Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

El análisis por citometría de Complementación fluorescencia Bimolecular: A High Throughput Método cuantitativo para estudiar la interacción proteína-proteína

doi: 10.3791/50529 Published: August 15, 2013

Summary

Análisis citométrico de flujo de Complementación fluorescencia bimolecular proporciona un método cuantitativo de alto rendimiento para estudiar la interacción proteína-proteína. Esta metodología se puede aplicar a los sitios de unión de proteínas y de mapeo para los factores que regulan la interacción proteína-proteína de cribado.

Abstract

Entre los métodos para el estudio de la interacción proteína-proteína dentro de las células, complementación bimolecular de fluorescencia (BiFC) es relativamente simple y sensible. BiFC se basa en la producción de fluorescencia utilizando dos fragmentos no fluorescentes de una proteína fluorescente (Venus, una variante de la proteína fluorescente amarilla, se utiliza aquí). Fragmentos de Venus no fluorescentes (VN y VC) se fusionan a dos proteínas que interactúan (en este caso, AKAP-Lbc y PDE4D3), produciendo fluorescencia debido a la interacción VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 y la formación de una proteína fluorescente funcional dentro de las células.

BiFC proporciona información sobre la localización subcelular de complejos de proteínas y la fuerza de las interacciones de proteínas basado en la intensidad de fluorescencia. Sin embargo, el análisis mediante microscopía BiFC para cuantificar la fuerza de la interacción proteína-proteína es mucho tiempo y es algo subjetivo debido a la heterogeneidad en la expresión de proteínas y la interacción. Por citometría de flujo de acoplamientoanálisis con metodología BiFC, la BiFC señal de la interacción proteína-proteína fluorescente se puede medir con precisión para una gran cantidad de células en un corto período de tiempo. Aquí, demostramos una aplicación de esta metodología para mapear regiones en PDE4D3 que se requieren para la interacción con AKAP-Lbc. Esta metodología de alto rendimiento se puede aplicar a la detección de factores que regulan la interacción proteína-proteína.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

650.000 interacciones proteína-proteína se estima que existen en el interactome humana, jugando un papel crítico en el mantenimiento de las funciones celulares normales 1,2. Además de co-inmunoprecipitación (co-IP), el estándar de oro para el estudio de la interacción proteína-proteína a partir de lisado de células, varios ensayos de complementación de fragmentos de proteínas (PCA) se han desarrollado para mejorar la sensibilidad en la detección de la interacción proteína-proteína dentro de las células 3. Las técnicas incluyen la transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET), la transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia (BRET) y complementación bimolecular de fluorescencia (BiFC) 4,5. BiFC se basa en la asociación facilitado de dos fragmentos de una proteína fluorescente (aquí usamos Venus; una variante YFP) que están cada uno fusionado a un potencial socio de interacción de proteínas (en este ejemplo utilizamos AKAP-Lbc y PDE4D3). La interacción de las dos proteínas de interés dentro de las células resultados en la fluorescencia funcional, que se pueden visualizar por fmicroscopía luorescence utilizando ya sea células vivas o fijas 6,7,8. En comparación con otros PCAs, BiFC es sensible y técnicamente menos exigente, con potencial para estudiar la localización celular en células vivas. Un inconveniente importante de esta técnica, sin embargo es que una vez formado, el complejo proteína fluorescente puede no ser revertida. Por lo tanto, no es un buen método para estudiar la interacción proteína-proteína dinámico. En este trabajo, utilizamos BiFC para asignar los sitios de interacción de PDE4D3 con AKAP-Lbc controlando la intensidad de fluorescencia de Venus. En comparación con el análisis tradicional utilizando microscopía de fluorescencia, que es mucho tiempo y mano de obra intensiva (si no se lleva a cabo utilizando maquinaria de alto rendimiento automatizado), citometría de flujo proporciona un análisis cuantitativo sencillo de miles de células en una población heterogénea durante un corto período de tiempo 9, 10. Aquí, mediante la realización de una comparación lado a lado de análisis de citometría de flujo-BiFC tradicional y co-IP, se demuestra que las dos métodos de proporcionar información comparable, sin embargo, el flujo de análisis de citometría de BiFC consume menos tiempo y utiliza menos material que puede ser más útil cuando las células de interés son limitados.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Transfección celular

  1. Células de la placa el día antes de la transfección, plateando el menor número de células de inmunofluorescencia.
    1. Por inmunofluorescencia: en una placa de 6 pocillos, escudo cubreobjetos de vidrio (1 por pocillo) con 0,02% de gelatina a 37 ° C durante al menos 4 horas, se lava una vez con medio, y para cada pozo, placa 1 x 10 5 células HEK 293T las células en 2 ml de medio de crecimiento completo [medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) más 10% de FBS].
    2. Para citometría de flujo y análisis de transferencia Western: placa de 1,2 x 10 5 células HEK 293T / pocillo en 2 ml de medio de crecimiento completo en placa de 6 pocillos (5 x 10 células HEK 293T 0,3 en 0,5 ml de medio de crecimiento completo por pocillo en placas de 24 pocillos ).
  2. Preparar ADN para la transfección de acuerdo con el protocolo de fabricación: Effectene (Qiagen) se utiliza para inmunofluorescencia. TransIT-LT1 (Mirus) se utiliza para citometría de flujo y análisis de transferencia de Western. Cantidad de ADN usada se enumeran a continuación.
    Placa de 24 pocillos (ng) Placa de 6 pocillos (ng)
    CFP-vector 10 50
    VN N-AKAP-Lbc 200 1000
    VC N-PDE4D3-FL (longitud completa PDE4D3) 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 100
    VC-N-PDE4D3 UCR1 (un fragmento N-terminal de PDE4D3 que contiene el dominio UCR1) 100
    VC-N-PDE4D3 UCR2 + CAT (un fragmento C-terminal de PDE4D3 que contiene los dominios UCR2 y catalítica) 100
    La transfección utilizando Effectene (6 pocillos):
    1. Añadir cantidad indicada de ADN plásmido + 4 l potenciador a 100 l de tampón CE, la mezcla, y se incuba durante 5 min a temperatura ambiente.
    2. Añadir 5 l Effectene, mezclar e incubar durante 10 minutos atemperatura ambiente. Añadir gota a gota a las células.
    La transfección con tránsito LT1 (6-well/24-well):
    1. Añadir cantidad indicada de ADN plásmido a 250 μl/50 l de Opti-MEM medio libre de suero que en un tubo estéril.
    2. Añadir TransIT-LT1 reactivos a la mezcla de ADN diluido y pipetear suavemente para mezclar. (Tránsito-LT1 Reactivo: relación DNA es de 3 l de tránsito LT1 reactivo por 1 g de ADN).
    3. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente y añadir, gota a gota a las células.

2. Preparación de las células para citometría de flujo, Western Blot e inmunofluorescencia

  1. 24 h después de la transfección, compruebe fluorescencia al microscopio de epifluorescencia antes de recoger las células.
  2. Preparación de las células para el análisis de citometría de flujo:
    1. Lavar las células con 0,5 ml / 2 ml de PBS enfriado en hielo para las placas 24-well/6-well.
    2. Separar las células utilizando 50 μl/250 l 0,05% de tripsina.
    3. Neutralizar la tripsina con 200 l / 1 ml de medio DMEM.
    4. Collect 250 células l (tanto para la placa de 24 pocillos y 6 pocillos) por centrifugación a 500 xg durante 5 min, se utilizan las células restantes (1 ml) para análisis de transferencia Western.
    5. Resuspender las células en 250 l de tampón FACS [PBS + 0,5% (w / v) de BSA + 2 mM de EDTA], almacenar en hielo para el análisis de citometría de flujo. Las células también pueden ser fijadas en paraformaldehído al 1% (en PBS) si el análisis de citometría de flujo no será inmediata.
  3. Preparación de las células para el análisis de Western blot: lleva a cabo en paralelo con la preparación de células para el análisis de citometría de flujo.
    1. Lavar las células 1 vez con 2 ml de PBS enfriado en hielo, lisar las células mediante la adición de 100 l de tampón de lisis celular [10 mM de tampón de fosfato de sodio, pH 6,95, 150 mM de NaCl, 5 mM de EDTA, 5 mM EGTA, 1% de Triton X-100] .
    2. Recoger lisado de células por centrifugación durante 10 min a 21.000 xg a 4 ° C.
    3. Cuantificar la concentración de proteína mediante el ensayo de proteínas Bradford, cargar la misma cantidad de proteína por carril para SDS-PAGE y transferencia a nitrocelulosa para inmunotransferencia.
    4. Preparación de las células para inmunofluorescencia.
      1. Lavar las células 3 veces con 2 ml de PBS, fijar las células en 1 ml de paraformaldehído al 3,7% (en PBS) durante 10 min a temperatura ambiente, a continuación, lavar 3 veces con 2 ml de PBS durante 5 min.
      2. Monte cubreobjetos sobre un portaobjetos de vidrio, utilizando medio de montaje. Selle los bordes cubreobjetos utilizando esmalte de uñas si es necesario.
      3. Guarde las diapositivas a 4 ° C antes del examen.

    3. Citometría de flujo y microscopía de inmunofluorescencia

    1. La citometría de flujo se realizó utilizando un Beckman Coulter Cian ADP, equipada con 488 nm, 405 nm, 642 nm y los láseres de estado sólido. Cumbre software se utiliza para la adquisición y análisis.
      1. Calibrar citómetro de flujo usando perlas estándar.
      2. Terreno dispersión frontal (FSC) / Inclinación de lado de dispersión (SSC) en una escala lineal para la población de células vivas de puerta.
      3. Terreno FSC / tensión ancho de pulso de la población de células vivas no agregada gating.
      4. Terreno count/FL6 (PPC fluorescence, 405 nm) en una escala logarítmica para las células PPC-positivos en vivo no agregadas de activación periódica.
      5. Terreno count/FL1 (YFP fluorescencia, 488 nm) en una escala logarítmica de la intensidad BiFC.
      6. Ejecutar las muestras negativas YFP-PPC-doble, ajuste FSC, SSC, FL1 y FL6 foto tubo multiplicador (PMT) para ajustar la tensión de umbral para cada señal.
      7. Ejecute un solo positivo (tanto YFP y PPC + +) muestras para futuras compensaciones fuera de línea
      8. Adquirir al menos 10.000 eventos cerradas (células no agregadas en vivo PPC +) para su análisis.
    2. La inmunofluorescencia se realizó con un LSM 510 microscopio confocal Zeiss Nota:. Es importante tener todas las configuraciones (como el zoom, pinhole, la ganancia del detector, amplificador de desplazamiento, tamaño, velocidad de exploración, exploración de la media, y la potencia del láser) consistente entre muestras para comparación adecuada de todos los datos.

    4. Análisis de Datos (realizó utilizando el software Summit)

    1. Configurar el protocolo de análisis similar a la de acquisition con la selección adecuada:
      Puerta 1 en gráfico de puntos de FSC / SSC para las células vivas.
      Puerta 2 de FSC / ancho de pulso de la puerta 1 para las células vivas no agregados.
      Puerta 3 en el recuento / PPC de la puerta 3 de la PPC no agregada + células vivas.
    2. Compensar YFP y PPC señal usando + y PPC + células positivas individuales YFP.
    3. Vuelva a determinar las líneas de corte para las células CFP / YFP-positivo.
    4. Export YFP intensidad media de fluorescencia (MFI) de PPC + células a Excel de datos de trazado.
    5. Normalizar YFP IMF a los niveles de expresión de AKAP-Lbc, PDE4D3, y control de carga α-tubulina, según se determinó por Western blot.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

AKAP-Lbc y PDE4D3 construcciones (Figura 1B) se fusionaron a VN y fragmentos de VC, respectivamente. Interacción de AKAP-Lbc y PDE4D3 resultados funcionales en YFP fluorescencia (Figura 1A). Aquí se utiliza el método BiFC para asignar sitios AKAP-Lbc vinculantes en PDE4D3. Aguas arriba región conservada 1 (UCR1), región aguas arriba conservada 2 (UCR2) y la región catalítica (CAT) se conservan entre las proteínas de la familia de PDE4, por lo tanto, de longitud completa (FL), UCR1 y UCR2 más CAT se utilizaron para el cribado el sitio de unión de PDE4D3 a AKAP-Lbc. La expresión de VC-PDE4D3 fragmentos en HEK 293T células resultados en la fluorescencia VN-AKAP-Lbc y con diferente intensidad (Figura 1C). BiFC indica que tanto UCR1 y UCR2 + CAT contribuyen a la interacción de PDE4D3 con AKAP-Lbc. Una mayor intensidad de la fluorescencia resultante de la interacción AKAP-Lbc-UCR1, cuando se compara con AKAP-Lbc-UCR2 + CAT, indica que la PDE-UCR1 se une a AKAP-Lbc mejor que la PDE-UCR2 + CAT.

(Figura 2A), y los agregados de células fueron excluidos utilizando SSC vs ancho de pulso doble punto (Figura 2B). Las células con señal BiFC o expresión PPC solo eran used para determinar la indemnización y de corte para las células sin fluorescencia (Figuras 2C-2F). PPC vector se co-transfectadas con las construcciones de expresión PPC BiFC y se utilizó como un marcador positivo para indicar la transfección exitosa. Sólo las células de la PPC + se utilizaron para la medición de la fluorescencia BiFC. La transfección de cantidades crecientes de PDE4D3 resultó en un incremento de Venus (YFP) BiFC señal (Figura 3A), mientras que la señal PPC se mantuvo sin cambios (Figura 3B). Expresión de VN-AKAP-Lbc y cantidades crecientes de VC-PDE4D3 fue confirmada por Western blot (Figura 3C). En general, el aumento de expresión de PDE resultó en un aumento lineal de BiFC fluorescencia en correlación con los niveles de expresión de PDE (Figura 3D). Estos resultados validan el uso de la citometría de flujo para cuantificar la interacción AKAP-Lbc-PDE4D3 mediante la medición de la intensidad de fluorescencia media (MFI) de BiFC. Por ello, utilizó esta metodología para asignar los sitios de unión AKAP-Lbc dentro PDE4D3 usando VN-AKAP-Lbc y construcciones VC-PDE4D3. De acuerdo con nuestras observaciones en la Figura 1C, la expresión de VN-AKAP-Lbc y VC-PDE4D3-UCR2 + CAT se tradujo en menor señal BiFC en comparación con VC-PDE4D3-FL y VC-PDE4D3-UCR1 (Figura 4B). Expresión de la proteína similar fue observado en todas las muestras de flujo (Figura 4C) y la media de fluorescencia se normalizó a los niveles de expresión relativos de AKAP-Lbc, PDE4D3, y α-tubulina. Por lo tanto, normalizada BiFC IMF indica que no hay diferencia en la intensidad de fluorescencia entre AKAP-Lbc-PDE4D3-FL y AKAP-Lbc-PDE4D3-UCR1, pero la señal mucho menor para AKAP-Lbc-PDE4D3-UCR2 + interacción CAT (Figura 4A ). Estos resultados sugieren que hay múltiples regiones en PDE4D3 que interactúan con AKAP-Lbc, y que PDE4D3-UCR1 es la región principal de la interacción con AKAP-Lbc. Este resultado también se confirmó por la co-IP, el estándar de oro para la interacción proteína-proteína (Figura 5).

Figura 1
Figura 1. El análisis de la interacción BiFC AKAP-Lbc-PDE4D3 fragmento por microscopía de inmunofluorescencia. A) representativa esquemática de Complementación fluorescencia bimolecular (BiFC). Fragmentos de Venus, VN y VC se fusionan a AKAP-Lbc y PDE4D3 respectivamente. AKAP-LBC-PDE4D3 resultados de la interacción en la fluorescencia YFP funcional. B) Representación esquemática de PDE4D3 construcciones utilizadas para la proyección. C) Señales BiFC representativos de células HEK 293T transfectadas. Las células fueron co-transfectadas con VN-AKAP-Lbc y VC-PDE4D3 constructos (FL-,-UCR1,-UCR2 + CAT) para el análisis de BiFC. PPC-vector fue también co-transfectadas como un marcador de transfección. 24 h después de la transfección, las células fueron fijadas para formación de imágenes. BiFC señal se muestra en verde y PPC se muestra en pseudocolor roja en las cifras combinadas. 9/50529fig1large.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver más grande la figura.

La figura 2
Figura 2. Determinación de las puertas y la indemnización por análisis FACS. A) FSC vs SSC gráfico de puntos de células vivas puerta y excluir suciedad y las células muertas. B) Side Scatter vs pulso gráfico de puntos anchura de las células individuales de compuerta y excluir agregados. C) Las células que expresan PPC (células PPC +) antes de la compensación. D ) Las células que expresan PPC (PPC + células) después de la compensación YFP. La línea de corte para las células con expresión YFP fue celdas con BiFC señal (células YFP +) antes de la compensación. F células con BiFC señal (células YFP +) después de la compensación PPC vuelve a determinar. E)). La línea de corte para las células con expresión de la PPC se volvió a determinar.target = "_blank"> Haga clic aquí para ver más grande la figura.

Figura 3
Figura 3. Análisis de la interacción AKAP-Lbc-PDE4D3 utilizando Citometría de Flujo BiFC-mediante la variación de la cantidad de PDE4D3 expresión. A) Aumento de señal BiFC dentro de las células PPC + transfectadas con cantidades crecientes de VC-PDE4D3. Las células fueron transfectadas con PPC (10 ng), VN-AKAP-Lbc (200 ng) y cantidades crecientes de VC-PDE4D3 (2,5 ng a 80 ng). Células PPC + en vivo no fueron agregados cerrada y fluorescencia YFP se muestra como YFP vs Forward Scatter parcela doble de puntos. Células YFP + se muestran en verde. Los datos representativos de 5 ng, 20 ng y 80 ng VC-PDE4D3 se muestra. B) PPC fluorescencia en células vivas se muestra como PPC vs Forward Scatter parcela doble de puntos, lo que indica la fluorescencia PPC consistente entre todas las muestras. C) El análisis de transferencia Western que demuestra aumentar PDE4D3 expression con la expresión coherente de AKAP-Lbc y α-tubulina (utilizado como control de carga). D) Venus (YFP) intensidad de fluorescencia media (MFI) de PPC + células se correlaciona con el CV-PDE4D3 expresión. Doble cambio de tanto YFP IMF a partir de células PPC + se representa a lo largo con PPC IMF veces el cambio de células vivas no agregados. También se representan los niveles de expresión relativos de VC-PDE4D3 determine Image J análisis de Western blot. Haz clic aquí para ver más grande la figura .

Figura 4
La Figura 4. El análisis de la interacción BiFC AKAP-Lbc con PDE4D3-FL, PDE4D3-UCR1, PDE4D3-UCR2 + CAT usando citometría de flujo. A) la interacción AKAP-Lbc-PDE4D3 fragmento se cuantificó por Venus-IFM normalizado de expresión de la proteína (AKAP-Lbc, PDE4D3 fragmentos y de control de carga de α-tubulina). Diferencia en señal de BiFC fueron examinados por una forma de análisis de varianza (ANOVA) Un valor de p <0,01 se considera muy significativa (**), mientras que un valor de p> 0,05 se considera no significativa. B) Representante señal BiFC (ns) en transfectadas HEK 293T las células. Las células HEK 293T fueron co-transfectadas con PPC, VN-AKAP-Lbc y VC-PDE4D3 constructos (FL-,-UCR1,-UCR2 + CAT). Las células no agregadas en vivo PPC + fueron cerrada, y su fluorescencia BiFC se muestra en YFP vs Forward Scatter parcela doble de puntos. C) Western blot que indica la expresión comparable de PDE4D3 fragmentos AKAP-Lbc y. Haz clic aquí para ver más grande la figura .

La figura 5
Figura 5. Células HEK 293T Confirmación de análisis de citometría de flujo por la co-inmunoprecipitación. Fueron co-transfectadaspara la expresión de V5-AKAP-Lbc y GFP-PDE4D3 construcciones (FL-,-UCR1,-UCR2 + CAT). 48 horas después de la transfección, AKAP-Lbc se inmunoprecipitó utilizando perlas de agarosa-V5. La unión de PDE4D3-FL, UCR1 y UCR2 + CAT se detectó por SDS-PAGE y transferencia de Western usando anticuerpo primario anti-GFP. La correspondiente entrada de PDE4D3 usado para la inmunoprecipitación también se muestra, indicando expresión similar para todos los PDE4D3-fragmentos.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

BiFC es un método simple y sensible para estudiar la interacción proteína-proteína. Este método no se puede utilizar para identificar nuevas interacciones proteína-proteína, sin embargo, es especialmente conveniente para confirmar la interacción proteína-proteína dentro de las células y para estudiar las propiedades funcionales, tales como la localización subcelular de complejos de proteínas, mapeo de sitios de interacción proteína-proteína, y para la detección de pequeñas moléculas / péptidos que pueden modular la interacción proteína-proteína. Debido a fragmentos VN y VC son no fluorescente, la fluorescencia de fondo es bajo, ayudando así a la sensibilidad de este ensayo. Se necesita tiempo para madurar / estabilizar la interacción proteína-VN-VC-proteína, por lo que no hay retraso de la visualización de la interacción proteína-proteína y óptima puntos de tiempo por lo que puede que tenga que ser determinada empíricamente. También hay que señalar que la interacción proteína-VN-VC-proteína no es reversible, por lo tanto, por desgracia, con la corriente de Venus BiFC construye este ensayo no es adecuado tO Estudio de la cinética de dinámicas de interacción proteína-proteína.

Controles adecuados son importantes para el análisis BiFC. Un control negativo adecuado incluye proteínas no interaccionan o péptidos no específicos en el vector BiFC relevante, o si es posible, un mutante que interrumpe la interacción proteína-proteína. Vector BiFC vacío no es un buen control, ya que se traduce en alta fluorescencia de fondo no específica. Si BiFC no se observa en dos proteínas que interactúan, la expresión debe ser analizado. Además, la señal BiFC puede variar dependiendo de los sitios de interacción proteína-proteína. Cabe señalar que la modulación espacial de la interacción VN y VC también puede afectar a la intensidad de fluorescencia, por lo que inicialmente es importante para llevar a cabo experimentos utilizando tanto BiFC C-terminal y N-terminal de VN / VC construcciones de expresión. Por ejemplo, BiFC no puede ocurrir si la proteína-proteína interacción bloquea la re-asociación de los fragmentos de Venus. Por lo tanto, múltiples combinaciones de VN y VC construye hombrod ensayar (es decir, tanto de C y N de proteínas fusiones terminales).

La intensidad de fluorescencia de BiFC es proporcional a la fuerza de la interacción proteína-proteína, con mayor intensidad que indica BiFC interacción más fuerte y una intensidad de fluorescencia inferior sugiriendo interacción más débil. Por lo tanto, BiFC IMF se utiliza como indicador para la interacción proteína-proteína. Para el análisis preciso de la interacción proteína-proteína por BiFC, es muy importante que el análisis de Western blot se realizó para garantizar la igualdad de expresión de diferentes construcciones y que no se está produciendo la degradación de proteínas, que pueden interferir con el análisis correcto. El lisado de las mismas muestras tanto se prefiere para el análisis de Western blot para determinar la expresión de la proteína similar para todas las muestras analizadas. Además, es crítico para determinar la cantidad adecuada de plásmidos para la transfección para asegurar la expresión lineal y la interacción de las proteínas, y entre este rango, la interacción de la proteína se correlaciona wiª intensidad de la fluorescencia de la señal BiFC.

Baja cantidad de plásmido PPC se utiliza como un marcador para la transfección con éxito, las células positivas por lo que sólo la PPC se analizaron aquí. Una proteína fluorescente diferente, tal como RFP se podría utilizar para reducir al mínimo el sangrado a través de entre 11 colores. Por citometría de flujo, se necesitan células positivas individuales que se incluirán la compensación. Si es posible, al menos 10.000 células positivas se cuentan la PPC para garantizar un buen tamaño de la muestra.

En resumen, aquí se demuestra que la metodología de acoplamiento BiFC con el análisis de citometría de flujo se puede utilizar como un buen indicador de la interacción proteína-proteína dentro de las células. El análisis tradicional de BiFC usando microscopio de inmunofluorescencia es mucho tiempo, y el tamaño de la muestra es mucho menor que la correspondiente al análisis de citometría de flujo. Por lo tanto, el acoplamiento citometría de flujo con BiFC puede ser ventajoso para el análisis de la interacción proteína-proteína cuando la eficiencia de transfección es baja. En esteinforme, nos aprovechamos de Citometría BiFC-Flow para asignar los sitios de interacción en PDE4D3 por la unión a AKAP-Lbc. Esta técnica también se podría extender para la detección de moléculas o péptidos que puedan interrumpir o mejorar la interacción proteína-proteína, para el descubrimiento de fármacos 12. Este método también puede ser usado para estudiar ciertos eventos fisiológicos, tales como la internalización inducida por ligando de 13 de GPCR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

Agradecemos el laboratorio O'Bryan en la UIC para la evaluación experimental y la discusión crítica. Este trabajo fue apoyado por la American Heart Association Beca 11SDG5230003 al Centro GKC y Nacional para el Avance de la Ciencia Traslacional - UIC Centro de Ciencias de la clínica y traslacional Grant UL1TR000050.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Dulbecco’s modified Eagle’s media (DMEM) Invitrogen 11965-092
Penicilin-Streptomycin (pen/strep), 100x Invitrogen 15070-063
Fetal Bovine Serum (FBS) Invitrogen 16000-044
Anti-Flag antibody Sigma M2, F1804
Anti-HA antibody Covance 16B12, MMS-101R
α-tubulin Sigma DM1A, T9026
Anti-GFP antibody Clontech 632569
Cell culture plates, 6-well tissue culture treated Thermo Fisher Scientific 130184
HEK 293T cells ATCC CRL-11268
Maxiprep plasmid purification kit, high speed Qiagen 12663
Dulbecco’s Phosphate-buffered saline (DPBS), sterile 1x Invitrogen 14190-144
Trypsin-EDTA, 0.05% (w/v) Gibco 25300
Polystyrene round-bottom tubes for FACS staining BD Biosciences 352052
Paraformaldehyde Fisher Scientific S74337MF
Prolong gold antifade reagent with DAPI Invitrogen P-36931
Superfrost plus Microscope slides Fisher Scientific 12-550-15
Fisherfinest premium cover glass Fisher Scientific 12-548-5P
EQUIPMENT
CO2 air-jacketed Incubator NuAIR DH autoflow
Confocal microscope LSM510 META Carl Zeiss, Inc
Electrophoresis and transfer unit Biorad
Cyan ADP Flow Cytometer Beckman Coulter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Collura, V., Boissy, G. From protein-protein complexes to interactomics. Subcell Biochem. 43, 135-183 (2007).
  2. Stumpf, M. P., et al. Estimating the size of the human interactome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6959-6964 (2008).
  3. Shekhawat, S. S., Ghosh, I. Split-protein systems: beyond binary protein-protein interactions. Curr. Opin. Chem. Biol. 15, 789-797 (2011).
  4. Dwane, S., Kiely, P. A. Tools used to study how protein complexes are assembled in signaling cascades. Bioeng. Bugs. 2, 247-259 (2011).
  5. Piehler, J. New methodologies for measuring protein interactions in vivo and in vitro. Curr. Opin. Struct. Biol. 15, 4-14 (2005).
  6. Kerppola, T. K. Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells. Nat. Protoc. 1, 1278-1286 (2006).
  7. Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay. Nat. Protoc. 3, 1693-1702 (2008).
  8. Wong, K. A., O'Bryan, J. P. Bimolecular fluorescence complementation. J. Vis. Exp. (50), e2643 (2011).
  9. Sugarbaker, E. V., Thornthwaite, J. T., Temple, W. T., Ketcham, A. S. Flow cytometry: general principles and applications to selected studies in tumor biology. Int. Adv. Surg. Oncol. 2, 125-153 (1979).
  10. Koshy, S., Alizadeh, P., Timchenko, L. T., Beeton, C. Quantitative measurement of GLUT4 translocation to the plasma membrane by flow cytometry. J. Vis. Exp. (45), e2429 (2010).
  11. Smith, C. L. Basic confocal microscopy. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 14, (Unit 14), 11 (2008).
  12. Westwick, J. K., Lamerdin, J. E. Improving drug discovery with contextual assays and cellular systems analysis. Methods Mol. Biol. 756, 61-73 (2011).
  13. Kilpatrick, L. E., Holliday, N. D. Dissecting the pharmacology of G protein-coupled receptor signaling complexes using bimolecular fluorescence complementation. Methods Mol. Biol. 897, 109-138 (2012).
El análisis por citometría de Complementación fluorescencia Bimolecular: A High Throughput Método cuantitativo para estudiar la interacción proteína-proteína
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, L., Carnegie, G. K. Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction. J. Vis. Exp. (78), e50529, doi:10.3791/50529 (2013).More

Wang, L., Carnegie, G. K. Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction. J. Vis. Exp. (78), e50529, doi:10.3791/50529 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter