Summary
细胞暴露于所述亲脂性染料FM1-43的实时成像可以精确测定由该成孔毒素从质膜除去动力学。这是一个敏感的测定法可以用于评估要求的Ca 2 +，鞘磷脂和其它因素对质膜修复。
Abstract
细胞膜损伤是一种常见的事件，伤口必须迅速修复，以确保细胞存活。的Ca 2 +的内流，触发机械创伤的修复上内〜30秒质膜中的关键信号传导事件。最近的研究表明，与透孔形成在一个的Ca 2 +依赖性的过程，涉及溶酶体酶酸性鞘磷脂酶随后孔隙的内吞作用的胞外分泌的毒素后的哺乳动物细胞也重新密封的质膜。在这里，我们描述了用于证明细胞毒素链球菌溶血素Ô透的再密封也是快速和依赖的Ca 2 +内流的方法。该法的设计允许伤害事件的同步和细胞的成像，恢复细胞膜的完整性，并通过量化其liphophilic染料FM1-43达到细胞内膜的程度的能力的精确动力学测量。这活法阿尔斯O允许的外源能力的评估敏感添加可溶性因子如鞘磷脂酶抑制FM1-43大量涌入，反映细胞的修复他们的质膜的能力。该测定法允许我们表明：第一次，鞘磷脂酶的作用的Ca 2 +的依赖性胞吐作用的下游，由于胞外加入酶促进细胞透化在不存在的Ca 2 +的再密封。
Introduction
人们已经知道了几十年了机械性损伤后质膜修复是的Ca 2 +依赖性过程1,2。后来的研究表明，通过伤口的Ca 2 +内流触发细胞内囊泡的胞吐一场轰轰烈烈的过程在损伤部位，这是需要重新密封3,4。加载到细胞的细胞质中的荧光染料的损失率被用来评估修复的速度，并得出结论，被重新密封于<30秒5伤后完成。两款车型最初提出来解释在质膜修为胞吐作用的要求：1）“补丁”的模式，这表明，Ca 2 +的内流，通过病灶触发细胞内囊泡最初同型融合，形成了一个庞大的“补丁”，将然后可以应用到质膜重新密封伤口6和2）的张力减小模型，其中提出，膜ADDEð通过在伤口附近的Ca 2 +依赖性胞吐作用将降低细胞膜张力，促进双层7的重新密封。 钙在细胞膜修复+触发胞吐作用通过研究表明，溶酶体含有Ca 2 +的传感器分子，突触七，这有利于它们的胞外分泌和质膜修复受损细胞，进一步加强8,9,10,11 。
然而，更多的证据表明，单纯胞吐作用不足以促进细胞膜修复。除了 在质膜上的机械眼泪，细胞损伤的常见形式是透由细菌12,13或免疫细胞14,15产生的成孔毒素。不像机械眼泪，成孔蛋白插入本身对质膜形成稳定，蛋白质内衬的孔隙无法通过应用膜“补丁”或由红眼简单地重新密封ING膜的张力。有趣的是，研究发现，哺乳动物细胞具有与透孔形成蛋白后，以修理其质膜一个有效的机制，而这个过程也需要胞外Ca 2 +的12的存在。这一发现提出了从细胞表面跨膜孔隙去除是否也是一个快速的过程的问题，作为具有机械伤口5观察到。出人意料的是，我们最近的研究表明，细胞透化与成孔毒素的再密封具有非常相似的性质，以机械创伤的修复：这个过程需要细胞外Ca 2 +的，并且在约30秒完成。更详细地调查这个过程中，我们最近了解到，除了Ca 2 +的调节溶酶体的胞吐，质膜修复涉及内吞作用的快速形式，它是由溶酶体的释放引发酶的酸性鞘磷脂酶（ASM），是必需的不仅为日ë去除跨膜孔的，而且对机械创伤16的维修。
为了确定通透与成孔蛋白后细胞再密封的动力学，在我们的实验室，我们改编以前已经用于评估激光隔离受伤的肌肉纤维17的重新密封的实时成像方法。该测定依赖于亲脂性染料FM1-43，它稳定地可嵌入到脂质双层中的荧光强度增加的外小叶的属性。当细胞膜双分子层被破坏的细胞外染料得以进入细胞内的膜，提供了一个敏感的检测，以检测细胞膜损伤和修复18,16,19,20。要通透与成孔蛋白后细胞再密封的评估适应这个实验中，我们预孵育细胞在4℃与细菌毒素链球菌溶血素为O（SLO），其中结合细胞膜胆固醇21。同步单元透然后可以通过移动从冰细胞温热介质中加热的显微镜载物台，其激活低聚和变化中的构象，导致跨膜孔形成很容易地实现。这种方法的一个优点，通过使用激光伤人先前公布的测定中，是细胞中的更大的数目可以在一个显微镜视野同时进行分析，提供上述细胞群的较好采样。给定的机械损伤和透化与成孔毒素后见到的细胞重新密封过程之间的机械的相似性，我们在这里描述的测定法提供了解剖参与质膜修复的基本过程的因素非常灵活和强大的方法。作为一个例子，我们表明，它有可能使用该测定，以确定在修复过程中的Ca 2 +依赖性和独立的步骤。
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Protocol
1。 ASM的转录沉默
- 种子1.5×10 5个HeLa细胞于2ml DMEM生长培养基（DMEM高葡萄糖，10％胎牛血清（FBS），2mM的L-谷氨酰胺，1％青霉素-链霉素）在35 mm的玻璃底培养皿（MatTek）和在5％CO2 培养箱孵育过夜，在37℃。
- 在第二天，吸出物离开的生长培养基，并添加siRNA转染混合物之前，用2ml的DMEM低血清培养基（DMEM，用4％FBS）中，至少1小时更换。
- 准备4管的寡核苷酸的siRNA转染混合物。在管A和C，加入250μl的Optimem降低血清和4μL脂质体RNAiMax，每35mm培养皿进行转染。管B中，加入250μl的Optimem减少控制媒介GC含量寡（对照siRNA）血清和8μL（160皮摩尔），每35mm培养皿进行转染。在管D，加入250μl的Optimem减少SMPD1寡（热情）的血清和8μL（160皮摩尔），每35mm培养皿吨Ø转染。孵育所述管在室温下放置5分钟。
- 结合管A和B，形成转染复合物为对照siRNA和管C和D为ASM的siRNA。孵育反应在室温下搅拌20分钟。
- 添加对照siRNA和ASM siRNA转染反应混合物慢慢滴，到各自的35毫米的玻璃底菜和孵化在37℃/ 5％的CO 2。在24小时转染后，轻轻吸去培养基并更换新鲜的DMEM培养基。为了有效ASM击倒，该吃的食物应进一步前实时成像在37℃/ 5％的CO 2约31小时（共55小时）。
2。试剂现场显微镜的研制
- 在100纳克/微升冷的1X PBS的浓度准备重组的成孔毒素链球菌溶血素为O（SLO）溶液中不含Ca 2 +，Mg 2 +的。在这些测定中所使用的SLO是constitutivelY有功功率半胱氨酸突变体，不需要减少对活性剂，由Rod Tweten，奥克拉荷马大学博士惠赠。该毒素在大肠杆菌中表达大肠杆菌 BL21 DE3和天然条件下纯化，如先前描述的16。
- 准备FM1-43原液：在DMSO中重悬FM1-43冻干粉来创建一个25毫米的解决方案。
- 准备溶液A：与Ca 2 +的稀释FM1-43原液在寒冷的DMEM至4微米（需要每MatTek菜1.5ml）中的终浓度，直到需要在冰上保存。
- 制备溶液B：稀释FM1-43储备溶液在冷的DMEM不含Ca 2 +和10mM EGTA（Ca 2 +的无DMEM）中于4微米（每MatTek菜需要1.5ml）中的终浓度，并在冰上储存直至需要的。
- 预温（37°C）1毫升分装解决方案A和方案B的Eppendorf管。
- 不断的DMEM冰解决方案的Ca 2 +和C一个2 +的DMEM。
3。的FM1-43涌入SLO处理和未处理的细胞活细胞成像
- 填充一个中等大小的浅的金属容器用碎冰，颠倒成冰的大玻璃容器中，并添加额外的冰留下露出的金属容器的唯一的底面。放置在暴露的金属底部湿纸巾以允许均匀的热传递。
- 采取一对照siRNA处理MatTek菜（ 样品1），并将其放置在冰冷的湿纸巾。轻轻吸了所有媒体，并与冷的Ca 2 +的DMEM洗3次。最后一次洗涤后，吸过的菜所有媒体。
- 对细胞图像进行相关的FM1-43细胞中没有SLO伤人（ 样品1）中的Ca 2 +的存在，加入180微升冰冷溶液B到35毫米的玻璃底培养皿的中心玻璃盖玻片，静置5分钟在冰上（ 表1）。 放置MatTek盘上的共焦显微镜下加 热至37℃，并配有环境室（即保持温度，湿度和CO 2水平）的阶段。发现细胞将成像期待通过40X 1.3 NA物镜（尼康）的领域。如果有的话，打开PerfectFocus或类似装置，以校正热漂移。
- 加入1毫升预热的解决方案A轻轻的35毫米的菜一边，更换环境室（ 表1）的封面。
- （中的Ultraview Vox的珀金埃尔默旋转盘共聚焦显微系统Volocity）采用适当的图像处理软件在一帧图像采集4分钟，每3秒。 FM1-43的激励是通过使用二向色滤光片的488nm的带通488nm的激光线，并且发射鉴别是通过使用一个527（W55）发射滤波器的实现。激光功率水平和相机感光度设置达到100毫秒的形象曝光。
- 重复步骤3.2至3.6，以检测FM1-43的对照siRNA处理的细胞与无SLO伤人（ 样品2）在不存在的Ca 2 +的，不同之处在于，在步骤3.5 B液应加入（ 表1）。
- 测量FM1-43流入对照siRNA处理的细胞与SLO受伤或者在存在（ 样品3）或不存在的Ca 2 +的（ 样品4）中，添加180微升冰冷溶液B含有SLO到的中心玻璃盖玻片35毫米的玻璃底菜和孵化5分钟，冰如步骤3.3。重复步骤3.2至3.6;调整加入溶液A或溶液B在步骤3.5（ 表1）。
- 来确定ASM在质膜修复中的作用，重复使用ASM siRNA处理的细胞中的所有条件下（ 样品5-8）（表1）步骤3.2-3.6。
- 为了确定细胞外重组鞘磷脂（SM）上的作用细胞膜修复动力学（由抑制在FM1-43潮反映）（ 样品9-10），SM加（0-50μU）到溶液A或溶液B在步骤3.5，然后在活细胞加入细胞成像在1毫升（ 表1）的总体积。
4。的FM1-43定量潮进入细胞
- 电影已被收购后，使用图像分析软件（Volocity套房，珀金埃尔默）测量FM1-43的细胞内荧光强度。绘制的感兴趣区域中的字段中的每个小区的胞质区域和应用的软件工具，以确定在整个视频的所有帧的均值FM1-43的荧光强度。
- 来调整变化的初始FM1-43染色，对于每个视频数据被表示为在一段时间内荧光强度倍的增加，并绘制为每个不同的条件。折叠增加每各个时间点的荧光细胞被计算为：F T / F 0，其中F T是平均荧光在特定的时间点，和F 0是平均荧光在t = 0（ 图1-2）。
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Representative Results
低浓度的细菌鞘磷脂（SM）的救援细胞膜修复细胞贫溶酶体酸性鞘磷脂酶。
用FM1-43的成像方法，我们以前表明，细胞缺乏的溶酶体酶ASM和暴露于SLO伤人中的Ca 2 +的存在下具有质膜缺陷是由细胞外加入的重组人酶19的获救。由于人溶酶体ASM具有低的pH最佳值，我们研究是否重新密封也可以恢复增加的SM从蜡状芽孢杆菌 （Sigma公司），它是在中性pH下完全有活性纯化。与对照siRNA或siRNA的ASM寡核苷酸在无钙的处理，暴露在SLO如前所示，细胞+（条件不许可进行维修）进行了同样通透，显示出ASM损耗不敏感地毒素（ 图1A干扰）。有趣的是，一个完整的救援Øf被观察到低浓度的SM，3.5和7.5μU/ ml的（ 图1B）的ASM-缺陷细胞暴露于SLO后重新密封的能力。如向培养基中加入的酶的浓度增加，有在抢救表型的逐渐损失 - 细胞暴露于10μU/毫升仅部分地被阻挡的FM1-43的流入暴露于SLO后，与细胞暴露于50μU/ ml的显示强大的染料涌入格局，反映类似于ASM耗尽细胞（ 图1B和1C）观察一个完整的再密封缺陷。这一结果表明，内吞去除SLO的孔紧密地通过在质膜由SM产生的神经酰胺水平的调节 - 高于某一水平的过程中通常不会出现，并且细胞不能去除病变。
鞘磷脂此外绕过质膜修为的Ca 2 +的要求。
值得注意的是，除了细菌的SM来细胞SLO在无Ca 2 +的（通常是一个条件，不允许小区再密封）也救出质膜修复的透化。如见于细胞中的Ca 2的存在下暴露于孔形成毒素+（ 图1B和1C），只有低浓度的SM为有效阻断的FM1-43涌入（ 图2A和2B）。这些结果表明，质膜修复的Ca 2 +依赖性的步骤的下游侧鞘磷脂酶的功能。这一发现与我们先前提出的模型，该模型假设，Ca 2 +的流经跨膜毛孔触发溶酶体和ASM释放的胞吐作用完全一致的在质膜的外小叶，产生神经酰胺和促进去除毛孔内吞22切割鞘磷脂，19。该加法精制SM绕过需要Ca 2 +的强烈增强的事实S中的观点，即在生理条件下的Ca 2 +调节的溶酶体的胞吐作用是促进细胞内吞作用所需要的鞘磷脂酶的活性的来源。
图1。 蜡状芽孢杆菌鞘磷脂 （SM）可以补充细胞的沉默酸性鞘磷脂酶（ASM）的孔隙形成毒素链球菌溶血素为O（SLO），与对照siRNA或ASM siRNA处理的HeLa细胞的寡核苷酸受伤的表达质膜修复缺陷中受伤的Ca 2 +和亲脂性染料FM1-43的影像是在1帧/ 3秒，4分钟涌入的存在与否。使用Volocity软件FM1-43细胞内的荧光定量，并表示在一段时间内荧光强度倍。（A）在缺席的Ca 2 +的，这两个对照siRNA和ASM的siRNA处理的细胞通过SLO透化。 18-27细胞在每种条件下进行分析;误差条对应的均值+ / - SEM（B）中的Ca 2 +的存在下，与对照siRNA处理的细胞能够重新密封的质膜和停止染料涌入，而与ASM的siRNA处理的细胞没有重新密封。另外在Ca 2 +的存在下，外源性添加低剂量的鞘磷脂的补充ASM的siRNA处理的细胞的质膜缺陷。 18-62细胞中每个条件进行了分析，误差线对应平均值+ / -扫描电镜（三）选定的电影B中分析的时间框架。酒吧，9微米。 点击这里查看大图 。
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图2。鞘磷脂此外绕过质膜修为的Ca 2 +的要求。与对照siRNA处理的HeLa细胞受伤与SLO在无钙2 +和亲脂性染料FM1-43的涌入是成像在1帧/ 3秒4分钟。使用Volocity软件FM1-43细胞内的荧光进行定量，并表示为在一段时间内荧光强度倍的增加（A）的质膜的缺乏再密封通常见于细胞SLO在不存在钙的受伤2 +是由外源性添加逆转低剂量的鞘磷脂。 18-31细胞中每个条件进行了分析，误差线对应平均值+ / -扫描电镜（B）选定的影片在分析的时间框架。酒吧，9微米。g2large.jpg“目标=”_blank“>点击这里查看大图。
图3。程序时间表。时间表对参与过程的实验步骤。 点击这里查看大图 。
| 钙离子的条件 | 无钙条件 | SLO毒素 | 温暖的解决方案A | 温暖的溶液B | 鞘磷脂酶 | 操作步骤步骤 |
| + | - | - | + | - | - | 3.2 |
| - | + | - | - | + | - | 3.7 |
| + | - | + | + | - | - | 3.8 |
| - | + | + | - | + | - | 3.8 |
| + | - | - | + | - | - | 3.9 |
| - | + | - | - | + | - | 3.9 |
| + | - | + | + | - | - | 3.9 |
| - | + | + | - | + | - | 3.9 |
| - | + | + | - | + | + | 3.10 |
| + | - | + | + | - | + | 3.10 |
表1中。作为该过程中所述组成的实验过程中使用的解决方案。样本中列出的行。列表示存在（+）或缺席-命名组件（寡，的Ca 2 +或Ca 2 +培养基，斯洛伐克，方案A或B，鞘磷脂）的（）。中指出这是第一个用于活细胞成像的步骤第3这些样品的实验步骤。
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Discussion
机械损伤和细胞膜修复早期的研究依赖于细胞损伤的机制多种多样，从掉落的玻璃珠，micropipetting，剪切，划伤或者刮伤。所有这些测定的读数是定性而非定量的，并没有给于修复机制的动力学精确的信息。细胞的这些形式的损伤之后重新密封其质膜的能力被加入到在细胞质中，渗透膜不透染料，细胞内的酶，ATP水平，或长期的损失外液示踪物的存在或不存在下测定细胞存活。虽然几个这些测定可定量进行的，在这些研究中的一个主要障碍是在同步伤人事件的难度，同时快速评估重新密封在单细胞水平的动力学。
肌肉纤维的紫外激光损伤的发展和使用福卢通过检测的亲脂性染料FM1-43的涌入结婚是在这些研究中17,20的一大进步。而不是造成对整个细胞群体通过刮擦或损伤的类似机械装置的总的破坏，这些测定法引入了一个更明确的方式来缠绕细胞，允许单细胞分析。然而，一些问题仍然在这样的试验。激光诱发病变的尺寸大而且相当变量取决于激光强度，并且在本质上非常不同的比膜损伤的过程中的生理条件下发生的形式。另一个问题是，只有一个细胞或肌纤维可以在一个时间负伤使用显微镜相关的激光器，减少重新密封的可遵循的事件的数目，并且因此结果的统计意义。这些问题的，可重复性和采样大大降低激光损伤的有用性作为一种方法来研究细胞膜的修复机制。
ŦØ解决这些问题，我们开发了一种新的活细胞成像试验，以精确测量细胞膜损伤的修复动力学引起细菌成孔毒素。这是损伤经常发生在自然界中，由于许多微生物具有大量的毒素，其能够透化的真核细胞的膜的形式。该测定可以通过与毒素在低温下预孵育细胞精确同步，并且允许进行FM1-43的流入待分析在显微镜视野的大量细胞，随着温度的升高，触发孔形成。
的孔隙的形成实现了与该测定的精确同步使质膜修复动力学，可以同时在多个单个细胞的显微镜视野内进行定量的可再现的测量。在这些测定中的一个重要的技术要素是显微镜物镜的用于成像的质量。 Ŧ他40X 1.3 NA（尼康）在我们的实验中使用的目标，使得细胞在人群中有足够的取样，而不会丢失图像分辨率。切换到10X物镜将允许该细胞群的一个较大的取样，但所实现的分辨率是不够的胞内FM1-43的正确定量。这个活细胞成像分析的关键步骤是利用PerfectFocus或类似设备的校正热漂移。我们的程序要求的细菌成孔毒素的预结合细胞在冰上，然后很快转移到温度37℃，活细胞成像。这个温度调整将在图像采集期间造成的轴向聚焦的波动，而且必须予以纠正。 PerfectFocus或类似的装置将修正这个问题，允许在延长的时间期间内所选择的焦平面的活细胞成像，从而使质膜修复动力学的精确定量。
一键该测定法的成功是始终滴度不同浓度的预成型毒素的确定可修复和不可修复的剂量，因为这可以改变每个批次毒素的使用。的许多毒素SLO的特别的活性，并且，是温度敏感的，多个冷冻 - 解冻循环是不利的其活性。但是，在每个实验中一起进行滴定允许正确的毒素剂量的延时成像只有几分钟被精确地确定。
细胞膜损伤后此法依赖于足够的细胞内FM1-43荧光检测。这可以被限制在一定条件下。插入膜SLO形式后孔的直径为约30nm，从而为健全的Ca 2 +内流，并在真核细胞中的快速质膜修复反应。然而，成孔形成较小的病变，如气溶素和lysenin具有约的孔径毒素1-3 nm的5月23-25 日无法满足这个实验，因为它们可能会导致没有足够的Ca 2 +和FM1-43涌入。
即使使用一种毒素，产生毛孔粗大如斯洛伐克，它的这种成像法不允许荧光强度的绝对定量，而是相对荧光重要的是要牢记。因而，即数字照相机的intrascene动态范围内进行成像是至关重要的。因为荧光强度是受激光功率，曝光时间，以及摄像机的增益，它是在每个实验开始时设置这三个参数，通过执行与FM1-43和SLO在两个修复和非处理的细胞的初步成像是非常重要的修复条件（的Ca 2 +或Ca 2 +培养基）。这允许图像采集设置，允许荧光检测在时间零（SLO除了之前），但不导致检测器饱和度（选择为determ在收购非维修条件下月底独立非执行董事由软件读出）。
使用这种测定法，我们能够证明SLO孔被从哺乳动物细胞的质膜中除去小于30秒，这表明该方法具有快速动力学类似于机械创伤16的维修。随后的研究表明，溶酶体酶的ASM需要质膜修复，并能够恢复时胞外加入到ASM-缺陷型细胞19重新密封的。在本研究中，我们采取了FM1-43涌入测定的灵敏度的优点，显示，对于第一次，质膜修复，也可能发生在不存在胞外Ca 2 +的。曝光受伤细胞对重组鞘磷脂酶足以促进再密封在细胞SLO通透的Ca 2 +的培养基，这种情况一般不容许对细胞膜修复。有趣的是，完井暴露于高浓度的鞘磷脂后，没有观察到质膜修复能力心理状态，这表明通过此酶对质膜的外部小叶产生神经酰胺的量为病灶切除过程中的一个重要决定因素。此发现表明，Ca 2 +的需要触发溶酶体的胞吐作用的步骤，但不是必须的了鞘磷脂酶诱导的内吞作用是负责伤口内化。
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Disclosures
作者宣称他们没有竞争的经济利益。
Acknowledgments
这项工作是由美国国立卫生研究院资助R37 AI34867和R01 GM064625为NWA我们感谢R. Tweten博士从俄克拉何马大学的SLO表达质粒的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| HeLa 229 cell line | ATCC | CCL2-1 | |
| DMEM High Glucose | Invitrogen | 11965 | |
| DMEM High Glucose No Calcium | Invitrogen | 20168 | |
| FM1-43 | Invitrogen | T3163 | |
| Optimem Reduced Serum | Invitrogen | 31985 | |
| Lipofectamine RNAiMax | Invitrogen | 13778 | |
| Control medium GC content RNAi oligo | Invitrogen | 12935300 | |
| SMPD1 RNAi oligo | Invitrogen | HSS143988 | |
| Fetal Bovine Serum Heat-inactivated | Gemini-Bioproducts | 100-106 | |
| Sphingomyelinase from Bacillus cereus | Sigma | S7651 | |
| 35 mm-glass bottom dishes | MatTek | P35G-0-14 | |
| Material | |||
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Camera | Hamamatsu Photonics | C9100-50 | |
| Spinning disk confocal microscope | PerkinElmer | UltraViewVoX | |
| Software analysis software | PerkinElmer | Volocity Suite | |
| Environmental chamber | Pathology Devices | LiveCell System Chamber | |
References
- Heilbrunn, L. The dynamics of living protoplasm. , Academic Press. (1956).
- Chambers, R., Chambers, E. Explorations into the nature of the living cell. , Harvard University Press. (1961).
- Bi, G. Q., Alderton, J. M., Steinhardt, R. A. Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing. J. Cell Biol. 131, 1747-1758 (1995).
- Miyake, K., McNeil, P. L. Vesicle accumulation and exocytosis at sites of plasma membrane disruption. J. Cell Biol. 131, 1737-1745 (1995).
- Steinhardt, R. A., Guoqiang, B., Alderton, J. M. Cell membrane resealing by a vesicular mechanism similar to neurotransmitter release. Science. 263, 390-393 (1994).
- McNeil, P. L., Vogel, S. S., Miyake, K., Terasaki, M. Patching plasma membrane disruptions with cytoplasmic membrane. J. Cell Sci. 113, 1891-1902 (2000).
- Togo, T., Alderton, J. M., Bi, G. Q., Steinhardt, R. A. The mechanism of facilitated cell membrane resealing. J. Cell Sci. 112, 719-731 (1999).
- Rodriguez, A., Webster, P., Ortego, J., Andrews, N. W. Lysosomes behave as Ca2+-regulated exocytic vesicles in fibroblasts and epithelial cells. J. Cell Biol. 137, 93-104 (1997).
- Reddy, A., Caler, E., Andrews, N. Plasma membrane repair is mediated by Ca2+-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106, 157-169 (2001).
- Jaiswal, J. K., Andrews, N. W., Simon, S. M. Membrane proximal lysosomes are the major vesicles responsible for calcium-dependent exocytosis in nonsecretory cells. J. Cell Biol. 159, 625-635 (2002).
- Chakrabarti, S., et al. Impaired membrane resealing and autoimmune myositis in synaptotagmin VII-deficient mice. J. Cell Biol. 162, 543-549 (2003).
- Walev, I., et al. Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 3185-3190 (2001).
- Iacovache, I., van der Goot, F. G., Pernot, L. Pore formation: an ancient yet complex form of attack. Biochim. Biophys. Acta. 1778, 1611-1623 (2008).
- Morgan, B. P., Campbell, A. K. The recovery of human polymorphonuclear leucocytes from sublytic complement attack is mediated by changes in intracellular free calcium. Biochem. J. 231, 205-208 (1985).
- Keefe, D., et al. Perforin triggers a plasma membrane-repair response that facilitates CTL induction of apoptosis. Immunity. 23, 249-262 (2005).
- Idone, V., et al. Repair of injured plasma membrane by rapid Ca2+-dependent endocytosis. J. Cell Biol. 180, 905-914 (2008).
- Bansal, D., et al. Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Nature. 423, 168-172 (2003).
- McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. The endomembrane requirement for cell surface repair. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4592-4597 (2003).
- Tam, C., et al. Exocytosis of acid sphingomyelinase by wounded cells promotes endocytosis and plasma membrane repair. J. Cell Biol. 189, 1027-1038 (2010).
- Weisleder, N., et al. Visualization of MG53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems. J. Vis. Exp. (52), e2717 (2011).
- Tweten, R. K. Cholesterol-dependent cytolysins, a family of versatile pore-forming toxins. Infect. Immun. 73, 6199-6209 (2005).
- Zha, X., et al. Sphingomyelinase treatment induces ATP-independent endocytosis. J. Cell Biol. 140, 39-47 (1998).
- Buckley, J. T. Crossing three membranes. Channel formation by aerolysin. FEBS Lett. 307, 30-33 (1992).
- Parker, M. W., et al. Structure of the Aeromonas toxin proaerolysin in its water-soluble and membrane-channel states. Nature. 367, 292-295 Forthcoming.
- Yamaji-Hasegawa, A., et al. Oligomerization and pore formation of a sphingomyelin-specific toxin, lysenin. J. Biol. Chem. 278, 22762-22770 (2003).
