Summary
L'analyse par cytométrie de complémentation de fluorescence bimoléculaire fournit une méthode quantitative à haut débit pour étudier l'interaction protéine-protéine. Cette méthode peut être appliquée à des sites de liaison aux protéines de cartographie et de criblage de facteurs qui régulent l'interaction protéine-protéine.
Abstract
Parmi les méthodes d'étude des interactions protéine-protéine dans les cellules, complémentation de fluorescence bimoléculaire (BiFC) est relativement simple et sensible. BiFC est basée sur la production de fluorescence à l'aide de deux fragments non fluorescents d'une protéine fluorescente (Venus, une variante de la protéine fluorescente jaune, est utilisé ici). Venus fragments non fluorescents (VN et VC) sont fusionnés à deux protéines interagissant (dans ce cas, AKAP-Lbc et PDE4D3), ce qui donne fluorescence due à l'interaction VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 et la formation d'une protéine fluorescente fonctionnelle à l'intérieur des cellules.
BiFC fournit des informations sur la localisation subcellulaire des complexes de protéines et de la force des interactions de protéines sur la base de l'intensité de fluorescence. Cependant, l'analyse BiFC utilisant la microscopie à quantifier la force de l'interaction protéine-protéine est longue et quelque peu subjective en raison de l'hétérogénéité dans l'expression des protéines et de l'interaction. Par cytométrie de flux couplageanalyse à la méthodologie BiFC, le signal d'interaction protéine-protéine fluorescente BiFC peut être mesuré avec précision pour une grande quantité de cellules dans un court laps de temps. Ici, nous démontrons une application de cette méthodologie pour cartographier les régions en PDE4D3 qui sont nécessaires à l'interaction avec AKAP-Lbc. Cette méthode à haut débit peut être appliquée aux éléments de criblage qui régulent l'interaction protéine-protéine.
Introduction
650.000 interactions protéine-protéine sont estimés à exister dans le Interactome humaine, jouent des rôles cruciaux dans le maintien des fonctions normales 1,2 cellulaire. Outre co-immunoprécipitation (co-IP), l'étalon-or pour étudier l'interaction protéine-protéine de lysat cellulaire, plusieurs essais de complémentation de fragments de protéines (PCA) ont été développés pour améliorer la sensibilité dans la détection des interactions protéine-protéine dans les cellules 3. Les techniques comprennent Förster transfert de résonance de l'énergie (FRET), Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET), et complémentation de fluorescence bimoléculaire (BiFC) 4,5. BiFC est basé sur l'association facilité de deux fragments d'une protéine fluorescente (ici nous utilisons Vénus; une variante YFP) qui sont fusionnées chacune à un partenaire de protéine d'interaction potentielle (dans cet exemple, nous utilisons AKAP-Lbc et PDE4D3). L'interaction des deux protéines d'intérêt dans les cellules en résulte fluorescence fonctionnel, qui peut être visualisée par fmicroscopie luorescence en utilisant soit des cellules vivantes ou fixe 6,7,8. Comparé à d'autres ACI, BiFC est sensible et techniquement moins difficile, avec un potentiel d'étudier la localisation cellulaire dans les cellules vivantes. Un inconvénient majeur de cette technique est cependant que, une fois formé, le complexe protéine fluorescente peut pas être inversée. Par conséquent, il n'est pas une bonne méthode pour étudier l'interaction dynamique de la protéine-protéine. Dans cet article, nous utilisons BiFC pour cartographier les sites d'interaction de PDE4D3 avec AKAP-Lbc en contrôlant l'intensité de fluorescence de Vénus. Par rapport à l'analyse traditionnelle en utilisant la microscopie à fluorescence, qui prend beaucoup de temps et de main-d'œuvre (si elle n'est pas effectuée en utilisant des machines à haut débit automatisé), la cytométrie en flux permet une analyse quantitative simple de milliers de cellules dans une population hétérogène sur une courte période 9, 10. Ici, en effectuant une comparaison côte-à-côte de l'écoulement cytométrie-BiFC et co-IP traditionnel, nous démontrons que les deux mes méthodes fournissent des données comparables, toutefois, analyse des flux BiFC cytométrie prend moins de temps et utilise moins de matériaux qui peuvent être plus utiles lorsque les cellules d'intérêt sont limités.
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Protocol
1. La transfection cellulaire
- Cellules de la plaque le jour avant la transfection, le placage moins de cellules pour immunofluorescence.
- Pour immunofluorescence: dans un des lamelles de verre manteau plaque à 6 puits (1 par puits) avec 0,02% de gélatine à 37 ° C pendant au moins 4 heures, laver une fois avec le milieu, et pour chaque puits, la plaque 1 x 10 5 HEK 293T cellules dans 2 ml de milieu de croissance complet [media de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) plus 10% de FBS].
- Pour des analyses par transfert de cytométrie et de l'Ouest flux: plaque 1,2 x 10 5 cellules HEK 293T / puits dans 2 ml de milieu de croissance complet en plaque de 6 puits (0,3 x 10 5 cellules HEK 293T dans un milieu de croissance complet de 0,5 ml par puits dans une plaque de 24 puits ).
- Préparer l'ADN pour la transfection selon le protocole de fabrication: Effectene (Qiagen) est utilisé pour immunofluorescence. TransIT-LT1 (Mirus) est utilisé pour des analyses par transfert de cytométrie et de l'Ouest débit. Montant de l'ADN utilisé est répertorié ci-dessous.
Transfection en utilisant Effectene (6 puits):Plaque de 24 puits (ng) Plaque de 6 puits (ng) CFP-vecteur 10 50 VN N-AKAP-Lbc 200 1000 VC N-PDE4D3-FL (full-length PDE4D3) 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 100 VC N-PDE4D3-DUC1 (un fragment N-terminal PDE4D3 contenant le domaine DUC1) 100 VC N-PDE4D3-DUC 2 + CAT (un fragment C-terminal PDE4D3 contenant les domaines du Programme DUC 2 et catalytique) 100 - Ajouter la quantité indiquée d'ADN plasmidique + 4 pl activateur à 100 pi de tampon CE, mélanger et incuber pendant 5 min à température ambiante.
- Ajouter 5 ul Effectene, mélanger et incuber pendant 10 min àla température ambiante. Ajouter goutte à goutte aux cellules.
- Ajouter la quantité indiquée d'ADN plasmidique à 250 μl/50 ul d'Opti-MEM I milieu sans sérum dans un tube stérile.
- Ajouter transit LT1 réactif au mélange d'ADN dilué et la pipette doucement pour mélanger. (Transit-LT1 réactif: rapport de l'ADN est de 3 pi de transit LT1 réactif par 1 pg d'ADN).
- Incuber pendant 30 min à température ambiante et ajouter goutte à goutte aux cellules.
2. Préparation des cellules pour la cytométrie en flux, Western blot et immunofluorescence
- 24 h après la transfection, vérifiez fluorescence sous microscope à épifluorescence avant la récolte des cellules.
- La préparation des cellules pour l'analyse par cytométrie de flux:
- Laver les cellules avec 0,5 ml / 2 ml de PBS glacé pour les plaques 24-well/6-well.
- Détacher les cellules à l'aide de 50 μl/250 ul 0,05% de trypsine.
- Neutraliser la trypsine avec 200 pl / 1 ml du milieu DMEM.
- Collect 250 pi de cellules (à la fois pour plaque de 24 puits et 6 puits) par centrifugation à 500 g pendant 5 min, utilisent les cellules restantes (1 ml) pour analyse par Western blot.
- Reprendre les cellules dans 250 ul de tampon FACS [PBS + 0,5% (p / v) de BSA + 2 mM EDTA], un magasin sur la glace pour l'analyse par cytométrie de flux. Les cellules peuvent également être fixés en paraformaldéhyde à 1% (en PBS) si l'analyse de cytométrie de flux ne sera pas immédiate.
- La préparation des cellules pour l'analyse Western blot: menée en parallèle avec la préparation de la cellule d'analyse de cytométrie en flux.
- Laver les cellules 1x avec 2 ml de PBS glacé, lyse des cellules par addition de 100 pi de tampon de lyse cellulaire [tampon de 10 mM de phosphate de sodium, pH 6,95, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, 5 mM EGTA, 1% de Triton X-100] .
- Recueillir lysat cellulaire par centrifugation pendant 10 min à 21000 g à 4 ° C.
- Quantifier la concentration de la protéine par dosage des protéines de Bradford, charger des quantités égales de protéines par voie de SDS-PAGE et transfert sur nitrocellulose pour immunoblot.
- La préparation des cellules pour immunofluorescence.
- Rincer les cellules 3x avec 2 ml de PBS, réparer les cellules dans 1 ml de 3,7% de paraformaldéhyde (dans PBS) pendant 10 min à température ambiante, puis laver 3x avec 2 ml de PBS pendant 5 min.
- Montez couvrir glissement sur une lame de verre, en utilisant un milieu de montage. Sceller les bords de la lamelle à l'aide de vernis à ongles si nécessaire.
- Stocker les lames à 4 ° C avant l'examen.
3. cytométrie de flux et immunofluorescence
- La cytométrie en flux est réalisée à l'aide d'un Beckman Coulter Cyan ADP, équipé de 488 nm, 405 nm et 642 nm lasers à semi-conducteurs. logiciel Summit est utilisé pour l'acquisition et l'analyse.
- Calibrer cytomètre de flux en utilisant des billes standard.
- Terrain diffusion vers l'avant (FSC) / latéral scatter (SSC) sur une échelle linéaire pour la population de cellules vivantes de déclenchement.
- Terrain FSC / tension largeur d'impulsion pour la population de cellules vivantes non agrégées déclenchement.
- Terrain count/FL6 (PCP fluorescence, 405 nm) sur une échelle logarithmique pour les cellules vivantes CFP-positifs non agrégées déclenchement.
- Terrain count/FL1 (YFP fluorescence, 488 nm) sur une échelle logarithmique pour l'intensité BiFC.
- Exécuter des échantillons YFP-CFP-Double Negative, ajuster FSC, SSC, FL1 et FL6 tube photomultiplicateur (PMT) de tension de fixer le seuil pour chaque signal.
- Exécuter positif unique (à la fois YFP + et + PCP) échantillons pour la rémunération future off-line
- Acquérir au moins 10.000 événements dépendants (+ cellules vivantes PCP non agrégées) pour analyse.
- Immunofluorescence est réalisée en utilisant un Zeiss LSM 510 microscope confocal. Remarque: il est important de garder tous les paramètres (comme le zoom, sténopé, gain du détecteur, amplificateur de décalage, la taille d'image, vitesse de balayage, balayage moyenne, et la puissance du laser) cohérente entre des échantillons de comparaison correcte de toutes les données.
4. Analyse des données (réalisées avec le logiciel Summit)
- Mettre en place le protocole d'analyse similaire à celle de acquisition avec déclenchement approprié:
Porte 1 à FSC / SSC en points pour les cellules vivantes.
Porte 2 au FSC / largeur d'impulsion de la porte 1 pour les cellules vivantes non agrégées.
Porte 3 de la numération / CFP de la porte 3 pour PCP non agrégées + cellules vivantes. - Compenser YFP et le signal YFP PCP en utilisant + et + PCP cellules positives simples.
- Lignes réexamen de coupure pour les cellules CFP / YFP-positif.
- Export YFP intensité moyenne de fluorescence (MFI) de PCP + cellules dans Excel pour les données de traçage.
- Normaliser YFP IMF à des niveaux d'expression de AKAP-Lbc, PDE4D3, et le chargement contrôle α-tubuline, tel que déterminé par Western blot.
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Representative Results
AKAP-Lbc et PDE4D3 constructions (figure 1B) ont été fusionnées au VN et fragments de capital-risque, respectivement. Interaction des AKAP-Lbc et PDE4D3 résultats en fonction YFP fluorescence (figure 1A). Ici, nous utilisons la méthode BiFC pour cartographier les sites AKAP-Lbc contraignantes dans PDE4D3. Région en amont conservé 1 (DUC1), région en amont conservé 2 (DUC 2) et la région catalytique (CAT) sont conservées parmi PDE4 protéines de la famille, donc, pleine longueur (FL), DUC1 et DUC 2, plus CAT ont été utilisés pour le dépistage du site de liaison de PDE4D3 à AKAP-Lbc. L'expression de VN-AKAP-Lbc et VC-PDE4D3-fragments dans HEK 293T résultats de fluorescence avec une intensité différente (figure 1C). BiFC indique que les deux DUC1 et DUC 2 + CAT contribuer à l'interaction de PDE4D3 avec AKAP-Lbc. L'intensité de fluorescence plus grande résultant de l'interaction AKAP-LBC-DUC1, par rapport à AKAP-LBC-DUC 2 + CAT, indique que la PDE-DUC1 lie à AKAP-Lbc mieux que PDE-DUC 2 + CAT.
(figure 2A), et des agrégats cellulaires ont été exclus en utilisant SSC vs Pulse Width double point (figure 2B). Cellules avec signal de BiFC ou expression PCP étaient seuls used pour déterminer les rémunérations et de coupure pour les cellules sans fluorescence (figures 2C-2F). PCP vecteur a été co-transfectées avec des constructions BiFC et expression de la PCP a été utilisé comme un marqueur positif pour indiquer transfection réussie. Seules les cellules + PCP ont été utilisés pour la mesure de BiFC fluorescence. La transfection de quantités croissantes de PDE4D3 a entraîné une augmentation (YFP) Signal BiFC Vénus (figure 3A), tandis que le signal PDC est resté inchangé (figure 3B). Expression de VN-AKAP-Lbc et des quantités croissantes de VC-PDE4D3 a été confirmée par Western blot (figure 3C). Dans l'ensemble, l'expression accrue PDE a entraîné une augmentation linéaire de BiFC fluorescence en corrélation avec les niveaux d'expression de PDE (figure 3D). Ces résultats ont validé l'utilisation de la cytométrie de flux pour quantifier les interactions AKAP-LBC-PDE4D3 en mesurant l'intensité de fluorescence moyenne (IFM) de BiFC. Nous avons donc utilisé cette méthode pour les sites de liaison AKAP-Lbc carte dans les PDE4D3 en utilisant VN-AKAP-Lbc et constructions VC-PDE4D3. Conformément à nos observations dans la figure 1C, l'expression de VN-AKAP-Lbc et VC-PDE4D3-DUC 2 + CAT entraîné signaux BiFC inférieur par rapport aux VC-PDE4D3-FL et VC-PDE4D3-DUC1 (figure 4B). Expression de la protéine similaire a été observée dans tous les échantillons de flux (figure 4C) et la moyenne de fluorescence a été normalisée à des niveaux d'expression relatifs de AKAP-Lbc, PDE4D3, et α-tubuline. Par conséquent, normalisé BiFC IMF indique qu'il n'y a pas de différence dans l'intensité de fluorescence entre AKAP-LBC-PDE4D3-FL et AKAP-LBC-PDE4D3-DUC1, mais le signal beaucoup plus faible pour AKAP-LBC-PDE4D3-DUC 2 + interaction CAT (figure 4A ). Ces résultats suggèrent qu'il existe plusieurs régions PDE4D3 qui interagissent avec AKAP-Lbc, et que PDE4D3-DUC1 est la principale région d'interaction avec AKAP-Lbc. Ce résultat a été confirmé par co-IP, la norme d'or pour l'interaction protéine-protéine (figure 5).
Figure 1. BiFC analyse de l'interaction AKAP-LBC-PDE4D3-fragment par immunofluorescence. A) représentant schématique de complémentation de fluorescence bimoléculaire (BiFC). Fragments Vénus VN et VC sont fusionnés à AKAP-Lbc et PDE4D3 respectivement. AKAP-LBC-PDE4D3 résultats d'interaction en fonction fluorescence YFP. B) Schéma de PDE4D3 constructions utilisées pour la cartographie. C) BiFC signaux représentatifs de cellules HEK 293T transfectées. Les cellules ont été co-transfectées avec VN-AKAP-Lbc et VC-PDE4D3 constructions (FL-,-DUC1,-DUC 2 + CAT) pour l'analyse BiFC. CFP-vecteur a également été co-transfectées comme un marqueur de transfection. 24 post-transfection, les cellules h ont été fixés pour l'imagerie. Signal de BiFC est représenté en vert et de la PCP est présenté dans pseudo-rouge dans les chiffres fusionnées. 9/50529fig1large.jpg "target =" _blank "> Cliquez ici pour agrandir la figure.
Figure 2. Détermination des portes et de la rémunération pour l'analyse FACS. A) FSC vs SSC dot plot de cellules vivantes de porte et à exclure les débris et les cellules mortes. B) Side Scatter vs largeur d'impulsion dot plot de cellules individuelles de porte et d'exclure les granulats. C) Les cellules exprimant CFP (+ cellules PCP) avant compensation. D Les cellules exprimant PCP) (+ cellules PCP) après compensation YFP. La ligne de coupure pour les cellules avec une expression YFP a été cellules avec des signaux BiFC (+ cellules YFP) avant compensation. F cellules avec des signaux BiFC (+ cellules YFP) après compensation PCP re-déterminé. E)). La ligne de coupure pour les cellules avec une expression de la PCP a été ré-établi.target = "_blank"> Cliquez ici pour agrandir la figure.
Figure 3. L'analyse de l'interaction AKAP-LBC-PDE4D3 utilisant la cytométrie BiFC-Flow en faisant varier la quantité de PDE4D3 expression. A) Augmentation de signaux BiFC intérieur + cellules transfectées PCP avec des quantités croissantes de VC-PDE4D3. Les cellules ont été transfectées avec PCP (10 ng), VN-AKAP-Lbc (200 ng) et des quantités croissantes de VC-PDE4D3 (2,5 ng à 80 ng). Cellules vivantes PCP + non agrégées étaient bloquées et YFP fluorescence est montrée comme YFP vs Forward Scatter à double dot plot. + Cellules YFP sont indiquées en vert. Western blot données représentatives de 5 ng, 20 ng et 80 ng VC-PDE4D3 s'affiche. B) PCP fluorescence dans des cellules vivantes est présenté comme PCP vs Forward Scatter terrain double de points, indiquant la fluorescence de la CFP cohérente parmi tous les échantillons. C) démontrant augmentation PDE4D3 expression avec l'expression cohérente de AKAP-Lbc et α-tubuline (utilisé comme contrôle de chargement). D) Venus (YFP) L'intensité moyenne de fluorescence (MFI) de PCP + cellules est corrélée avec VC-PDE4D3 expression. Facteur de variation des deux YFP MFI à partir de cellules + PCP est tracée avec PCP IMF facteur de changement de cellules vivantes non agrégées. Les niveaux d'expression relative de la VC-PDE4D3 déterminées par Image J analyse de Western blot sont également tracées. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 4. BiFC analyse de l'interaction AKAP-Lbc avec PDE4D3-FL, PDE4D3-DUC1, PDE4D3-DUC 2 + CAT par cytométrie de flux. A) interaction AKAP-LBC-PDE4D3-fragment a été quantifiée par Venus-MFI normalisée à l'expression des protéines (AKAP-Lbc, PDE4D3 fragments et de contrôle de chargement α-tubuline). Différence du signal BiFC ont été examinés par une analyse de variance (Anova) Une valeur de p <0,01 est considérée comme très importante (**), tandis que la valeur p> 0,05 est considérée comme non significative (ns). B) Signal BiFC Représentant en transfectées HEK 293T cellules. Cellules HEK 293T ont été co-transfectées avec PCP, VN-AKAP-Lbc et VC-PDE4D3 constructions (FL-,-DUC1,-DUC 2 + CAT). + Cellules vivantes PCP non agrégées étaient bloquées, et leur fluorescence BiFC sont présentés dans YFP vs Forward Scatter terrain double de points. C) Western blot indiquant expression comparable de AKAP-Lbc et PDE4D3-fragments. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 5. Confirmation de l'analyse de cytométrie en flux par co-immunoprécipitation. Cellules HEK 293T ont été co-transfectéespour l'expression de V5-AKAP-Lbc et GFP-PDE4D3 constructions (FL-,-DUC1,-DUC 2 + CAT). 48 h post-transfection, AKAP-Lbc a été immunoprécipité en utilisant des perles V5-agarose. La liaison de PDE4D3-FL, DUC1 et DUC 2 + CAT a été détectée par SDS-PAGE et Western blot utilisant un anticorps primaire anti-GFP. L'entrée PDE4D3 correspondant utilisé pour l'immunoprécipitation est également montré, en indiquant expression similaire pour tous les PDE4D3-fragments.
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Discussion
BiFC est un procédé simple et sensible pour étudier l'interaction protéine-protéine. Cette méthode ne peut être utilisée pour identifier de nouvelles interactions protéine-protéine, cependant, il est particulièrement utile pour confirmer l'interaction protéine-protéine dans les cellules et d'étudier les propriétés fonctionnelles, telles que la localisation subcellulaire des complexes de protéines, la cartographie des sites d'interaction protéine-protéine, et pour le criblage de petites molécules / peptides capables de moduler l'interaction protéine-protéine. Parce que des fragments VN et VC sont non-fluorescent, la fluorescence de fond est faible, facilitant ainsi la sensibilité de ce test. Il faut du temps pour mûrir / stabiliser l'interaction de la protéine VN-protéine-VC-, donc il ya retard de visualiser l'interaction protéine-protéine, et optimal points de temps peut donc être déterminé de manière empirique. Il convient également de noter que l'interaction de la protéine VN-protéine-VC-n'est pas réversible, donc malheureusement en courant Vénus BiFC construit ce dosage n'est pas adapté to Etude cinétique dynamique d'interaction protéine-protéine.
Des contrôles appropriés sont importants pour l'analyse BiFC. Un contrôle négatif approprié comprend des protéines non-interaction ou de peptides non spécifiques dans le vecteur BiFC pertinent ou, si possible, un mutant qui perturbe l'interaction protéine-protéine. Vecteur vide BiFC n'est pas un bon contrôle tel qu'il résulte en grande fluorescence de fond non spécifique. Si BiFC n'est pas observée dans deux protéines en interaction, l'expression doit être analysé. En outre, le signal BiFC peut varier selon les sites d'interaction protéine-protéine. Il convient de noter que la modulation spatiale de l'interaction VN et VC peut également affecter l'intensité de fluorescence, c'est pourquoi il est d'abord important de réaliser des expériences BiFC utilisant à la fois C-terminale et N-terminale VN / VC constructions d'expression. Par exemple, BiFC peut pas se produire si les blocs d'interaction protéine-protéine de la réassociation des fragments Vénus. Par conséquent, plusieurs combinaisons de VN et VC constructions d'épauleD tester (c'est à dire à la fois C et N des protéines de fusion de terminaux).
L'intensité de fluorescence de BiFC est proportionnelle à la force de l'interaction protéine-protéine, avec une plus grande intensité BiFC indiquant une interaction plus forte et une intensité de fluorescence plus faible suggérant une interaction plus faible. BiFC MFI est donc utilisé comme indicateur de l'interaction protéine-protéine. Pour une analyse précise de l'interaction protéine-protéine par BiFC, il est très important que l'analyse par Western blot est effectuée pour s'assurer expression égale des différentes constructions et qu'aucune dégradation des protéines se produit, ce qui peut interférer avec l'analyse correcte. Lysat partir des mêmes échantillons est donc préférable pour l'analyse de Western blot pour déterminer l'expression de la protéine similaire pour tous les échantillons analysés. En outre, il est essentiel de déterminer le montant approprié de plasmides pour la transfection d'assurer expression linéaire et l'interaction des protéines, et parmi cette gamme, l'interaction de la protéine est corrélée wie intensité de fluorescence des signaux BiFC.
Faible quantité de PCP plasmide est utilisé comme marqueur pour la transfection réussie, des cellules positives pour que la PCP ont été analysées ici. Une protéine fluorescente différente, comme DP pourrait être utilisé pour réduire le saignement-through entre 11 couleurs. Pour la cytométrie de flux, des cellules positives simples sont nécessaires pour être inclus à une indemnisation. Si possible, au moins 10.000 cellules positives pour la PCP sont comptés pour assurer une bonne taille de l'échantillon.
En résumé, ici, nous démontrons que le couplage méthodologie BiFC avec analyse par cytométrie en flux peut être utilisé comme un bon indicateur de l'interaction protéine-protéine dans les cellules. L'analyse traditionnelle de BiFC en utilisant un microscope immunofluorescence prend du temps, et la taille de l'échantillon est beaucoup plus faible que celle correspondant à l'écoulement cytométrie. Ainsi, le couplage de la cytométrie en flux avec BiFC peut être avantageux pour l'analyse d'une interaction protéine-protéine quand l'efficacité de transfection est faible. Dans cerapport, nous avons profité de la cytométrie BiFC-Flow pour cartographier les sites d'interaction dans PDE4D3 pour la liaison à AKAP-Lbc. Cette technique pourrait également être étendu à l'écran pour des molécules ou des peptides qui peuvent perturber ou améliorer l'interaction protéine-protéine, pour la découverte de médicaments 12. Cette méthode peut également être utilisée pour étudier certains phénomènes physiologiques, tels que l'internalisation induite par le ligand de 13 de GPCR.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Nous remercions le laboratoire O'Bryan à l'UIC pour l'évaluation expérimentale critique et à la discussion. Ce travail a été soutenu par l'American Heart Association Grant 11SDG5230003 à GKC et National Center for Advancing Translational Sciences - Centre des sciences de l'UIC clinique et translationnelle Grant UL1TR000050.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Dulbecco’s modified Eagle’s media (DMEM) | Invitrogen | 11965-092 | |
| Penicilin-Streptomycin (pen/strep), 100x | Invitrogen | 15070-063 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 16000-044 | |
| Anti-Flag antibody | Sigma | M2, F1804 | |
| Anti-HA antibody | Covance | 16B12, MMS-101R | |
| α-tubulin | Sigma | DM1A, T9026 | |
| Anti-GFP antibody | Clontech | 632569 | |
| Cell culture plates, 6-well tissue culture treated | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| Maxiprep plasmid purification kit, high speed | Qiagen | 12663 | |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered saline (DPBS), sterile 1x | Invitrogen | 14190-144 | |
| Trypsin-EDTA, 0.05% (w/v) | Gibco | 25300 | |
| Polystyrene round-bottom tubes for FACS staining | BD Biosciences | 352052 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | S74337MF | |
| Prolong gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P-36931 | |
| Superfrost plus Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Fisherfinest premium cover glass | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| EQUIPMENT | |||
| CO2 air-jacketed Incubator | NuAIR DH autoflow | ||
| Confocal microscope LSM510 META | Carl Zeiss, Inc | ||
| Electrophoresis and transfer unit | Biorad | ||
| Cyan ADP Flow Cytometer | Beckman Coulter | ||
References
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