Summary
Flödescytometrisk analys av Bimolecular Fluorescens Komplementering ger en hög genomströmning kvantitativ metod för att studera protein-proteininteraktion. Denna metodik kan tillämpas på kartläggning bindande protein platser och för screening av faktorer som reglerar protein-proteininteraktion.
Abstract
Bland metoder för att studera protein-proteininteraktion inre celler, är Bimolecular Fluorescens Komplettering (BiFC) relativt enkel och känslig. BiFC är baserad på produktion av fluorescens med hjälp av två icke fluorescerande fragment av ett fluorescerande protein (Venus, en gul fluorescerande protein variant, används här). Icke-fluorescerande Venus fragment (VN och VC) smälts till två interagerande proteiner (i det här fallet, AKAP-Lbc och PDE4D3), vilket ger fluorescens grund VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 samverkan och bildandet av ett funktionellt fluorescerande protein inuti celler.
BiFC ger information om subcellulära lokalisering av proteinkomplex och styrkan i proteininteraktioner baserat på fluorescensintensitet. Emellertid är BiFC analys med användning av mikroskopi för att kvantifiera styrkan i protein-proteininteraktion tidskrävande och något subjektiva på grund av heterogenitet i proteinuttryck och interaktion. Genom koppling flödescytometriskanalys med BiFC metodik, kan det fluorescerande BiFC protein-proteininteraktion signalen mätas noggrant för en stor mängd celler på kort tid. Här visar vi en tillämpning av denna metod för att kartlägga områden i PDE4D3 som krävs för samspelet med AKAP-Lbc. Denna höga genomströmning metodik kan tillämpas på screening faktorer som reglerar protein-proteininteraktion.
Introduction
650.000 protein-protein interaktioner beräknas existera i den mänskliga interactome, spela avgörande roller i att upprätthålla normala cellfunktioner 1,2. Förutom co-immunoprecipitation (co-IP), till guldmyntfoten studera protein-protein interaktion från cellysat, flera protein analyser fragmentkomplettering (PCA) har utvecklats för att förbättra känsligheten i detektion av protein-protein växelverkan inuti celler 3. Tekniker inkluderar Förster resonansenergiöverföring (FRET), Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET), och Bimolecular Fluorescens Komplettering (BiFC) 4,5. BiFC är baserad på den förenklade sammanslutning av två fragment av ett fluorescerande protein (här använder vi Venus, en YFP variant) som var och en är fuserade till en potentiell interagerande protein partner (i detta exempel använder vi AKAP-Lbc och PDE4D3). Interaktion av de två proteiner av intresse inuti celler resulterar i funktionell fluorescens, som kan visualiseras genom fluorescence mikroskopi med antingen levande eller fixerade celler 6,7,8. Jämfört med andra PCA, är BiFC känslig och mindre tekniskt utmanande, med potential att studera cellulär lokalisering i levande celler. En stor nackdel med denna teknik är emellertid att en gång bildats, kan det fluorescerande proteinet komplexet inte vändas. Därför är det inte en bra metod för att studera dynamiska protein-protein växelverkan. I denna uppsats använder vi BiFC att kartlägga interaktionsställen av PDE4D3 med AKAP-Lbc genom att övervaka fluorescensintensiteterna av Venus. Jämfört med traditionell analys med fluorescens mikroskopi, vilket är tidskrävande och arbetsintensiv (om den inte utförs med hjälp av automatiserade hög genomströmning maskiner), ger flödescytometri en enkel kvantitativ analys av tusentals celler i en heterogen population under en kort tid 9, 10. Här, genom att utföra en sida-vid-sida jämförelse av flödescytometrisk-BiFC analys och traditionella co-IP, visar vi att de två metod jämförbara uppgifter, dock är flödescytometrisk BiFC analys mindre tidskrävande och använder mindre material, vilket kan vara mer användbart när celler av intresse är begränsade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ett. Cell Transfektion
- Tavla celler dagen före transfektion, plätering färre celler för immunofluorescens.
- För immunofluorescens: i en 6-brunnar, päls glas täckglas (1 per brunn) med 0,02% gelatin vid 37 ° C under minst 4 timmar, tvätta en gång med medium, och för varje brunn, platta 1 x 10 5 HEK 293T celler i 2 ml fullständigt tillväxtmedium [Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) plus 10% FBS].
- För flödescytometriska och Western blot-analyser: platta 1,2 x 10 5 HEK 293T-celler / brunn i 2 ml fullständigt tillväxtmedium i 6-brunnar (0,3 x 10 5 HEK 293T-celler i 0,5 ml fullständigt tillväxtmedium per brunn i 24-brunnars platta ).
- Förbered DNA för transfektion enligt tillverkarens protokoll: Effectene (Qiagen) används för immunofluorescens. TransIT-LT1 (Mirus) används för flödescytometriska och Western blot analyser. Mängden använt DNA listas nedan.
Transfektion med Effectene (6-väl):24-brunnar (ng) 6-brunnar (ng) GFP-vektor 10 50 VN N-AKAP-Lbc 200 1000 VC N-PDE4D3-FL (fullängd PDE4D3) 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 100 VC N-PDE4D3-UCR1 (a PDE4D3 N-terminalt fragment innehållande UCR1 domän) 100 VC N-PDE4D3-UCR2 + CAT (a PDE4D3 C-terminala fragment innehållande UCR2 och katalytiska domäner) 100 - Lägg angivna mängden plasmid-DNA + 4 | il förstärkare till 100 | il buffert EG, blanda och inkubera under 5 min vid rumstemperatur.
- Tillsätt 5 pl Effectene, blanda och inkubera i 10 minuter vidrumstemperatur. Lägg droppvis till cellerna.
- Lägg angivna mängden plasmid-DNA till 250 μl/50 il av Opti-MEM I serumfria mediet i ett sterilt rör.
- Lägg TransIT-LT1 reagens till den utspädda DNA-blandningen och pipettera försiktigt för att blanda. (Transit-LT1 Reagens: DNA-förhållandet är 3 pl TransIT-LT1 reagens per 1 mikrogram av DNA).
- Inkubera under 30 minuter vid rumstemperatur och tillsätt droppvis till cellerna.
2. Cell Förberedelse för flödescytometri, Western Blot, och immunofluorescens
- 24 timmar efter transfektion, kolla fluorescens i epifluorescensmikroskop före skörd celler.
- Cell förberedelse för flödescytometrisk analys:
- Tvätta cellerna med 0,5 ml / 2 ml iskall PBS under 24-well/6-well plattorna.
- Drag av celler med användning av 50 μl/250 il 0,05% trypsin.
- Neutralisera trypsin med 200 pl / 1 ml DMEM medium.
- Collect 250 | il celler (för både 24-brunn och 6-brunnars platta) genom centrifugering vid 500 xg under 5 minuter, använd återstående cellerna (1 ml) för Western blot-analys.
- Resuspendera cellerna i 250 | il FACS-buffert [PBS + 0,5% (vikt / volym) BSA + 2 mM EDTA], förvara på is för flödescytometrisk analys. Celler kan också fixeras i 1% paraformaldehyd (i PBS) om flödescytometrianalys inte kommer att vara omedelbar.
- Cell förberedelse för Western blot-analys: utföras parallellt med cellpreparation för flödescytometrianalys.
- Tvätta celler 1x med 2 ml iskall PBS, lysera cellerna genom tillsats av 100 | il cell-lys-buffert [10 mM natriumfosfatbuffert, pH 6,95, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 1% Triton X-100] .
- Samla cellysat genom centrifugering under 10 minuter vid 21.000 xg vid 4 ° C.
- Kvantifiera proteinkoncentrationen genom Bradford proteinanalys, ladda lika mängder protein per bana för SDS-PAGE och överföring till nitrocellulosa för immunoblotting.
- Cell förberedelse för immunofluorescens.
- Skölj celler 3x med 2 ml PBS, fixa celler i 1 ml 3,7% paraformaldehyd (i PBS) under 10 minuter vid rumstemperatur, tvätta sedan 3x med 2 ml PBS under 5 min.
- Montera locket halka på en glasskiva, med montering medium. Täta täckglas kanterna med nagellack om det behövs.
- Förvara glasen vid 4 ° C före prövning.
Tre. Flödescytometri och immunofluorescensmikroskopi
- Flödescytometri utförs med hjälp av en Beckman Coulter Cyan ADP, utrustad med 488 nm, 405 nm, och 642 nm solid-state-lasrar. Summit programvara används för insamling och analys.
- Kalibrera flödescytometer med användning av standardmetoder pärlor.
- Plot Forward scatter (FSC) / sideward scatter (SSC) på en linjär skala för att grinda levande cellpopulationen.
- Plot FSC / spänningspulsbredd för slussning icke sammanfattad levande cell population.
- Plot count/FL6 (CFP fluorescence, 405 nm) på en log-skala för att grinda icke-aggregerade levande GFP-positiva celler.
- Plot count/FL1 (YFP fluorescens, 488 nm) på en logaritmisk skala för BiFC intensitet.
- Kör YFP-CFP-dubbla negativa prover, justera FSC, SSC, FL1 och FL6 foto multiplikator rör (PMT) spänning att sätta gränsen för varje signal.
- Kör enda positiva (både YFP + och GFP +) prover för framtida off-line ersättning
- Skaffa minst 10.000 gated händelser (icke-aggregerade levande GFP + celler) för analys.
- Immunofluorescensmikroskopi utförs med hjälp av en Zeiss LSM 510 konfokalmikroskop Obs. Det är viktigt att hålla alla inställningar (t.ex. zoom, småhål, detektor förstärkning, förstärkare offset, ramstorlek, skanningshastighet, skanna genomsnitt, och laser power) konsekvent mellan prover för korrekt jämförelse av samtliga uppgifter.
4. Data Analysis (utförs med Summit Software)
- Ställ upp analysen protokoll liknande det för acquisitjon med ordentlig slussning:
Gate 1 i FSC / SSC-plotten för levande celler.
Gate 2 i FSC / pulsbredd Gate 1 för icke-aggregerade levande celler.
Gate 3 i räkna / CFP av Gate 3 för icke-aggregerade GFP + levande celler. - Kompensera YFP och GFP-signal med hjälp YFP + och GFP + enstaka positiva celler.
- Re-bestämma cut-off linjer för GFP / YFP-positiva celler.
- Export YFP menar fluorescensintensitet (MFI) i GFP + celler till Excel för data plottning.
- Normalisera YFP MFI till expressionsnivåer av AKAP-Lbc, PDE4D3, och lastning kontroll α-tubulin, enligt bestämning med Western blöt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
AKAP-Lbc och PDE4D3 konstruktionerna (Figur 1B) smältes till VN och VC fragment, respektive. Interaktion av AKAP-Lbc och PDE4D3 resulterar i funktionell YFP fluorescens (Figur 1A). Här använder vi BiFC metod att kartlägga AKAP-Lbc-bindningsställen i PDE4D3. Uppströms konserverad region 1 (UCR1), uppströms konserverad region 2 (UCR2) och katalytiska regionen (CAT) är konserverade bland PDE4-gruppens proteiner, därför, full längd (FL), UCR1 och UCR2 plus CAT användes för screening av bindningsstället för PDE4D3 till AKAP-Lbc. Uttrycket av VN-AKAP-Lbc och VC-PDE4D3-fragment i HEK 293T celler resulterar i fluorescens med olika intensitet (Figur 1C). BiFC visar att både UCR1 och UCR2 + CAT bidrar till interaktionen av PDE4D3 med AKAP-Lbc. Greater fluorescensintensitet uppstått genom AKAP-Lbc-UCR1 interaktion, jämfört med AKAP-Lbc-UCR2 + CAT, indikerar att PDE-UCR1 binder till AKAP-Lbc bättre än PDE-UCR2 + CAT.
(Figur 2A), och cellaggregat uteslöts genom att använda SSC vs Pulse Width dubbel punkt (Figur 2B). Celler med BiFC signal eller GFP uttryck enbart var used att bestämma ersättningen och cut-off för celler utan fluorescens (figur 2C-2F). GFP vektor samtransfekterades med BiFC konstruktioner och GFP uttryck användes som en positiv markör för att indikera lyckad transfektion. Endast GFP ^-celler användes för mätning av BiFC fluorescens. Transfektion av ökande mängder av PDE4D3 resulterade i ökad Venus (YFP) BiFC signal (figur 3A), medan GFP-signalen förblev oförändrad (figur 3B). Uttryck av VN-AKAP-Lbc och ökande mängder av VC-PDE4D3 bekräftades genom Western blot (Figur 3C). Sammantaget ökade PDE uttryck resulterade i en linjär ökning av BiFC fluorescens korrelerar till PDE uttryck nivåer (Figur 3D). Dessa resultat validerat användningen av flödescytometri för att kvantifiera AKAP-Lbc-PDE4D3 interaktion genom att mäta medelfluorescensintensiteten (MFI) i BiFC. Vi använde därför denna metod på karta AKAP-Lbc bindningsställen inom PDE4D3 med VN-AKAP-Lbc och VC-PDE4D3 konstruktioner. Överensstämmer med våra observationer i figur 1C, uttryck av VN-AKAP-Lbc och VC-PDE4D3-UCR2 + CAT resulterade i lägre BiFC signal jämfört med VC-PDE4D3-FL och VC-PDE4D3-UCR1 (Figur 4B). Liknande protein expression observerades i alla flödes-prover (figur 4C) och genomsnittlig fluorescens normaliserades till de relativa uttrycksnivåerna av AKAP-Lbc, PDE4D3, och α-tubulin. Därför indikerar normaliserad BiFC MFI att det inte finns någon skillnad i fluorescensintensitet mellan AKAP-Lbc-PDE4D3-FL och AKAP-Lbc-PDE4D3-UCR1, men mycket lägre signal för AKAP-Lbc-PDE4D3-UCR2 + CAT interaktion (Figur 4A ). Dessa resultat tyder på att det finns flera regioner i PDE4D3 som interagerar med AKAP-Lbc och att PDE4D3-UCR1 är den primära regionen av interaktion med AKAP-Lbc. Detta resultat bekräftas också av co-IP, guldmyntfoten för protein-protein växelverkan (Figur 5).
Figur 1. BiFC analys av AKAP-Lbc-PDE4D3-fragment interaktion genom immunofluorescens mikroskopi. A) Schematisk företrädare Bimolecular Fluorescens Komplettering (BiFC). Venus-fragment; VN och VC är fuserade till AKAP-Lbc och PDE4D3 respektive. AKAP-Lbc-PDE4D3 interaktion resulterar i funktionell YFP fluorescens. B) Schematisk bild av PDE4D3 konstruktioner som används för kartläggning. C) Representativa BiFC signaler transfekterade HEK 293T celler. Celler samtransfekterades med VN-AKAP-Lbc och VC-PDE4D3 konstruktioner (-FL, UCR1-,-UCR2 + CAT) för BiFC analys. GFP-vektor också samtransfekterades som en transfektion markör. 24 tim efter transfektion fixerades cellerna för avbildning. BiFC signal visas i grönt och GFP visas i pseudofärger rött i de sammanslagna siffror. 9/50529fig1large.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att visa en större bild.
Figur 2. Fastställande av grindar och ersättning för FACS-analys. A) FSC vs SSC-plotten till gate levande celler och att utesluta skräp och döda celler. B) Side Scatter vs pulsbredd punktdiagram till gate enstaka celler och att utesluta aggregat. C) Celler som uttrycker GFP (GFP + celler) innan ersättning. D ) Celler som uttrycker GFP (GFP + celler) efter YFP kompensation. Cut-off line för celler med YFP uttryck omvaldes bestämdes.) E-celler med BiFC signal (YFP + celler) innan ersättning. F) celler med BiFC signal (YFP + celler) efter GFP kompensation. Cut-off line för celler med GFP uttryck omvaldes bestämdes.target = "_blank"> Klicka här för att visa en större bild.
Figur 3. Analys av AKAP-Lbc-PDE4D3 interaktion med BiFC-flödescytometri genom att variera mängden PDE4D3 uttryck. A) Ökade BiFC signal inuti GFP + celler transfekterade med ökande mängder av VC-PDE4D3. Celler med GFP (10 ng), VN-AKAP-Lbc (200 ng) och ökande mängder av VC-PDE4D3 (2,5 ng till 80 ng). Icke-aggregerade GFP + levande celler var gated och YFP fluorescens visas som YFP vs Forward Scatter dubbel plotten. YFP + celler visas i grönt. Representativa data från 5 ng, 20 ng och 80 ng VC-PDE4D3 visas. B) GFP fluorescens i levande celler visas som CFP vs Forward Scatter dubbel punktdiagram, som visar konsekvent GFP fluorescens bland alla prover.) C Western blot-analys visar ökande PDE4D3 expression med konsekvent uttryck av AKAP-Lbc och α-tubulin (används som en laddningskontroll). D) Venus (YFP) Genomsnittlig fluorescensintensitet (MFI) av GFP + celler är korrelerad med VC-PDE4D3 uttryck. Faldig förändring av både YFP MFI från GFP + celler ritas tillsammans med GFP MFI faldig förändring från icke-aggregerade levande celler. Relativa uttryck nivåer av VC-PDE4D3 bestäms av Image J analys av Western blot också ritas. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 4. BiFC analys av AKAP-Lbc interaktion med PDE4D3-FL, PDE4D3-UCR1, PDE4D3-UCR2 + CAT med flödescytometri. A) AKAP-Lbc-PDE4D3-fragment interaktion kvantifierades av Venus-MFI normaliserad till protein expression (AKAP-Lbc, PDE4D3 fragment och lastning kontroll α-tubulin). Difference i BiFC signal undersöktes genom en variansanalys (ANOVA) Ett p-värde <0,01 anses mycket viktig (**) medan p-värde> 0,05 anses inte signifikant (NS). B) Representant BiFC signal i transfekterade HEK 293T celler. HEK 293T celler samtransfekterades med GFP, VN-AKAP-Lbc och VC-PDE4D3 konstruktioner (-FL, UCR1-,-UCR2 + CAT). Icke-aggregerade levande GFP + celler var gated och deras BiFC fluorescens visas i YFP vs Forward Scatter dubbel plotten. C) Western blot visar jämförbara uttryck av AKAP-Lbc och PDE4D3-fragment. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 5. Bekräftelse av Flödescytometrianalys genom co-immunoprecipitation. HEK 293T celler samtransfekteradesför uttryck av V5-AKAP-Lbc och GFP-PDE4D3 konstruktioner (-FL, UCR1-,-UCR2 + CAT). 48 h efter transfektion, var AKAP-Lbc immunutfälldes med användning V5-agarospärlor. Bindning av PDE4D3-FL, UCR1 och UCR2 + CAT detekterades genom SDS-PAGE och Western blöt med användning av anti-GFP-primära antikroppen. Motsvarande PDE4D3 ingången används för immunprecipitering visas också, vilket indikerar liknande uttryck för alla PDE4D3-fragment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
BiFC är en enkel och känslig metod för att studera protein-proteininteraktion. Denna metod kan inte användas för att identifiera nya protein-protein växelverkan, dock är det särskilt lämpligt att bekräfta protein-protein växelverkan inuti celler och studera funktionella egenskaper, såsom subcellulära lokalisering av proteinkomplex, kartläggning av protein-protein växelverkan platser, och för screening av små molekyler / peptider som kan modulera protein-proteininteraktion. Eftersom VN och VC-fragmenten är icke-fluorescerande, är bakgrundsfluorescensen låg, vilket medhjälp känsligheten för denna analys. Det behövs tid för att mogna / stabilisera VN-protein-VC-protein växelverkan, alltså det är en fördröjning att visualisera protein-protein växelverkan, och optimala tidpunkter kan därför behöva bestämmas empiriskt. Det bör också noteras att VN-protein-VC-proteininteraktion är ej vändbar, därför tyvärr med nuvarande Venus BiFC konstruerar denna analys är inte lämplig to studera dynamiska kinetik av protein-protein växelverkan.
Korrekt kontroller är viktiga för BiFC analys. En lämplig negativ kontroll innefattar icke-interagerande proteiner eller icke-specifika peptider i relevanta BiFC vektor, eller om möjligt, en mutant som stör protein-protein växelverkan. Tomma BiFC vektor är inte en bra styrning som resulterar i icke-specifik hög bakgrundsfluorescens. Om BiFC inte observeras i två samverkande proteiner, bör uttrycket analyseras. Dessutom kan BiFC signalen variera beroende på protein-protein interaktionsställen. Det bör noteras att spatial modulering av VN och VC interaktion också kan påverka fluorescensintensiteten, därför är det initialt viktigt att utföra BiFC experiment med användning av både C-terminala och N-terminala VN / VC konstruktioner uttryck. Till exempel kan BiFC uppstår inte om protein-protein växelverkan blockerar återupptaget sammanslutning av Venus fragmenten. Därför konstruerar flera kombinationer av VN och VC should testas (dvs. både C-och N-terminala fusioner protein).
Fluorescensintensiteten av BiFC är proportionell mot styrkan av protein-protein-interaktion, med högre BiFC intensitet indikerar starkare interaktion och en nedre fluorescensintensitet antyder svagare interaktion. BiFC MFI används därför som indikator för protein-proteininteraktion. För exakt analys av protein-protein växelverkan genom BiFC, är det mycket viktigt att Western blot-analys utförs för att säkerställa lika uttryck av olika konstruktioner och att ingen proteinnedbrytning sker, vilket kan störa korrekt analys. Lysat från samma prover är därför att föredra för Western blot-analys för att bestämma motsvarande proteinuttryck för alla analyserade prover. Dessutom är det viktigt att bestämma lämplig mängd plasmider för transfektion för att säkerställa linjär uttryck och interaktion av proteiner, och bland detta intervall, korrelerar interaktionen av protein with fluorescensintensiteten hos BiFC signal.
Låg mängd GFP plasmid används som en markör för framgångsrik transfektion, så endast GFP positiva celler analyserades här. En annorlunda fluorescerande protein, såsom RFP skulle kunna användas för att minimera genomblödning mellan färgerna 11. För flödescytometri, enstaka positiva celler som behövs för att ingå ersättning. Om möjligt är minst 10.000 GFP positiva celler räknades för att säkerställa en god urvalsstorlek.
Sammanfattningsvis, här visar vi att koppling BiFC metodik med flödescytometrisk analys kan användas som en god indikator på protein-proteininteraktion inre celler. Traditionell analys av BiFC med immunofluorescens mikroskop är tidskrävande, och urvalsstorlek är mycket lägre än den som motsvarar flödescytometri. Således kan koppling flödescytometri med BiFC vara fördelaktigt för analys av protein-protein-interaktion när transfektionseffektiviteten är låg. I dettabetänkande, utnyttjade vi BiFC-flödescytometri för att kartlägga samspelet platser i PDE4D3 för bindning till AKAP-Lbc. Denna teknik kan dessutom utvidgas för att screena för molekyler eller peptider som kan störa eller förhöja protein-proteininteraktion, för läkemedelsutveckling 12. Denna metod kan också användas för att studera vissa fysiologiska händelser, såsom ligandinducerad internalisering av GPCR: s 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi tackar O'Bryan labbet på UIC för kritisk experimentell utvärdering och diskussion. Detta arbete stöddes av American Heart Association Grant 11SDG5230003 till GKC och National Center för främjande Translational Science - UIC Centrum för klinisk och translationell vetenskaper Grant UL1TR000050.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Dulbecco’s modified Eagle’s media (DMEM) | Invitrogen | 11965-092 | |
| Penicilin-Streptomycin (pen/strep), 100x | Invitrogen | 15070-063 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 16000-044 | |
| Anti-Flag antibody | Sigma | M2, F1804 | |
| Anti-HA antibody | Covance | 16B12, MMS-101R | |
| α-tubulin | Sigma | DM1A, T9026 | |
| Anti-GFP antibody | Clontech | 632569 | |
| Cell culture plates, 6-well tissue culture treated | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| Maxiprep plasmid purification kit, high speed | Qiagen | 12663 | |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered saline (DPBS), sterile 1x | Invitrogen | 14190-144 | |
| Trypsin-EDTA, 0.05% (w/v) | Gibco | 25300 | |
| Polystyrene round-bottom tubes for FACS staining | BD Biosciences | 352052 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | S74337MF | |
| Prolong gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P-36931 | |
| Superfrost plus Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Fisherfinest premium cover glass | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| EQUIPMENT | |||
| CO2 air-jacketed Incubator | NuAIR DH autoflow | ||
| Confocal microscope LSM510 META | Carl Zeiss, Inc | ||
| Electrophoresis and transfer unit | Biorad | ||
| Cyan ADP Flow Cytometer | Beckman Coulter | ||
References
- Collura, V., Boissy, G. From protein-protein complexes to interactomics. Subcell Biochem. 43, 135-183 (2007).
- Stumpf, M. P., et al. Estimating the size of the human interactome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6959-6964 (2008).
- Shekhawat, S. S., Ghosh, I. Split-protein systems: beyond binary protein-protein interactions. Curr. Opin. Chem. Biol. 15, 789-797 (2011).
- Dwane, S., Kiely, P. A. Tools used to study how protein complexes are assembled in signaling cascades. Bioeng. Bugs. 2, 247-259 (2011).
- Piehler, J. New methodologies for measuring protein interactions in vivo and in vitro. Curr. Opin. Struct. Biol. 15, 4-14 (2005).
- Kerppola, T. K. Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells. Nat. Protoc. 1, 1278-1286 (2006).
- Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay. Nat. Protoc. 3, 1693-1702 (2008).
- Wong, K. A., O'Bryan, J. P. Bimolecular fluorescence complementation. J. Vis. Exp. (50), e2643 (2011).
- Sugarbaker, E. V., Thornthwaite, J. T., Temple, W. T., Ketcham, A. S. Flow cytometry: general principles and applications to selected studies in tumor biology. Int. Adv. Surg. Oncol. 2, 125-153 (1979).
- Koshy, S., Alizadeh, P., Timchenko, L. T., Beeton, C. Quantitative measurement of GLUT4 translocation to the plasma membrane by flow cytometry. J. Vis. Exp. (45), e2429 (2010).
- Smith, C. L. Basic confocal microscopy. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 14 (Unit 14), 11 (2008).
- Westwick, J. K., Lamerdin, J. E. Improving drug discovery with contextual assays and cellular systems analysis. Methods Mol. Biol. 756, 61-73 (2011).
- Kilpatrick, L. E., Holliday, N. D. Dissecting the pharmacology of G protein-coupled receptor signaling complexes using bimolecular fluorescence complementation. Methods Mol. Biol. 897, 109-138 (2012).
