA verwendet wird unten aufgeführt.
Transfektion unter Verwendung Effectene (6-well):24-Well-Platte (ng) 6-Well-Platte (ng) CFP-Vektor 10 50 VN N-AKAP-Lbc 200 1000 VC N-PDE4D3-FL (full-length PDE4D3) 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 100 VC-N PDE4D3-UCR1 (a PDE4D3 N-terminale Fragment mit dem UCR1 Domain) 100 VC-N PDE4D3-UCR2 + CAT (a PDE4D3 C-terminalen Fragments mit den UCR2 und katalytischen Domänen) 100 - In angegebene Menge von Plasmid-DNA + 4 ul Enhancer zu 100 ul Puffer EC, Mischung und Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur.
- In 5 ul Effectene, Mischung und Inkubation für 10 min beiRaumtemperatur. In den Zellen tropfenweise.
- In angegebene Menge an Plasmid-DNA zu 250 ul μl/50 Opti-MEM I serumfreiem Medium in ein steriles Röhrchen.
- In TRANSIT-LT1 Reagenz zu der verdünnten DNA-Gemisch und Pipette vorsichtig mischen. (Transit-LT1 Reagenz: DNA-Verhältnis ist 3 ul TransIT-LT1 Reagenz pro 1 ug DNA).
- Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur und fügen Sie tropfenweise zu den Zellen.
2. Handy Vorbereitung für die Durchflusszytometrie, Western Blot und Immunfluoreszenz
- 24 Stunden nach der Transfektion überprüfen Fluoreszenz unter Epifluoreszenzmikroskop Zellen vor der Ernte.
- Zellpräparat zur durchflusszytometrische Analyse:
- Waschen der Zellen mit 0,5 ml / 2 ml eiskaltem PBS 24-well/6-well Platten.
- Trennen Zellen mit 50 μl/250 ul 0,05% Trypsin.
- Neutralisieren Trypsin mit 200 ul / 1 ml DMEM-Medium.
- Collect 250 ul Zellen (sowohl für 24-Well-und 6-Well-Platte) durch Zentrifugation bei 500 xg für 5 min, verwenden Sie die restlichen Zellen (1 ml) für Western-Blot-Analyse.
- Die Zellen in 250 ul FACS-Puffer [PBS + 0,5% (w / v) BSA + 2 mM EDTA], auf Eis lagern für durchflusszytometrische Analyse. Die Zellen können auch in 1% Paraformaldehyd fixiert werden (in PBS), wenn Durchflusszytometrie nicht sein wird sofort.
- Handy Vorbereitung für Western-Blot-Analyse: parallel durchgeführten mit Zellpräparat zur Durchflusszytometrie.
- Waschen der Zellen 1x mit 2 ml eiskaltem PBS lysiert Zellen durch Zugabe von 100 ul Lysepuffer [10 mM Natriumphosphat-Puffer, pH 6,95, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 1% Triton X-100] .
- Sammeln Zelllysat durch Zentrifugation für 10 min bei 21.000 × g bei 4 ° C.
- Quantifizierung Protein-Konzentration von Bradford-Protein-Assay, laden Sie gleiche Mengen von Protein pro Spur für SDS-PAGE und Transfer auf Nitrozellulose für Immunoblot.
- Zellpräparat zur Immunfluoreszenz.
- Spülen Zellen 3x mit 2 ml PBS, fixieren Zellen in 1 ml 3,7% Paraformaldehyd (in PBS) für 10 min bei Raumtemperatur, dann waschen mit 2 ml PBS 3x für 5 min.
- Montieren Deckglas auf einem Objektträger aus Glas, mit Montage Medium. Deckglasränder Kanten mit Nagellack, wenn nötig.
- Bewahren Sie die Objektträger bei 4 ° C vor der Prüfung.
3. Durchflusszytometrie und Immunfluoreszenz-Mikroskopie
- Durchflusszytometrie unter Verwendung eines Beckman Coulter Cyan ADP mit 488 nm ausgestattet, 405 nm und 642 nm Festkörperlaser. Summit Software zur Erfassung und Analyse verwendet.
- Kalibrieren Durchflusszytometer unter Verwendung von Standard-Perlen.
- Grundstück Vorwärtsstreuung (FSC) / Seitwärts Streulicht (SSC) auf einer linearen Skala für Gating Live-Zell-Population.
- Plot FSC / Spannungsimpulsbreite für Gating nicht aggregierten Live-Zell-Population.
- Grundstück count/FL6 (CFP fluorescence, 405 nm) auf einer logarithmischen Skala für Gating nicht aggregierten Live-GFP-positiven Zellen.
- Grundstück count/FL1 (YFP Fluoreszenz, 488 nm) auf einer logarithmischen Skala für BiFC Intensität.
- Führen YFP-CFP-double negative Proben, stellen FSC, SSC, FL1 und FL6 Photomultiplier (PMT) Spannung, um die Schwelle für jedes Signal gesetzt.
- Führen einzigen positiven (beide YFP und CFP + +) Proben für zukünftige off-line Entschädigung
- Erwerben Sie mindestens 10.000 gated Veranstaltungen (nicht aggregierten Live GFP +-Zellen) für die Analyse.
- Immunfluoreszenzmikroskopie wird unter Verwendung eines Zeiss LSM 510 konfokalen Mikroskop. Hinweis: es ist wichtig, um alle Einstellungen (wie die Zoom, Lochkamera, Detektor Gain Verstärker-Offset, Baugröße, Scan-Geschwindigkeit, Scan-Durchschnitt, und Laserleistung) konsistent zu halten Proben für angemessenen Vergleich aller Daten.
4. Data Analysis (durchgeführt mit Summit Software)
- Richten Sie die Analyse-Protokoll ähnlich wie bei acquisition mit der richtigen Gating:
Gate 1 in FSC / SSC Dot-Plot für lebende Zellen.
Gate 2 in FSC / Pulsbreite von Gate 1 für nicht aggregierte lebenden Zellen.
Gate 3 in count / CFP von Gate 3 für nicht-aggregierten GFP + lebenden Zellen. - Kompensieren YFP und CFP-Signal mit YFP und CFP + + einzigen positiven Zellen.
- Neu zu bestimmen Cut-off-Linien für CFP / YFP-positiven Zellen.
- Export YFP mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) von GFP + Zellen in Excel für Daten-Plotten.
- Normalisieren YFP MFI zu Expression von AKAP-Lbc, PDE4D3 und Ladekontrolle α-Tubulin, wie durch Western Blot bestimmt.
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Representative Results
AKAP-Lbc und PDE4D3 Konstrukte (1B) zu VN und VC Fragmente fusioniert sind. Wechselwirkung von AKAP-Lbc und PDE4D3 führt zu Funktionsstörungen YFP-Fluoreszenz (Abb. 1A). Hier verwenden wir die BiFC Verfahren zur Karte AKAP-LBC-Bindungsstellen in PDE4D3. Stromaufwärts konservierten Region 1 (UCR1) stromaufwärts konservierten Region 2 (UCR2) und katalytischen Bereich (CAT) werden unter PDE4-Proteine konserviert daher Länge (FL), UCR1 und UCR2 plus Katzen Zum Screening wurden die Bindungsstelle von PDE4D3 verwendet zu AKAP-Lbc. Die Expression von VN-AKAP-Lbc und VC-PDE4D3-Fragmente in HEK 293T-Zellen führt zu Fluoreszenz mit unterschiedlicher Intensität (Abbildung 1C). BiFC zeigt an, dass beide UCR1 und UCR2 + CAT auf die Interaktion mit PDE4D3 AKAP-Lbc beitragen. Länger Fluoreszenzintensität aus AKAP-LBC-UCR1 Interaktion, wenn sie AKAP-LBC-UCR2 + CAT verglichen, zeigt an, dass PDE-UCR1 zu AKAP-Lbc bindet besser als PDE-UCR2 + CAT.
(2A) und Zellaggregate wurden mit SSC vs Pulse Width double dot (2B) ausgeschlossen ausgeschlossen. Zellen mit BiFC Signal oder GFP Expression allein waren used zur Bestimmung der Vergütung und Cut-off für Zellen ohne Fluoreszenz (2C-2F). GFP-Vektor wurde mit BiFC Konstrukte und GFP-Expression wurde als positive Marker verwendet werden, um eine erfolgreiche Transfektion zeigen cotransfiziert. Nur GFP +-Zellen wurden für die Messung der Fluoreszenz BiFC verwendet. Transfektion von zunehmenden Mengen von PDE4D3 wurden erhöhte Venus (YFP) BiFC Signal (3A), während GFP-Signal unverändert (Abbildung 3B). Expression von VN-AKAP-Lbc und steigenden Mengen an VC-PDE4D3 wurde durch Western-Blot (Abbildung 3C) bestätigt. Insgesamt erhöhte PDE Expression führte zu einem linearen Anstieg der Fluoreszenz korreliert BiFC PDE Expression (Abbildung 3D). Diese Ergebnisse validiert die Verwendung von Durchflusszytometrie zu AKAP-LBC-PDE4D3 Interaktion durch Messung der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) von BiFC quantifizieren. Wir haben daher diese Methode auf Karte AKAP-Lbc Bindungsstellen innerhalb PDE4D3 mit VN-AKAP-Lbc und VC-PDE4D3 Konstrukte. Im Einklang mit unseren Beobachtungen in 1C, Ausdruck der VN-AKAP-Lbc und VC-PDE4D3-UCR2 + CAT führte zu niedrigeren BiFC Signal, wenn an VC-PDE4D3-FL und VC-PDE4D3-UCR1 (4B) verglichen. Ähnliche Protein-Expression wurde in allen Proben Flow (4C) beobachtet und mittlere Fluoreszenz der relativen Expression von AKAP-Lbc, PDE4D3 und α-Tubulin wurde normalisiert. Daher zeigt die normalisierte BiFC MFI dass es keinen Unterschied in der Fluoreszenzintensität zwischen AKAP-LBC-PDE4D3-FL und AKAP-LBC-PDE4D3-UCR1, aber viel niedriger Signal AKAP-LBC-PDE4D3-UCR2 + CAT Wechselwirkung (4A ). Diese Ergebnisse legen nahe, dass es mehrere Regionen in PDE4D3, die mit AKAP-Lbc interagieren, und dass PDE4D3-UCR1 ist der primäre Bereich der Interaktion mit AKAP-Lbc. Dieses Ergebnis wurde auch durch Co-IP bestätigt, der Goldstandard für Protein-Protein-Wechselwirkung (Abbildung 5).
Abbildung 1. BiFC Analyse AKAP-LBC-PDE4D3-Fragment Interaktion durch Immunfluoreszenzmikroskopie. A) Schematische Vertreter Bimolekulare Fluoreszenz Komplementation (BiFC). Venus Fragmente; VN und VC sind AKAP-Lbc und PDE4D3 verschmolzen sind. AKAP-LBC-PDE4D3 Wechselwirkung führt zu funktionellen YFP Fluoreszenz. B) Schematische Darstellung der PDE4D3 Konstrukte für die Projektion verwendet. C) Repräsentative BiFC Signale von transfizierten HEK 293T-Zellen. Die Zellen wurden mit VN-AKAP-Lbc und VC-PDE4D3 Konstrukte (FL-,-UCR1,-UCR2 + CAT) BiFC Analyse cotransfiziert. CFP-Vektor wurde auch als Transfektion Marker kotransfiziert. 24 h nach der Transfektion wurden die Zellen für die Abbildung fixiert. BiFC Signal wird in grün dargestellt und GFP in Pseudocolor rot in den zusammengeführten Figuren gezeigt. 9/50529fig1large.jpg "target =" _blank "> Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2. Bestimmung von Toren und Entschädigung für FACS-Analyse. A) FSC vs SSC Dot-Plot to gate lebenden Zellen und Trümmer und tote Zellen auszuschließen. B) Side Scatter vs Impulsbreite dot plot to gate Einzelzellen und zum Ausschluss Aggregate. C) Zellen, die GFP (GFP +-Zellen) vor Entschädigung. D ) Zellen, die GFP (GFP +-Zellen) nach YFP Entschädigung. Die Grenzlinie für Zellen mit YFP-Expression wurde erneut bestimmt. E) Zellen mit BiFC Signal (YFP +-Zellen) vor der Kompensation. F) Zellen mit BiFC Signal (YFP +-Zellen) nach GFP Kompensation. Die Grenzlinie für Zellen mit GFP-Expression wurde erneut bestimmt.target = "_blank"> Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3. Analyse von AKAP-LBC-PDE4D3 Wechselwirkung mit BiFC-Durchflusszytometrie durch Variieren der Menge von PDE4D3 Ausdruck. A) erhöht BiFC Signal innerhalb GFP +-Zellen mit steigenden Mengen von VC-PDE4D3 transfiziert. Die Zellen wurden mit GFP (10 ng), VN-AKAP-Lbc (200 ng) und steigenden Mengen an VC-PDE4D3 (2,5 ng bis 80 ng) transfiziert. Nicht aggregierte GFP + Live-Zellen waren gated und YFP Fluoreszenz wird als YFP vs Forward Scatter Doppel Dot-Plot dargestellt. YFP + Zellen werden in grün dargestellt. Repräsentative Daten von 5 ng, 20 ng und 80 ng VC-PDE4D3 gezeigt. B) GFP-Fluoreszenz in lebenden Zellen als GFP vs Forward Scatter Doppel Dot-Plot dargestellt, was im Einklang GFP-Fluoreszenz bei allen Proben. C) Western-Blot-Analyse zeigt, Erhöhung PDE4D3 expression mit konsistenten Ausdruck AKAP-Lbc und α-Tubulin (als Ladekontrolle). D) Venus (YFP) mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) von GFP + Zellen mit VC-PDE4D3 Expression korreliert. Fache Veränderung sowohl YFP MFI von GFP +-Zellen zusammen mit GFP MFI fache Änderung von nicht aggregierten lebenden Zellen aufgetragen. Relative Expression von VC-PDE4D3 von Bild J Analyse der Western-Blot bestimmt werden ebenfalls dargestellt. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
Abbildung 4. BiFC Analyse-AKAP Lbc Interaktion mit PDE4D3-FL, PDE4D3-UCR1, PDE4D3-UCR2 + CAT mittels Durchflusszytometrie. A) AKAP-LBC-PDE4D3-Fragment Interaktion wurde von Venus-MFI normalisiert auf Protein-Expression (AKAP-Lbc, PDE4D3 Fragmente und Ladekontrolle α-Tubulin) quantifiziert. Difference in BiFC Signal wurden durch eine Analyse der Varianz (ANOVA) untersucht Ein p-Wert <0,01 als sehr signifikant (**), während p-Wert> 0,05 als nicht signifikant (ns). B) Repräsentative BiFC Signal in transfizierten HEK 293T Zellen. HEK 293T-Zellen wurden mit GFP, VN-AKAP-Lbc und VC-PDE4D3 Konstrukte (-FL,-UCR1,-UCR2 + CAT) kotransfiziert. Nicht aggregierte Live GFP + Zellen waren gated, und ihre BiFC Fluoreszenz in YFP vs Forward Scatter Doppel Dot-Plot gezeigt. C) Western Blot zeigt vergleichbare Expression von AKAP-Lbc und PDE4D3-Fragmente. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
Abbildung 5. Bestätigung der Durchflusszytometrie-Analyse von Co-Immunopräzipitation. HEK 293T-Zellen wurden kotransfiziertfür die Expression von V5-AKAP-Lbc und GFP-Konstrukte PDE4D3 (-FL,-UCR1,-UCR2 + CAT). 48 Stunden nach der Transfektion wurde AKAP-Lbc immunpräzipitiert mit V5-Agarose-Perlen. Die Bindung von PDE4D3-FL, UCR1 und UCR2 + CAT wurde durch SDS-PAGE und Western-Blot unter Verwendung von anti-GFP primären Antikörper. Die entsprechende PDE4D3 Eingang für die Immunpräzipitation verwendet wird auch gezeigt, was darauf hinweist ähnlichen Ausdruck für alle PDE4D3-Fragmente.
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Discussion
BiFC ist eine einfache und sensitive Methode zur Protein-Protein-Wechselwirkung zu untersuchen. Diese Methode kann verwendet werden, um neue Protein-Protein-Interaktionen zu identifizieren, ist es jedoch besonders günstig, um Protein-Protein-Wechselwirkung innerhalb der Zellen zu bestätigen und funktionellen Eigenschaften zu untersuchen, wie subzelluläre Lokalisation von Proteinkomplexen, die Kartierung von Protein-Protein-Wechselwirkung Sites und für das Screening von kleinen Molekülen / Peptide, die Modulation von Protein-Protein-Wechselwirkung. Weil VN und VC-Fragmente nicht fluoreszierend sind, ist Hintergrund-Fluoreszenz niedrig, damit Hilfe für die Sensitivität dieses Tests. Zeit benötigt wird, um zu reifen / Stabilisierung der VN-Protein-VC-Protein-Wechselwirkung, so gibt es Verzögerung Visualisierung der Protein-Protein-Wechselwirkung, und eine optimale Zeit-Punkte kann müssen deshalb empirisch ermittelt werden. Es sollte auch angemerkt werden, dass VN-Protein-VC-Protein-Wechselwirkung nicht reversibel ist, damit leider mit Strom Venus BiFC Konstrukte dieser Test ist nicht geeignet to dynamischen Studie Kinetik der Protein-Protein-Interaktion.
Proper Kontrollen sind für BiFC Analyse wichtig. Eine geeignete negative Kontrolle enthält nicht-wechselwirkende Proteine oder nicht-spezifische Peptide in dem betreffenden BiFC Vektor, oder, wenn möglich, eine Mutante, die Protein-Protein-Wechselwirkung unterbricht. Leere BiFC Vektor ist nicht eine gute Kontrolle, wie sie in nicht-spezifische hohe Hintergrund-Fluoreszenz führt. Wenn BiFC ist nicht in zwei interagierende Proteine beobachtet, sollte Expression analysiert werden. Auch kann BiFC Signal in Abhängigkeit von den Protein-Protein-Wechselwirkung verantwortlich. Es sollte angemerkt werden, dass die räumliche Modulation der VN und VC Wechselwirkung kann auch die Fluoreszenzintensität werden, deshalb ist es zunächst wichtig, durchzuführen BiFC Versuche sowohl mit C-terminalen und N-terminalen VN / VC Expressionskonstrukte. Zum Beispiel kann, wenn nicht BiFC Protein-Protein-Interaktion blockiert die Re-Assoziation der Venus Fragmente auftreten. Daher baut mehrere Kombinationen von VN und VC Schulterd getestet (dh sowohl C-und N-terminalen Protein-Fusionen) werden.
Fluoreszenzintensität BiFC ist proportional zur Stärke von Protein-Protein-Wechselwirkung, mit höherer Intensität BiFC einem stärkeren Wechselwirkung und eine untere Fluoreszenzintensität schwächere Wechselwirkung hindeutet. BiFC MFI wird daher als Indikator für die Protein-Protein-Wechselwirkungen verwendet. Für eine genaue Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkung durch BiFC, ist es sehr wichtig, dass die Western-Blot-Analyse durchgeführt wird, um gleich Expression verschiedener Konstrukte zu gewährleisten und dass kein Abbau von Proteinen auftritt, welche sich mit der richtigen Analyse stören. Lysate aus den gleichen Proben daher für Western-Blot-Analyse bevorzugt ähnliche Proteinexpression für alle analysierten Proben festzustellen. Darüber hinaus ist es wichtig, geeignete Menge von Plasmiden für die Transfektion zu ermitteln linearen Ausdruck und Interaktion von Proteinen zu gewährleisten, und unter diesem Bereich liegt, korreliert die Wechselwirkung von Protein with Fluoreszenzintensität BiFC Signal.
Geringer GFP-Plasmid als Marker für eine erfolgreiche Transfektion verwendet, so dass nur GFP-positiven Zellen wurden hier analysiert. Ein anderes fluoreszierendes Protein, wie RFP verwendet werden, um die Durchschlag zwischen den Farben zu minimieren 11 werden. Für Durchflusszytometrie werden einzelne positive Zellen benötigt, um zum Ausgleich einbezogen werden. Wenn möglich, sind mindestens 10.000 GFP positiven Zellen gezählt, um eine gute Stichprobe zu gewährleisten.
Zusammenfassend Hier zeigen wir, dass die Kopplung BiFC Methodik durchflusszytometrische Analyse als ein guter Indikator für Protein-Protein-Wechselwirkung in Zellen verwendet werden. Traditionelle Analyse BiFC mit Immunfluoreszenzmikroskop ist zeitaufwendig, und Stichprobengröße ist viel niedriger als die entsprechenden zytometrische Analyse fließen. So kann Kopplung Durchflusszytometrie mit BiFC vorteilhaft für die Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen bei Transfektionseffizienz ist gering. DabeiBericht, nutzten wir BiFC-Durchflusszytometrie, um die Interaktion Websites in PDE4D3 für die Bindung an AKAP-Lbc abzubilden. Diese Technik könnte auch zum Screening auf Moleküle oder Peptide, die stören oder zu erweitern Protein-Protein-Interaktion kann, für die Arzneimittelforschung 12 verlängert werden. Dieses Verfahren kann auch verwendet werden, um bestimmte physiologische Ereignisse, wie Liganden-induzierte Internalisierung des GPCR 13 zu untersuchen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Wir danken der O'Bryan Labor an UIC für kritische experimentelle Evaluation und Diskussion. UIC Zentrum für Klinische und Translational Sciences Zuschuss UL1TR000050 - Diese Arbeit wurde von der American Heart Association Zuschuss 11SDG5230003 zu GKC und National Center for Advancing Translationale Wissenschaft unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Dulbecco’s modified Eagle’s media (DMEM) | Invitrogen | 11965-092 | |
| Penicilin-Streptomycin (pen/strep), 100x | Invitrogen | 15070-063 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 16000-044 | |
| Anti-Flag antibody | Sigma | M2, F1804 | |
| Anti-HA antibody | Covance | 16B12, MMS-101R | |
| α-tubulin | Sigma | DM1A, T9026 | |
| Anti-GFP antibody | Clontech | 632569 | |
| Cell culture plates, 6-well tissue culture treated | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| Maxiprep plasmid purification kit, high speed | Qiagen | 12663 | |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered saline (DPBS), sterile 1x | Invitrogen | 14190-144 | |
| Trypsin-EDTA, 0.05% (w/v) | Gibco | 25300 | |
| Polystyrene round-bottom tubes for FACS staining | BD Biosciences | 352052 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | S74337MF | |
| Prolong gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P-36931 | |
| Superfrost plus Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Fisherfinest premium cover glass | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| EQUIPMENT | |||
| CO2 air-jacketed Incubator | NuAIR DH autoflow | ||
| Confocal microscope LSM510 META | Carl Zeiss, Inc | ||
| Electrophoresis and transfer unit | Biorad | ||
| Cyan ADP Flow Cytometer | Beckman Coulter | ||
References
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