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Biology

Citometria de fluxo e de Complementação de fluorescência Bimolecular: A alta taxa de transferência método quantitativo para estudo de interação proteína-proteína

doi: 10.3791/50529 Published: August 15, 2013

Summary

Citometria de fluxo e de Complementação de fluorescência Bimolecular fornece um método quantitativo de alto rendimento para estudar a interação proteína-proteína. Esta metodologia pode ser aplicada ao mapeamento de locais de ligação de proteína e para o rastreio de factores que regulam a interacção proteína-proteína.

Abstract

Entre os métodos para estudar a interação proteína-proteína dentro das células, Complementação de fluorescência Bimolecular (BiFC) é relativamente simples e sensível. BiFC baseia-se na produção de fluorescência utilizando-se dois fragmentos não fluorescentes de uma proteína fluorescente (Vénus, uma variante de proteína fluorescente amarela, é aqui utilizada). Fragmentos de Vénus não fluorescente (VN e VC) são fundidos a duas proteínas que interagem (neste caso, AKAP-Lbc e PDE4D3), produzindo fluorescência devido à interacção VN-AKAP-LBC-VC-PDE4D3 e a formação de uma proteína fluorescente funcional no interior das células.

BiFC fornece informações sobre a localização subcelular de complexos de proteínas e a intensidade das interacções de proteínas com base na intensidade de fluorescência. No entanto, a análise por microscopia de BiFC para quantificar a força da interacção proteína-proteína é demorado e subjectivos, devido à heterogeneidade na expressão da proteína e interacção. Acoplando citometria de fluxoA análise com a metodologia BiFC, o sinal BiFC interacção proteína-proteína fluorescente pode ser medida com precisão para uma grande quantidade de células num curto espaço de tempo. Aqui, nós demonstramos uma aplicação desta metodologia para mapear regiões PDE4D3 que são necessárias para a interação com AKAP-Lbc. Esta metodologia de elevado rendimento pode ser aplicado a factores de rastreio que regulam a interacção proteína-proteína.

Introduction

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650.000 de interacções proteína-proteína são estimadas a existir no interactoma humano, desempenham papéis críticos para manter as funções normais da célula 1,2. Além de co-imunoprecipitação (co-PI), o padrão de ouro para estudar a interacção proteína-proteína a partir de lisados ​​de células, vários ensaios de complementação fragmento de proteína (APC) foram desenvolvidos para melhorar a sensibilidade na detecção de interacção proteína-proteína no interior das células 3. As técnicas incluem a transferência de energia por ressonância de Förster (FRET), bioluminescência Resonance Energy Transfer (BRET) e Complementação de fluorescência Bimolecular (BiFC) 4,5. BiFC é baseada na associação facilitada de dois fragmentos de uma proteína fluorescente (aqui usamos Vénus; uma variante YFP) que são, cada um fundido com um parceiro de proteína interagindo potencial (neste exemplo utilizamos AKAP-Lbc e PDE4D3). A interacção das duas proteínas de interesse dentro de células resulta em fluorescência funcional, que podem ser visualizadas por fmicroscopia luorescence usando tanto células vivas ou fixo 6,7,8. Comparado a outros PCAs, BiFC é sensível e menos tecnicamente desafiador, com potencial para estudar a localização celular em células vivas. Um grande inconveniente desta técnica é que, no entanto, uma vez formado, o complexo de proteína fluorescente não pode ser revertida. Portanto, não é um bom método para estudar a interacção proteína-proteína dinâmico. Neste trabalho, usamos BiFC para mapear os sítios de interação de PDE4D3 com AKAP-Lbc, monitorando as intensidades de fluorescência de Vênus. Em comparação com a análise tradicional utilizando a microscopia de fluorescência, o que é demorado e trabalhoso (se não for realizado utilizando maquinaria de alta taxa de transferência automatizada), citometria de fluxo, fornece uma análise quantitativa e simples dos milhares de células numa população heterogénea durante um curto período de tempo 9, 10. Aqui, através da realização de uma comparação lado-a-lado da análise de citometria de fluxo-BiFC tradicional e co-PI, que demonstram que os dois métodos proporcionam dados comparáveis, no entanto, a análise de fluxo citométrico BiFC é menos demorado e utiliza menos material, que pode ser mais útil quando as células de interesse são limitadas.

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Protocol

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1. Transfecção celular

  1. Células da placa um dia antes da transfecção, chapeamento menos células de imunofluorescência.
    1. Para imunofluorescência: em uma placa de 6 poços, casaco lamínulas de vidro (um por poço), com 0,02% de gelatina a 37 ° C durante pelo menos 4 horas, lave uma vez com o meio, e para cada poço, a placa 1 x 10 5 HEK 293T células em 2 ml de meio de crescimento completo [meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) mais 10% de FBS].
    2. Para a citometria de fluxo e análise da mancha Ocidental: placa de 1,2 x 10 5 células HEK 293T / poço em 2 ml de meio de crescimento completo na placa de 6 poços (0,3 x 10 5 células HEK 293T em 0,5 ml de meio de crescimento completo por poço em placas de 24 poços ).
  2. Prepare o ADN para transfecção de acordo com o protocolo do fabricante: Effectene (Qiagen) é utilizado para imunofluorescência. Trânsito LT1 (Mirus) é usado para análises de fluxo de blot e citometria ocidental. Quantidade de ADN utilizada é listado abaixo.
    Placa de 24 poços (ng) Placa de 6 poços (ng)
    PCP-vector 10 50
    VN N-AKAP-Lbc 200 1000
    VC N-PDE4D3-FL (full-length PDE4D3) 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 100
    VC-N-PDE4D3 UCR1 (PDE4D3 um fragmento N-terminal contém o domínio UCR1) 100
    VC-N-PDE4D3 UCR2 + CAT (fragmento C-terminal contendo os domínios PDE4D3 UCR2 e catalítico) 100
    A transfecção utilizando Effectene (6 poços):
    1. Adicionar quantidade indicada de DNA de plasmídeo + 4 ul potenciador de 100 ul de tampão CE, misturar e incubar durante 5 min à temperatura ambiente.
    2. Adicionar 5 uL Effectene, mistura, e incubar durante 10 min atemperatura ambiente. Adicionar gota a gota, para as células.
    Transfecção utilizando trânsito-LT1 (6-well/24-well):
    1. Adicionar quantidade indicada de DNA de plasmídeo a 250 μl/50 ul de Opti-MEM I meio livre de soro em um tubo estéril.
    2. Adicionar trânsito LT1-reagente para a mistura de DNA diluído e gentilmente pipeta para misturar. (Transit-LT1 Reagente: relação DNA é de 3 ml de trânsito-LT1 reagente por 1 mg de DNA).
    3. Incubar por 30 minutos em temperatura ambiente e adicionar gota a gota, para as células.

2. Preparação de células para citometria de fluxo, Western Blot e Imunofluorescência

  1. 24 horas após a transfecção, verifique fluorescência sob microscópio de epifluorescência, antes de células colheita.
  2. Preparação de células para análise por citometria de fluxo:
    1. Lavar as células com 0,5 ml / 2 ml de PBS gelado para placas 24-well/6-well.
    2. Retire células usando 50 mL μl/250 0,05% de tripsina.
    3. Neutraliza-se com 200 ul de tripsina / 1 ml de meio DMEM.
    4. Collect 250 ul de células (tanto para placa de 24 poços e 6 poços) por centrifugação a 500 xg durante 5 min, utilizar as células restantes (1 mL) para análise de Western blot.
    5. Ressuspender as células em 250 ul de tampão FACS [PBS + 0,5% (w / v) de BSA + 2 mM de EDTA], armazenar em gelo para análise de citometria de fluxo. As células também podem ser fixados em paraformaldeído a 1% (em PBS), se a análise de citometria de fluxo não será imediata.
  3. Preparação de células para análise de Western blot, realizado em paralelo com a preparação de células para análise de citometria de fluxo.
    1. Lavar as células com 2 ml de 1x PBS gelado, lise de células por adição de 100 ul de tampão de lise celular [tampão 10 mM de fosfato de sódio, pH 6,95, 150 mM NaCl, 5 mM de EDTA, 5 mM de EGTA, 1% de Triton X-100] .
    2. Recolhe ligado celular por centrifugação durante 10 min a 21.000 xg, a 4 ° C.
    3. Quantificar a concentração de proteína pelo ensaio de proteína Bradford, coloque a mesma quantidade de proteína por pista para SDS-PAGE, e transferir para nitrocelulose por immunoblotting.
    4. Preparação de células para imunofluorescência.
      1. Lavar as células 3x com 2 ml de PBS, as células fixar em 1 ml de 3,7% de paraformaldeído (em PBS) durante 10 min à temperatura ambiente, em seguida, lavar 3x com 2 ml de PBS durante 5 min.
      2. Monte cobrir deslizamento em uma lâmina de vidro, utilizando-se de meio de montagem. Selar as bordas lamela usando unha polonês, se necessário.
      3. Armazenar as lâminas a 4 ° C antes da análise.

    3. Citometria de fluxo e microscopia de imunofluorescência

    1. A citometria de fluxo é realizada utilizando um Beckman Coulter Ciano ADP, equipado com 488 nm, 405 nm, 642 nm e lasers de estado sólido. Software Summit é utilizado para aquisição e análise.
      1. Calibrar citômetro de fluxo, utilizando contas padrão.
      2. Gráfico de dispersão para a frente (FSC) / para o lado de dispersão (SSC) em uma escala linear para gating população de células vivas.
      3. Plot largura de pulso FSC / tensão para gating população de células vivas não agregada.
      4. Plot count/FL6 (PCP fluorescence, 405 nm) numa escala logarítmica para gating células não agregadas vivos PCP-positivos.
      5. Plot count/FL1 (YFP fluorescência, 488 nm) em uma escala logarítmica para a intensidade BiFC.
      6. Executar amostras YFP-CFP-dupla negativa, ajuste FSC, SSC, FL1 e FL6 foto tubo multiplicador (PMT) de tensão para definir o limite para cada sinal.
      7. Executar único positivo (ambos YFP + e PCP +) amostras para futura compensação off-line
      8. Adquirir pelo menos 10.000 eventos fechados (células não agregados ao vivo PCP +) para análise.
    2. Microscopia de imunofluorescência é realizada utilizando uma Zeiss LSM 510 microscópio confocal Nota:. Que é importante para manter todas as configurações (como o zoom, pinhole, ganho de detector, amplificador offset, tamanho do quadro, velocidade de digitalização, digitalização média e potência do laser) consistente entre amostras para comparação adequada de todos os dados.

    4. Análise de Dados (realizada utilizando Summit Software)

    1. Configure o protocolo de análise semelhante à acquisitíon com gating adequada:
      Gate 1 em FSC / SSC para as células vivas.
      Gate 2 em FSC / largura de pulso do Portão 1 para as células vivas não agregados.
      Portão 3 em contagem / CFP do Portão 3 para o PCP não agregada + células vivas.
    2. Compensar YFP e CFP sinal usando YFP + e + PCP células positivas individuais.
    3. Re-determinam linhas de corte para as células CFP / YFP-positivos.
    4. Exportação YFP intensidade média de fluorescência (MFI) de PCP + células para o Excel para dados de plotagem.
    5. Normalizar YFP a níveis de IFM-AKAP Lbc, PDE4D3 expressão, e carregamento de controlo α-tubulina, tal como determinado por Western blot.

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Representative Results

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AKAP-Lbc e PDE4D3 construções (Figura 1B) foram fundidas com fragmentos de VN e VC, respectivamente. Interacção dos AKAP-Lbc e PDE4D3 funcional resulta em YFP fluorescência (Figura 1A). Aqui usamos o método BiFC para mapear locais AKAP-LBC-vinculativos PDE4D3. Upstream uma região conservada (UCR1), a região a montante conservada 2 (UCR2) e região catalítica (CAT) são conservados entre as proteínas da família da PDE4, por conseguinte, o comprimento total (FL), e UCR1 UCR2 mais CAT foram usadas para o rastreio de o sítio de ligação de PDE4D3 para AKAP-Lbc. A expressão de VN-AKAP-Lbc e VC-PDE4D3-fragmentos HEK 293T células resulta na intensidade de fluorescência em diferentes (Figura 1C). BiFC indica que tanto UCR1 e UCR2 + CAT contribuir para a interação de PDE4D3 com AKAP-Lbc. A maior intensidade de fluorescência resultante da interacção AKAP-LBC-UCR1, quando comparado a AKAP-LBC-UCR2 + CAT, indica que a PDE-UCR1 liga a AKAP-Lbc melhor do que a PDE-UCR2 + CAT.

(Figura 2A), e os agregados de células foram excluídos usando SSC versus largura de pulso duplo ponto (Figura 2B). Células com sinal BiFC ou expressão PCP só foram used para determinar a compensação e cut-off para as células sem fluorescência (Figuras 2C-2F). PCP vector foi co-transfectadas com construções de expressão e BIFC PCP foi usada como um marcador positivo para indicar a transfecção bem sucedida. Apenas as células PCP + foram usadas para medição de fluorescência BiFC. A transfecção de quantidades crescentes de PDE4D3 resultou num aumento Vénus (YFP) BiFC sinal (Figura 3A), enquanto o sinal de PCP permaneceram inalterados (Figura 3B). Expressão de VN-AKAP-Lbc e quantidades crescentes de VC-PDE4D3 foi confirmada por Western blot (Figura 3C). Em geral, o aumento da expressão da PDE resultou num aumento linear da fluorescência BiFC correlacionando os níveis de expressão de PDE (Figura 3D). Estes resultados comprovaram a utilização de citometria de fluxo para quantificar a interacção AKAP-LBC-PDE4D3 medindo a intensidade média da fluorescência (IMF) das BiFC. Por isso, usou essa metodologia para mapear sítios de ligação AKAP-Lbc dentro PDE4DVN-3, utilizando-AKAP Lbc e VC-PDE4D3 construtos. De acordo com as nossas observações na Figura 1C, a expressão de VN-AKAP-Lbc e VC-PDE4D3-UCR2 + CAT resultou num sinal BiFC inferior quando comparado com VC-PDE4D3-FL e VC-PDE4D3-UCR1 (Figura 4B). A expressão da proteína semelhante foi observado em todas as amostras de fluxo (Figura 4C) e média de fluorescência foi normalizada para os níveis de expressão relativos de AKAP-lbc, por PDE4D3 e α-tubulina. Portanto, normalizada BiFC MFI indica que não existe uma diferença na intensidade de fluorescência entre AKAP-LBC-PDE4D3-FL e AKAP-LBC-PDE4D3-UCR1, mas muito mais baixa do sinal de AKAP-LBC-PDE4D3-UCR2 interacção + CAT (Figura 4A ). Estes resultados sugerem que existem várias regiões que interagem com PDE4D3 AKAP-Lbc, e que PDE4D3-UCR1 primária é a região de interacção com AKAP-Lbc. Este resultado também foi confirmada por co-IP, o padrão-ouro para a interação proteína-proteína (Figura 5).

Figura 1
Figura 1. Análise BiFC de interação AKAP-LBC-PDE4D3 fragmento por microscopia de imunofluorescência. A) Esquema representativo de Complementação de fluorescência Bimolecular (BiFC). Fragmentos de Vênus; VN e VC são fundidos para AKAP-Lbc e PDE4D3 respectivamente. AKAP-LBC-PDE4D3 resultados de interação funcional de fluorescência YFP. B) Diagrama esquemático do PDE4D3 construções usadas para o mapeamento. C) sinais BiFC representativos de células HEK 293T transfectadas. As células foram co-transfectadas com VN-AKAP-Lbc e VC-PDE4D3 constructos (FL-,-UCR1, UCR2 +-CAT), para a análise BiFC. PCP-vector foi também co-transfectado como um marcador de transfecção. 24 horas pós-transfecção, as células foram fixadas para imagiologia. Sinal BiFC é mostrado em verde e PCP é mostrado em pseudo vermelho nas figuras fundidas. 9/50529fig1large.jpg "target =" _blank "> Clique aqui para ver a figura maior.

Figura 2
Figura 2. Determinação dos portões e de compensação para análise FACS. A) FSC vs SSC para células vivas portão e excluir detritos e células mortas. B) Side Scatter vs largura de pulso gráfico de pontos para células individuais portão e excluir agregados. C) Células que expressam CFP (células PCP +) antes de compensação. D Células que expressam) CFP (células PCP +) após a compensação YFP. A linha de corte para as células com expressão YFP foi re-determinado. E) células com sinal BiFC (células YFP +) antes de compensação. F) células com sinal BiFC (células YFP +) após a compensação PCP. A linha de corte para as células com expressão PCP foi re-determinado.target = "_blank"> Clique aqui para ver a figura maior.

Figura 3
Figura 3. Análise de interação AKAP-LBC-PDE4D3 usando Citometria BiFC-Flow, variando a quantidade de PDE4D3 expressão. A) Aumento do sinal BiFC dentro das células PCP + transfectadas com quantidades crescentes de VC-PDE4D3. As células foram transfectadas com PCP (10 ng), VN-AKAP-Lbc (200 ng) e de quantidades crescentes de VC-PDE4D3 (2,5 ng a 80 ng). Células PCP + ao vivo não agregados foram fechado e YFP fluorescência é mostrado como YFP vs Encaminhar Scatter dupla gráfico de pontos. Células YFP + são mostrados em verde. Análise de Western blot dados representativos de 5 ng, 20 ng e 80 ng VC-PDE4D3 é mostrado. B) CFP fluorescência em células vivas é mostrado como PCP vs Encaminhar Scatter dupla gráfico de pontos, indicando fluorescência PCP consistente entre todas as amostras. C), demonstrando aumentando PDE4D3 expressioN consistente com a expressão de AKAP-Lbc e α-tubulina (utilizado como um controlo de carga). D) Vénus (YFP), a intensidade de fluorescência (IMF) das células PCP Média + está correlacionada com a expressão de VC-PDE4D3. Mudança Fold de ambos YFP MFI a partir de células PCP + é plotada juntamente com PCP MFI mudança dobra a partir de células vivas não agregados. Níveis de expressão relativa de VC-PDE4D3 determinado pela análise de Western blot J imagem também são plotados. Clique aqui para ver a figura maior .

Figura 4
Figura 4. Análise BiFC de interação AKAP-Lbc com PDE4D3-FL, PDE4D3-UCR1, PDE4D3-UCR2 + CAT citometria de fluxo. A) interação AKAP-LBC-PDE4D3-fragmento foi quantificada por Venus-MFI normalizada para a expressão da proteína (AKAP-Lbc, PDE4D3 fragmentos e carregamento de controle α-tubulina). Diferença em sinal BiFC foram examinadas por uma análise de variância (ANOVA) Um valor de p <0,01 é considerada muito significativa (**), enquanto um valor de p> 0,05 é considerado não significativo (ns). B) sinal BiFC Representante na HEK 293T transfectadas células. As células HEK 293T foram co-transfectadas com PCP, VN-AKAP-Lbc e VC-PDE4D3 constructos (FL-,-UCR1,-UCR2 + CAT). As células não-agregadas ao vivo PCP + foram fechado, e sua fluorescência BiFC é mostrado na YFP vs Encaminhar Scatter dupla gráfico de pontos. C) Western Blot indicando expressão comparável de AKAP-Lbc e PDE4D3-fragmentos. Clique aqui para ver a figura maior .

Figura 5
Figura 5. Confirmação da análise de citometria de fluxo por co-imunoprecipitação. Células HEK 293T foram co-transfectadaspara a expressão de V5-AKAP-Lbc e GFP-PDE4D3 construções (-FL, UCR1-,-UCR2 + CAT). 48 horas pós-transfecção, AKAP-Lbc foi imunoprecipitada utilizando V5-agarose. A ligação de PDE4D3-FL, e UCR1 UCR2 + CAT foi detectada por SDS-PAGE e Western blot utilizando o anticorpo primário anti-GFP. O PDE4D3 entrada correspondente utilizados para a imunoprecipitação também é mostrado, indicando expressão semelhante para todos os PDE4D3-fragmentos.

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Discussion

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BiFC é um método simples e sensível para estudar a interacção proteína-proteína. Este método não pode ser utilizado para identificar novas interacções proteína-proteína, no entanto, é especialmente conveniente para confirmar a interacção proteína-proteína no interior das células e para estudar as propriedades funcionais, tais como a localização subcelular de complexos de proteínas, mapeamento de sítios de interacção proteína-proteína, e para o rastreio de péptidos / moléculas pequenas que podem modular a interacção proteína-proteína. Porque VN e VC fragmentos são não-fluorescente, a fluorescência de fundo é baixa, auxiliando assim a sensibilidade do presente ensaio. O tempo é necessário para amadurecer / estabilizar a interacção proteína-VN-VC-proteína, portanto, não há atraso para visualizar a interacção proteína-proteína, e óptima pontos temporais podem, por conseguinte, têm de ser determinados empiricamente. Deve também notar-se que a interacção proteína-VN-VC-proteína não é reversível, por conseguinte, infelizmente, com corrente Vénus BiFC constrói este ensaio não é apropriado tØ estudo cinética dinâmicas de interação proteína-proteína.

Controles adequados são importantes para a análise BiFC. Um controle negativo adequado inclui proteínas não interagem ou peptídeos não-específicos no vetor BiFC relevante, ou se possível, um mutante que interrompe a interação proteína-proteína. Vetor BiFC vazio não é um bom controle, uma vez que resulta em alta fluorescência de fundo não específica. Se BiFC não é observado em duas proteínas que interagem, de expressão deve ser analisado. Além disso, o sinal BiFC pode variar dependendo dos sítios de interacção proteína-proteína. Deve notar-se que a modulação espacial de VN e VC interacção pode também afectar a intensidade de fluorescência, por conseguinte, é importante, inicialmente, para a realização de experiências BIFC utilizando tanto do C-terminal e N-terminal de VN / VC construções de expressão. Por exemplo, BiFC pode não ocorrer se a interação proteína-proteína bloqueia a re-associação dos fragmentos Venus. Portanto, múltiplas combinações de VN e VC constrói should ser testado (isto é, C e proteínas de fusão de terminal N).

A intensidade de fluorescência de BiFC é proporcional à força de interacção proteína-proteína, com uma intensidade mais elevada BiFC indicando uma maior interacção e um menor intensidade de fluorescência mais fraca que sugere a interacção. BiFC MFI é, portanto, utilizado como indicador da interação proteína-proteína. Para a análise precisa da interacção proteína-proteína por BiFC, é muito importante que a análise de Western blot é realizada para assegurar a igualdade de expressão de diferentes construções e que não está a ocorrer a degradação da proteína, que podem interferir com a análise correcta. Lisado das mesmas amostras é, portanto, preferido por análise de Western blot para determinar a expressão da proteína semelhante para todas as amostras analisadas. Além disso, é essencial para determinar o valor adequado de plasmídeos para transfecção para garantir expressão linear e interacção das proteínas e, entre esta gama, a interacção da proteína correlaciona with da intensidade de fluorescência do sinal BiFC.

Baixa quantidade de PCP plasmídeo é utilizado como um marcador para a transfecção bem sucedida, apenas as células positivas para PCP foram analisados. Uma proteína fluorescente diferente, tal como RFP pode ser utilizada para minimizar o sangramento-through entre cores 11. Por citometria de fluxo, células positivas individuais são necessários para ser incluído para a compensação. Se possível, pelo menos, 10.000 células positivas são contadas da PCP para garantir um bom tamanho de amostra.

Em resumo, aqui demonstram que a metodologia de acoplamento BiFC com análise citométrica de fluxo pode ser usado como um bom indicador da interacção proteína-proteína no interior das células. A análise tradicional do BiFC usando microscópio de imunofluorescência é demorado, e o tamanho da amostra é muito inferior ao que corresponde à análise por citometria de fluxo. Assim, o acoplamento de citometria de fluxo com BiFC pode ser vantajoso para a análise da interacção proteína-proteína, quando a eficiência de transfecção é baixa. Nesterelatório, que se aproveitou de Citometria BiFC-Flow para mapear os sítios de interação em PDE4D3 para a ligação com AKAP-Lbc. Esta técnica também pode ser estendido para triagem de moléculas ou peptídeos que podem atrapalhar ou melhorar a interação proteína-proteína, para a descoberta de drogas 12. Este método também pode ser usado para estudar certos eventos fisiológicos, tais como a internalização induzida pelo ligando de 13 de GPCR.

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Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Agradecemos ao laboratório O'Bryan a UIC para avaliação experimental crítica e discussão. Este trabalho foi financiado pela American Heart Association Grant 11SDG5230003 ao Centro GKC e Nacional para o avanço da ciência translacional - Centro de UIC para Ciências Clínicas e Translational Grant UL1TR000050.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Dulbecco’s modified Eagle’s media (DMEM) Invitrogen 11965-092
Penicilin-Streptomycin (pen/strep), 100x Invitrogen 15070-063
Fetal Bovine Serum (FBS) Invitrogen 16000-044
Anti-Flag antibody Sigma M2, F1804
Anti-HA antibody Covance 16B12, MMS-101R
α-tubulin Sigma DM1A, T9026
Anti-GFP antibody Clontech 632569
Cell culture plates, 6-well tissue culture treated Thermo Fisher Scientific 130184
HEK 293T cells ATCC CRL-11268
Maxiprep plasmid purification kit, high speed Qiagen 12663
Dulbecco’s Phosphate-buffered saline (DPBS), sterile 1x Invitrogen 14190-144
Trypsin-EDTA, 0.05% (w/v) Gibco 25300
Polystyrene round-bottom tubes for FACS staining BD Biosciences 352052
Paraformaldehyde Fisher Scientific S74337MF
Prolong gold antifade reagent with DAPI Invitrogen P-36931
Superfrost plus Microscope slides Fisher Scientific 12-550-15
Fisherfinest premium cover glass Fisher Scientific 12-548-5P
EQUIPMENT
CO2 air-jacketed Incubator NuAIR DH autoflow
Confocal microscope LSM510 META Carl Zeiss, Inc
Electrophoresis and transfer unit Biorad
Cyan ADP Flow Cytometer Beckman Coulter

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References

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Citometria de fluxo e de Complementação de fluorescência Bimolecular: A alta taxa de transferência método quantitativo para estudo de interação proteína-proteína
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Wang, L., Carnegie, G. K. Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction. J. Vis. Exp. (78), e50529, doi:10.3791/50529 (2013).More

Wang, L., Carnegie, G. K. Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction. J. Vis. Exp. (78), e50529, doi:10.3791/50529 (2013).

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