カルシウムの役割を評価するためのイメージングアッセイを生きる Published: August 25, 2013 doi: 10.3791/50531

DOI

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Christina Tam¹, Andrew R. Flannery¹, Norma Andrews¹

¹Department of Cell Biology and Molecular Genetics, University of Maryland

Summary

親油性色素FM1-43に曝露された細胞のライブイメージングは​​、孔形成毒素は原形質膜から除去されることにより、反応速度の正確な決定を可能にする。これは、Ca ^{2 +、}スフィンゴミエリナーゼおよび原形質膜の修復に関する他の要因のための要件を評価するために使用できる高感度のアッセイである。

Abstract

原形質膜の損傷が頻繁なイベントであり、創傷は急速に細胞の生存を確実にするために修復されなければならない。のCa ^{2 +}の流入は、30秒以内〜原形質膜上に機械的な創傷の修復をトリガする重要なシグナル伝達事象である。最近の研究では、哺乳動物細胞はまた、細孔が細孔エンドサイトーシスに続いてリソソーム酵素酸性スフィンゴミエリナーゼのエキソサイトーシスを伴うのCa ^{2 +}依存性プロセスでの毒素の形成に透過処理後に原形質膜を再シールすることを明らかにした。ここでは、毒素ストレプトリジンOにより透過性細胞の再シールは、Ca ^{2 +}流入にも迅速かつ依存していることを示すために使用される方法について説明します。アッセイデザインは、損傷事象および撮像により原形質膜の完全性を復元し、親油性色素FM1-43は細胞内膜に到達することによって程度を定量化する細胞の能力の正確な速度論的測定の同期を可能にする。このライブアッセイALSoは外因的能力の評価は、それらの感受性形質膜を修復する細胞の能力を反映して、FM1-43の流入を抑制するために、例えばスフィンゴミエリナーゼのような可溶性因子を添加することができる。このアッセイは、私たちは、酵素の細胞外のほかは、Ca ^{2 +}が存在しない場合に透過性細胞の再シールを促進するため、スフィンゴミエリナーゼは、カルシウム^{2 +}依存性エキソサイトーシスの下流で作用することを初めて示すことができました。

Introduction

これは、機械的損傷後の血漿膜修復は、Ca ^{2 +}依存性プロセスであること^1,2数十年前から知られている。その後の研究は、傷口を通してのCa ^{2 +流入}は^、3,4を再密封するために必要とされる傷害の部位で細胞内小胞のエキソサイトーシスの積極的なプロセスをトリガすることが示された。細胞の細胞質内にロード蛍光色素の損失の速度は、修復の速度を評価するために使用され、再封が損傷後⁵ <30秒以内に完了したと結論された。二つのモデルは、最初は、細胞膜修復にエキソサイトーシスのための要件を説明するために提案された。病変を通じてのCa ^{2 +}流入は、そのだろう大規模な「パッチ」を形成、細胞内小胞の最初に同型の融合を引き起こすことが示唆さ1）「パッチ」モデル、次いで、創傷⁶と、その膜を提案しADDE 2）張力低減モデルを再シールするために原形質膜に適用すること創傷の近傍におけるCa ^{2 +}依存性エキソサイトーシスによって⁷日間二重層の再封を容易にする、原形質膜の張力を減少させるであろう。原形質膜修復におけるCa ^{2 +} -誘発さエキソサイトーシスの役割は、リソソームが損傷菌におけるそれらのエキソサイトーシスおよび原形質膜の修復を促進するのCa ^{2 +}センサー分子、シナプトタグミンVIIを含有することを示す研究によって補強された^8,9,10,11 。

しかしながら、追加の証拠は、単独で、エキソサイトーシスは、形質膜の修復を促進するのに十分ではなかったことを示した。原形質膜上の機械的な涙液に加えて、細胞損傷の頻繁な形態は、細菌^12,13又は^14,15免疫細胞によって産生さ孔形成毒素による透過性である。機械的な涙とは違って、孔形成タンパク質は、細胞膜は、膜「パッチ」を適用するか、削減するだけで再密封することはできない、安定した、タンパク質が並ぶ細孔を形成する上で自分自身を挿入膜張力をING。興味深いことに、研究は、哺乳類細胞は孔形成タンパク質を用いて透過処理した後に、それらの原形質膜を修復するための効率的な機構を有することを明らかにし、このプロセスは、細胞外Ca ^{2 + 12}の存在を必要とする。機械的な傷⁵で観察されたので、この発見は、細胞表面から貫通孔の除去にも迅速なプロセスであったかどうかという疑問を提起した。プロセスは、細胞外Ca ^{2 +を}必要とし、約30秒以内に完了する：驚くべきことに、我々の最近の研究では、孔形成毒素で透過処理した細胞の再シールは、機械的創傷の修復に非常に類似した性質を有することが明らかになった。より詳細には、このプロセスを調査し、我々は最近、リソソームのCa ^{2 +}調節性エキソサイトーシスに加えて、原形質膜の修復は、リソソーム酵素酸性スフィンゴミエリナーゼ（ASM）の放出によって引き起こさ必須であるエンドサイトーシスの急速な形態を含むことを学ん目のためだけでなく、貫 ​​通孔のEの除去だけでなく、機械的な傷¹⁶の補修用。

孔形成タンパク質との透過処理後の細胞再密封の動態を決定するために、我々の研究室では、レーザー損傷孤立筋繊維¹⁷の再シール性を評価するために以前に使用されていたライブイメージングの方法論を適応。このアッセイは、安定して蛍光強度が増加した脂質二重層の外側のリーフレット中にインターカレートする親油性色素FM1-43の特性に依存する。ときに、原形質膜二重層を形質膜損傷および修復^{18,16,19,20を}検出するため^の感度の高いアッセイを提供し、細胞内膜への細胞外の色素アクセスして破壊される。孔形成タンパク質との透過処理後の細胞の再シール性の評価のためにこのアッセイを適合させるために、我々は、膜コレステロール²¹に結合する細菌毒素ストレプトリジンO（SLO）、4℃で細胞をプレインキュベートした。同期セル透過化は、その後容易に貫通孔の形成をもたらすコンフォメーションの変化をオリゴマー化および活性化する加熱された顕微鏡ステージ、媒体を温めるために氷から細胞を移動させることによって達成することができる。このアプローチの利点は、レーザー創傷を用いて以前に公開されたアッセイの上に、多数の細胞は、細胞集団のより良好なサンプリングを提供し、顕微鏡視野内で同時に分析することができることである。孔形成毒素との機械的損傷および透過後に見られる細胞の再シール工程の間の機構的類似点を考えると、我々はここで説明するアッセイは、細胞膜修復の基本的なプロセスに関与する因子を解剖するために、非常に汎用性と強力な方法を提供する。一例として、我々はそれが修復過程ののCa ^{2 +}依存性および非依存性の手順を識別するために、このアッセイを使用することが可能であることを示している。

Protocol

1。 ASMの転写サイレンシング

1. シード1.5×10 35mmのガラスボトムディッシュ（MatTek社製）上のDMEM増殖培地（10％ウシ胎児血清（FBS）を有するDMEM高グルコース、2mMのL-グルタミン、1％ペニシリン-ストレプトマイシン）2ml中の⁵ HeLa細胞および5％CO ₂インキュベーター内で37℃で一晩インキュベートする。
2. 翌日、増殖培地をオフ吸引し、siRNAトランスフェクション混合物を添加する前に2ミリリットルのDMEMを減少血清培地（4％FBSを含むDMEM）、少なくとも1時間に交換してください。
3. siRNAのオリゴトランスフェクション混合物のための4のチューブを準備します。チューブAとCに、トランスフェクトされる35mmディッシュあたり、血清および4μlのトランスフェRNAiMAXトランスを減少させた250μLのOptimemを追加。チューブBは、オプティメム250μlのを追加し、血清およびトランスフェクトされる35ミリメートル皿あたり制御メディアGC含量のオリゴ（対照siRNA）を8μlの（160ピコモル）、減少した。チューブDでは、追加のOptimem250μlの35ミリメートル皿Tあたり、SMPD1オリゴ（siASM）の血清および8μL（160ピコモル）を削減Oトランスフェクトする。室温で5分間チューブをインキュベートする。
4. チューブAおよびBは、トランスフェクションのためのコントロールのsiRNA複合体、およびASM siRNAのための管CおよびDを形成する。 20分間室温で反応をインキュベートする。
5. それぞれ35 mmのガラスボトムディッシュにコントロールsiRNAとASMのsiRNAトランスフェクション反応にゆっくりと混合物は、滴下して、追加し、37℃/ 5％CO ₂でインキュベートする。 24時間のトランスフェクション後に、静かに、メディアをオフに吸引し、新鮮なDMEM増殖培地と交換してください。効率的なASMのノックダウンのために、料理はさらにライブイメージング前に約31時間（合計55時間）、37℃/ 5％CO ₂でインキュベートする必要があります。

2。ライブ顕微鏡用試薬の調製

1. Ca ^{2 +}およびMg ^{2 +}なしで冷たい1×PBS中100 NG /μLの濃度で組換え孔形成毒素ストレプトリジンO（SLO）の溶液を調製する。これらのアッセイにおいて使用されるSLOはconstitutivelある親切に博士ロッドTwete​​n、オクラホマ大学が提供する活動のための還元剤は必要ありませんYアクティブシステイン変異体。毒素は、E.で発現された大腸菌 BL21 DE3、以前に¹⁶記載されているように、ネイティブな条件下で精製。
2. 25 mM溶液を作成するために、DMSOに再懸濁FM1-43凍結乾燥粉末：FM1-43のストック溶液を調製する。
3. 溶液Aを準備します。4μmの最終濃度にCa ^{2 +を}冷DMEM中でFM1-43のストック溶液を希釈（1.5ミリリットルをマテック皿のあたりに必要とされている）と、必要になるまで氷上で保存する。
4. B液を準備します。4μM（マテックディッシュ当たりに必要な1.5ミリリットル）の最終濃度になるようにCa ^{2 +}および10のEGTA（Ca ^{2 +を}含まないDMEM）なしで冷たいDMEM中でFM1-43ストック溶液を希釈し、まで氷上に保存する必要としていました。
5. 事前暖かい（37℃）エッペンドルフチュー​​ブ内の溶液Aと溶液Bを1ミリリットルずつ。
6. のCa ^{2 +、}およびCを含むDMEMのアイスソリューションを保つ^{2 +}を含まないDMEM中。

3。 FM1-43の処理されたSLOに流入し、未処理細胞の生細胞イメージング

1. 、砕いた氷でMサイズの浅い金属製の容器を埋める氷を持つ大規模なガラス容器に、それを反転させ、露出した金属容器の底面のみを残して、追加の氷を加える。でも、熱転写を可能にするために露出した金属底に湿ったペーパータオルを置きます。
2. 1コントロールsiRNA処理マテック皿（ サンプル1）を取り、冷たい湿ったペーパータオルの上に置きます。優しくすべてのメディアをオフに吸引し、寒さのCa ^{2 +}を含まないDMEMで3回洗う。最後の洗浄の後、皿にすべてのメディアをオフに吸引除去する。
3. のCa ^{2 +}の存在無しSLO創傷（ サンプル1）と細胞内の画像細胞関連FM1-43に、35 mmのガラスボトムディッシュの中心ガラスカバースリップに冷溶液Bの180μLを加え、5インキュベート氷上分（ 表1）。 37℃に加熱し、（温度、湿度、CO ₂レベルを維持する）環境室を搭載した共焦点顕微鏡のステージ上マテック皿を置きます。 40X、NA 1.3の対物レンズ（ニコン）を通して見て画像化される細胞のフィールドを検索します。可能な場合、熱ドリフトを補正するためにPerfectFocusまたは類似のデバイスをオンにします。
4. そっと35-mmディッシュの側に予熱溶液Aの1ミリリットルを加え、環境室（ 表1）のカバーを交換してください。
5. （ULTRAVIEW近所パーキンエルマースピニングディスク共焦点顕微鏡システムにおいてVolocity）適切なイメージングソフトウェアを使用して、すべての3秒1コマで4分間の画像を取得する。 FM1-43の励起は488nmのバンドパスダイクロイックフィルタとを用いて488nmのレーザー線を用いて達成され、発光判別は527（W55）発光フィルターを使用することによって達成される。レーザパワーレベルとカメラの感度は、100ミリ秒の画像露光を達成するように設定されている。
6. 繰り返します3.2〜3.6は、そのステップ3.5溶液Bである（ 表1）を追加する必要がありますを除いて、Ca ^{2 +}の非存在下ではありませんSLO創傷（ サンプル2）を対照siRNA処理細胞でFM1-43を検出するには、手順。
7. プレゼンス（ サンプル3）またはCa ^{2 +}が存在しない場合（ サンプル4）の中心ガラスカバースリップにSLOを含有する冷溶液Bの180μlを添加するのいずれかでSLOを負傷したコントロールsiRNAで処理した細胞へのFM1-43の流入を測定するには35 mmのガラスボトムディッシュ、ステップ3.3のように氷上で5分間インキュベートする。繰り返します3.6を通じて3.2ステップ、ステップ3.5（ 表1）で溶液AまたはB液のいずれかを追加し調整します。
8. 原形質膜修復におけるASMの役割を決定するには、手順は、すべての条件（ 試料5-8）（表1）のためのASM siRNAで処理した細胞を使用して3.2から3.6を繰り返します。
9. 上の細胞外組換えスフィンゴミエリナーゼ（SM）の役割を決定するために、（FM1-43の流入における阻害によって反射された）、細胞膜修復の動態は、（ サンプル9月10日 ）、SMが追加されたステップ3.5（0〜50μU）に溶液Aのどちらか、または溶液Bとし、生細胞の間に細胞に添加されている1ミリリットル（ 表1）の総体積で撮像。

4。細胞へのFM1-43流入の定量化

1. ムービーが取得された後、画像解析ソフト（Volocityスイート、PerkinElmer）を用いFM1-43の細胞内蛍光強度を測定する。フィールド内の各細胞の細胞質ゾル領域に関心領域を描画し、動画の全フレームを通じて平均FM1-43の蛍光強度を測定するためにソフトウェアツールを適用する。
2. 初期FM1-43染色の変動を調整するには、各ビデオのためのデータは、経時的な蛍光強度の増加倍数として表現さ​​れ、それぞれの異なる条件に対してプロットされている。個々の時点あたりの蛍光の倍増加セルは、F _Tは、特定の時点での平均蛍光であり、F _0が t = 0（ 図1-2）での平均蛍光であるF _T / F ₀として計算される。

Representative Results

リソソーム酸性スフィンゴミエリナーゼで枯渇細胞における細菌スフィンゴミエリナーゼ（SM）レスキュー形質膜修復の低濃度。

FM1-43画像化アッセイを用いて、我々は、以前のCa ^{2 +}の存在下での創傷のリソソーム酵素ASM欠損とSLOに曝露された細胞は、原形質膜の欠陥は、組換えヒト酵素¹⁹の細胞外添加によりレスキューされていることを示した。ヒトリソソームASMは、最適な低pHを持っているので、我々は再密封も中性pHで完全にアクティブになっている、 セレウス菌 （シグマ）から精製されたSMの追加回復させることができたかどうかを調べた。以前に示されているように、セルコントロールsiRNAまたはASMのsiRNAオリゴで処理し、Ca ^{2 +}の（修理のための条件ではない許容）が存在しない場合にSLOにさらさ均等ASMの枯渇が毒素（ 図1Aに対する感度と干渉しないことを示し、透過処理した）。興味深いことに、完全な救助OSLOへの暴露後に再密封するためのASM欠損細胞の能力fをμU/ mlの（ 図1B）、SMの低濃度で観察された5〜7.5した。培地に添加し、酵素濃度が増加するにつれて、レスキュー表現型が徐々に損失があった10 - 10μU/ミリリットルに曝露された細胞は、部分的にのみSLOへの曝露後FM1-43の流入を遮断し、50μU/ mlに曝露された細胞を示したASM-枯渇細胞（ 図1Bおよび1C）で観察されたものと同様の完全な再封欠陥を反映し、強い色素流入パターン。この結果は、SLOのエンドサイトーシス除去毛穴がしっかりセラミドレベルによって調節されていることを示唆し、SMによって細胞膜で発生した - 一定以上のプロセスが正常に起こらず、細胞が病変を削除することはできません。

スフィンゴミエリナーゼの添加は、細胞膜の修復におけるCa ^{2 +}の必要性をバイパスします。

細菌Sの注目すべきことに、さらにCa ^{2 +}の（セル再封が許可されていない通常状態）が存在しない場合に、SLOによって透過処理した細胞に、Mはまた、細胞膜の修復を救助した。のCa ^{2 +（} 図1Bおよび1C）の存在下での孔形成毒素に曝露された細胞に見られるように、SMのみが低濃度のFM1-43（ 図2Aおよび2B）の流入を阻止するのに有効であった。これらの結果は、原形質膜の修復のCa ^{2 +}依存性段階の下流スフィンゴミエリナーゼ機能する。この発見は、リソソームとASMのリリースのエキソサイトーシスをトリガーするのCa ^{2 +の}貫通孔を通って流れていることを仮定している私たちの以前に提案したモデル、と完全に一致して、細胞膜の外葉に切断するスフィンゴミエリン、セラミドを生成し、エンドサイトーシス²²によって気孔除去を促進する^、19。精製されたSMのほかは、Ca ^{2 +}を強く強化の必要性をバイパスしているという事実リソソームの生理的条件下でのCa ^{2 +}調節性エキソサイトーシスは、エンドサイトーシスを促進するために必要スフィンゴミエリナーゼ活性の供給源であることを。ビューは、S

図1 セレウス菌スフィンゴミエリナーゼ （SM）は、孔形成毒素ストレプトリジンO（SLO）。コントロールsiRNAまたはASM siRNAで処理したHeLa細胞のオリゴにより負傷した酸性スフィンゴミエリナーゼ（ASM）の発現のためにサイレンシングされた細胞の原形質膜修復欠損を補完することができ Ca ^{2 +}およびFM1-43は、4分間の1フレーム/ 3秒で画像化した親油性色素の流入の有無に負傷した。 FM1-43細胞内の蛍光がVolocityソフトウェアを用いて定量し、経時的な蛍光強度の増加倍数として表した。（A）において Ca ^{2 +}の存在しないことは、両方のコントロールsiRNAとASM siRNAで処理した細胞は、SLOによって透過処理した。 18-27細胞がそれぞれの条件で分析した。エラーバーは、平均+ /に対応する-のCa ^{2 +}の存在下において、SEM（B）、コントロールsiRNAで処理した細胞は、それらの形質膜を再シールし、流入染料停止することができた一方ASMのsiRNAで処理した細胞は、再密封することができなかった。加えてのCa ^{2 +}の存在下で、スフィンゴミエリナーゼの低用量の外因性添加は、ASM siRNA処理細胞の原形質膜の欠損を補完する。 18から62細胞は、それぞれの条件で分析した。エラーバーは、平均+ /に対応- SEM（C）は、Bで分析映画の時間枠を選択しました。。バー、9μmでは。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。

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図2。スフィンゴミエリナーゼの添加は、細胞膜修復におけるCa ^{2 +}の必要性をバイパスする。コントロールsiRNAで処理したHeLa細胞のCa ^{2 +}の非存在下でSLOで負傷したと親油性色素FM1-43の流入は4について/ 3秒の1フレームで画像化した分。 FM1-43細胞内の蛍光がVolocityソフトウェアを用いて定量し、経時的な蛍光強度の増加倍数として表した。（A）は、通常のCa ^{2 +}の非存在下でSLOと損傷した細胞で見られる再密封原形質膜の欠如は、外因性の添加により逆転されるスフィンゴミエリナーゼの低用量。 18〜31の細胞は、それぞれの条件で分析した。エラーバーは、平均+ /に対応- SEM（B）がで分析映画の時間枠を選択しました。。バー、9以下である。g2large.jpg "ターゲット=" _blank ">大きな画像を見るにはここをクリックしてください。

図3。手続きに関与した実験段階のための手続きのタイムラインタイムライン。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。

Ca2 +の条件	CA2 +のない状態	SLO毒素	暖かい溶液A	温溶液B	スフィンゴミエリナーゼ	手順ステップ
+	-	-	+	-	-	3.2
-	+	-	-	+	-	3.7
+	-	+	+	-	-	3.8
-	+	+	-	+	-	3.8
+	-	-	+	-	-	3.9
-	+	-	-	+	-	3.9
+	-	+	+	-	-	3.9
-	+	+	-	+	-	3.9
-	+	+	-	+	+	3.10
+	-	+	+	-	+	3.10

表1。手順に記載されている実験手順で使用される溶液の組成物。サンプルを行に記載されている。指定されたコンポーネント（オリゴのCa ^{2 +}またはCa ^{2 +を}含まない培地、SLO、溶液AまたはB、スフィンゴミエリナーゼ）の（ - ）の列が存在（+）または不在を示す。これらのサンプルは第手順セクション3で生細胞イメージングのために使用される実験的な工程が示されている。

Discussion

機械的損傷と、細胞膜の修復に関する初期の研究では、ガラスビーズ、マイクロピペット、せん断、傷や削れを落とすに至るまで、負傷した細胞の多様なメカニズムに依存していました。すべてのこれらのアッセイの読み出しは、定性的ではなく定量的であり、修復機構の動力学に関する正確な情報を与えなかった。損傷のこれらの形態の後に原形質膜を再シールする細胞の能力は、細胞質内の細胞外液に添加トレーサーの有無によって、膜不浸透性色素、サイトゾル酵素の損失、ATPレベル、または長期の浸透を測定した細胞生存。これらのアッセイのいくつかは、定量的に行うことができるが急速に単一細胞レベルで再シールの動態を評価しながら、これらの研究における1つの大きな障害は、創傷イベントを同期させるのが困難であった。

筋線維のUV-レーザー傷害の開発および使用follo親油性色素FM1-43の流入を検出することによって結婚これらの研究^17,20における大きな進歩だった。代わりに削れやけがの類似の機械的手段によって、全細胞集団に与えた総ダメージのため、これらのアッセイは、単一細胞分析を可能にした細胞を創傷に複数の定義された方法を紹介しました。しかしながら、いくつかの問題がこのようなアッセイに残った。レーザー誘起病変の大きさは、生理的条件時に発生する膜損傷の形態よりも大規模で非常に可変レーザー強度に応じて、自然の中で非常に異なっている。別の問題は、1つの細胞または筋線維を追跡することができるイベントを再シールの数を減少させる、顕微鏡関連レーザを使用する時に負傷、従って、結果の統計的有意ことができることである。再現性及びサンプリングによるこれらの問題は大幅に原形質膜修復のメカニズムを調べるための方法として、レーザー傷害の有用性を低減。

TOこれらの問題に対処する、我々は正確に、細菌孔形成毒素によって引き起こされる原形質膜病変の修復速度を測定するために、新たな生細胞イメージングアッセイを開発した。多くの微生物が、真核細胞の膜を透過性にすることができる多数の毒素を有するので、これは、自然界で頻繁に発生する損傷の一形態である。温度は、細孔形成を誘発するために増加されるため、このアッセイは、正確には、低温での毒素を用いて細胞をプレインキュベートすることによって同期され、顕微鏡視野中の細胞の大多数は、FM1-43の流入のために分析されることを可能にすることができる。

このアッセイで実現細孔形成の正確な同期を顕微鏡視野内の複数の個々の細胞を同時に定量することができる、細胞膜の修復動態の再現性のある測定を可能にする。これらのアッセイにおける一つの重要な技術的要因は、イメージングのために使用される顕微鏡対物レンズの品質である。 T我々のアッセイで使用彼40X NA 1.3（ニコン）の目的は、画像解像度を損なうことなく、集団における細胞の十分なサンプリングを可能にする。 10倍の対物レンズに切り替えると、細胞集団の大規模サンプリングを可能にするが、達成され、解像度は、細胞内のFM1-43の適切な定量化のためには不十分であるだろう。この生細胞イメージングアッセイのための重要なステップは、熱ドリフトを補正するPerfectFocusまたは同様の装置の使用である。私たちの手順では、氷の上で、細胞への細菌の孔形成毒素のプレ結合した後、生細胞イメージングのために37℃まで急速に温度をシフトが必要です。この温度調節は、画像取得期間中軸フォーカスの変動の原因となり、補正されなければならない。 PerfectFocusまたは同様のデバイスは、このように、細胞膜の修復動態の正確な定量を可能に、長期間にわたって選択された焦点面の生細胞イメージングを可能にこの問題を修正します。

への鍵このアッセイの成功は、これが使用される毒素のバッチごとに異なりますので、事前に形成毒素の力価は、常に異なる濃度にするには、修復可能な非修理可能な用量を決定することです。特に、多くの毒素の、およびSLOの活性は、感受性および複数の凍結 - 解凍サイクルは、その活性に有害である温度である。ただし、各実験に並んで行わ滴定は正しい毒素の投与量を正確にタイムラプスイメージングのわずか数分で決定されることを可能にする。

このアッセイは、形質膜損傷後の十分な細胞内FM1-43の蛍光の検出に依存する。これは、特定の条件下で制限することができる。膜SLO形態に挿入した後、ロバスト性Ca ^{2 +}流入および真核細胞の急速原形質膜修復応答を可能にする、約30nmの直径を有する細孔。約の細孔径を有するようアエロリジンおよびライセニンのような小さな病変を形成するが、孔形成毒素、彼らは不十分なCa ^{2 +}およびFM1-43の流入につながる可能性があるため1-3 nmの^{23から25は、}このアッセイのために適切でないかもしれない。

でも、このようなSLOなどの大きな細孔を生成毒素を使用して、このイメージングアッセイは、蛍光強度の絶対定量ではなく、相対的な蛍光を可能にしないことを心に留めておくことが重要です。このように、画像は、デジタルカメラのintrasceneダイナミックレンジ内で行われることが重要です。蛍光強度は、レーザパワー、露光時間、及びカメラゲインに影響されるので、修復および非両方でFM1-43とSLOで処理した細胞の予備撮影を行うことにより、各実験の開始時に、これらの3つのパラメータを設定することが重要である修復の条件（CA ^{2 +}またはCa ^{2 +を}含まない培地）。これはdetermとして（（SLOの添加前）は、時間ゼロでの蛍光検出を可能にする画像取得設定の選択を可能にするが、検出器の飽和を生じない非補修条件の下で取得の終了時に、ソフトウェアの読み出し）によりINED。

このアッセイを用いて、SLOの細孔は、このプロセスは、機械¹⁶の創傷の修復と同様の迅速な動態を有することを実証し、30秒未満での哺乳動物細胞の原形質膜から除去されることを実証することができた。その後の研究は、リソソーム酵素はASM形質膜の修復に必要であることを示し^、ASM-19欠損細胞に細胞外に添加したときに再シール回復させることができる。本研究では、表示できるFM1-43流入アッセイの感度を利用した、初めて、その形質膜の修復はまた、細胞外Ca ^{2 +}の非存在下で起こり得る。組換えスフィンゴミエリナーゼに傷ついた細胞の曝露は、Ca ^{2 +}を含まない培地、細胞質膜修復のため、通常は許容されない状態では、SLOによる透過性細胞で再シールを促進するのに十分であった。興味深いことに、補完原形質膜修復能力のメンテーションは、原形質膜の外葉にこの酵素によって生成されたセラミドの量は、病変の除去プロセスの重要な決定因子であることを示唆し、スフィンゴミエリナーゼの高濃度への暴露後に観察されなかった。この知見は、Ca ^{2 +が}リソソームのエキソサイトーシス工程をトリガする必要があるが、創傷の内在化に関与するスフィンゴミエリナーゼにより誘導されるエンドサイトーシスに必要とされないことを示している。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
HeLa 229 cell line	ATCC	CCL2-1
DMEM High Glucose	Invitrogen	11965
DMEM High Glucose No Calcium	Invitrogen	20168
FM1-43	Invitrogen	T3163
Optimem Reduced Serum	Invitrogen	31985
Lipofectamine RNAiMax	Invitrogen	13778
Control medium GC content RNAi oligo	Invitrogen	12935300
SMPD1 RNAi oligo	Invitrogen	HSS143988
Fetal Bovine Serum Heat-inactivated	Gemini-Bioproducts	100-106
Sphingomyelinase from Bacillus cereus	Sigma	S7651
35 mm-glass bottom dishes	MatTek	P35G-0-14
Material
Inverted microscope	Nikon	Eclipse Ti
Camera	Hamamatsu Photonics	C9100-50
Spinning disk confocal microscope	PerkinElmer	UltraViewVoX
Software analysis software	PerkinElmer	Volocity Suite
Environmental chamber	Pathology Devices	LiveCell System Chamber