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Biology

Marquage métabolique et la membrane de fractionnement pour comparative Analyse protéomique de Published: September 28, 2013 doi: 10.3791/50535
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Signaling Proteomics, Max Plank Institute of Molecular Plant Physiology, 2Department of Plant Systems Biology, University of Hohenheim

Summary

Ici, nous décrivons une méthode robuste pour le fractionnement des membranes plasmiques de plantes en détergents solubles dans les membranes résistantes et de détergent à base d'un mélange de non marqué et in vivo entièrement 15 N étiquetés cultures de cellules d'Arabidopsis thaliana. La procédure est appliquée pour des études comparatives de la protéomique pour comprendre les processus de signalisation.

Abstract

Plasma microdomaines membranaires sont des caractéristiques basées sur les propriétés physiques de l'environnement des lipides et des stérols et ont des rôles particuliers dans les processus de signalisation. Extraction microdomaines enrichis en stérols à partir de cellules végétales pour l'analyse protéomique est une tâche difficile principalement en raison de multiples étapes de préparation et sources de contaminations d'autres compartiments cellulaires. La membrane plasmique constitue seulement environ 5 à 20% de l'ensemble des membranes dans une cellule végétale, et par conséquent, l'isolement de la fraction de membrane plasmatique hautement purifié est difficile. Une méthode fréquemment utilisée consiste partitionnement aqueuse à deux phases dans le polyéthylène glycol et le dextrane, qui produit des vésicules de membrane de plasma avec une pureté de 95% 1. Microdomaines membranaires riches en stérols au sein de la membrane plasmique sont insolubles lors d'un traitement avec des détergents non ioniques à froid à un pH alcalin. Cette fraction de membrane résistant aux détergents peut être séparée de la membrane plasmique en vrac par ultracentrifugation en tant quegradient ucrose 2. Par la suite, les protéines peuvent être extraites de la bande de basse densité du gradient de saccharose par un mélange méthanol / chloroforme précipitation. Protéine extraite est ensuite digéré la trypsine, dessalée et enfin analysé par LC-MS/MS. Notre protocole d'extraction de microdomaines riches en stérols est optimisée pour la préparation de fractions membranaires de nettoyage détergentes résistant à partir de cultures de cellules d'Arabidopsis thaliana.

Nous utilisons marquage métabolique complète des cultures de cellules en suspension d'Arabidopsis thaliana avec K 15 NO 3 en tant que seule source d'azote pour les études protéomiques comparatives quantitatives suivantes de traitement biologique d'intérêt 3. Par les rapports de mélange égaux de cultures de cellules marquées et non marquées pour l'extraction des protéines de l'influence conjointe d'étapes de préparation de résultat quantitatif finale est maintenue à un minimum. De plus la perte de matière lors de l'extraction affecte à la fois le contrôle et le traitement des échantillons de la même manière, und donc le rapport de la lumière et le pilonnement peptide restera constante. Dans la méthode proposée soit marqué ou non marqué culture de cellules est soumis à un traitement biologique, tandis que l'autre sert de contrôle 4.

Introduction

En 1972, Jonathan Singer et Garth Nicolson proposé le modèle de la mosaïque fluide un modèle de la structure des membranes cellulaires, en remplaçant le modèle sandwich protéine-lipide-protéine qui a été généralement acceptée dans les années 1960. Singer et Nicolson ont postulé que la membrane biologique peut être considérée comme un liquide à deux dimensions où toutes les molécules de lipides et de protéines diffusent librement et facilement 5. Depuis ce temps, le modèle de la structure de la membrane plasmique et la connaissance de la composition de la membrane devient encore plus complexe. En particulier, au sein de la membrane plasmique, tels que des structures complexes de protéines et de troubles à base structurellement microdomaines lipidiques / stérol peuvent être observées. Dans les membranes des modèles artificiels 6,7, stérols et sphingolipides peuvent latéralement séparer des autres espèces lipidiques pour former des régions avec des caractéristiques physiques altérées. Cette ségrégation au sein de la membrane cellulaire est principalement causée par les propriétés d'auto-associer entre stérols et hautement sachaînes hydrocarbonées turés de phopsho-et sphingolipides 8. En particulier, les anneaux de stérol rigides favorisent les interactions avec les espèces plus rigide et rectiligne de lipides saturés et forcent ces interactions des chaînes hydrocarbonées voisins dans plusieurs conformations étendues, ce qui augmente l'épaisseur de la membrane et de la dureté.

L'une des fonctions les plus couramment observées de stérol enrichi microdomaines membranaires est leur insolubilité lors d'un traitement avec des détergents non ioniques tels un Triton X-100 ou le Brij 35. Ces fractions ont été pensés pour être identique à microdomaines membranaires et ont été appelés membranes résistantes aux détergents (DRM) en fonction de leur méthode de préparation biochimique 2. L'utilisation de détergents non ioniques lors de l'extraction de DRM a reçu quelques critiques comme la préparation de DRM biochimique peut ne pas correspondre directement à un compartiment membranaire spécifique au sein de la cellule vivante 9. En particulier, le détergent à taux de protéine semble crucial dans ces préparations, unes des détergents différents, ainsi que différentes quantités de détergents peuvent produire une composition différente du détergent résistant fraction de membrane 10. Cependant, il est évident que certaines espèces de protéines s'associent spécifiquement avec ces domaines membranaires riches en stérols cellulaires, et que ces protéines sont bien enrichies en préparations biochimiques des fractions de membrane résistant aux détergents 11. Le noyau de protéines qui ont été trouvés dans la fraction de DRM de l'usine, et pour qui la présence dans les DRM était stérol charge, étaient en particulier des protéines GPI, telles que les protéines de fascicline comme arabinogalactanes (SADF) et des membres de la famille des protéines SKU. En outre, certaines protéines de signalisation, telles que les kinases ou phospholipases récepteurs ont été récupérées 11. Ces résultats sont compatibles avec de nombreuses études protéomiques sur microdomaines membranaires de mammifères 12,13. Également dans les plantes il est de plus en évidence le rôle des microdomaines membranaires dans le contexte de la réponse au stress 14 -16.

Le protocole décrit ici fournit une méthode robuste pour le fractionnement de plasma microdomaines membranaires et en particulier utilise une protéine de concentration de détergent qui nous permet de représenter le stress induit des altérations de la riche en stérols compartiment membranaire 4,11,14.

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Protocol

PROCÉDURE

Des réactifs et tampons couramment utilisés dans le protocole d'extraction:

  1. JPL milieu pour des cultures de cellules en suspension d'Arabidopsis thaliana
    • 3 uM de H 3 BO 3
    • 3uM MnSO 4 x H 2 O
    • 1,1 uM de ZnSO 4 x 7 H 2 O
    • 0,15 uM KJ
    • 0,03 pM de Na 2 MoO 4 x 2 H 2 O
    • 3 nM CoCl 2 x 6 H 2 O
    • 3 nM CuSO 4 x 5 H 2 O
    • 0,9 mM de CaCl 2 x 2 H 2 O
    • MM MgSO 4 x 7 H 2 O 0,5
    • 0,5 uM FeSO4 x 7 H 2 O
    • 0,5 pM de Na 2 EDTA x 2 H 2 O
    • 0,12 uM thiamine HCl
    • 0,16 uM d'acide nicotinique
    • HCl de pyridoxine 0,097 uM
    • 0,107 uM NAA
    • MM KH 2 PO 4 0,375
    • MM NaH 0,0612 PO 4 x 2 H 2 O
    • 0,039 mM Na 2 HPO 4
    • 0.027 mM de glycine
    • 0,56 mM de myo-inositol
    • 1,5% de saccharose
    • 10 mM K 14 N ° 3 ou 10 mM K 15 N ° 3

Remarque: le pH du milieu JPL doit être ajusté à 5,7 avec du KOH. Le milieu doit être stérilisé par autoclavage ou filtration avant leur utilisation.

  1. Tampon H
    • 100 mM de HEPES-KOH (pH 7,5)
    • 250 mM de saccharose
    • 10% (p / v) de glycérol
    • EDTA 5 mM
    • L'acide ascorbique 5 mM
    • 0,6% (p / v) de PVP K-25 ou K-30
    • 5 mM de DTT (ajouter frais)
    • 1 mM de PMSF (ajouter frais)
    • inhibiteurs de la protéase et la phosphatase (ajouter frais)
      • MM NaF 50
      • 1 mM Na 3 VO 4
      • 1 mM benzamidin
      • 0,3 uM mikrocystin
      • 4 uM leupeptine
      • cocktail inhibiteur de protease
  2. Tampon R
    • Phosphate de potassium 5 mM
    • 0,33 M de saccharose
    • 3 mM de KCl
    • 0,1 mM d'EDTA
    • 1 mM de DTT (ajouter frais)
  3. Tampon TNE
    • 25 mM Tris-HCl, pH 7,5
    • 150 mM de NaCl
    • EDTA 5 mM
  4. Système à deux phases (6 g-système est adapté pour un maximum de 15 g de l'échantillon de poids frais) Méthode de préparation
    Dans 15 ml Falcon ingrédients tube mélange ci-dessous et bien mélanger:
    • 20% (w / w) de dextrane T500 - 2,6 g
    • 40% (p / p) de poly (éthylène glycol) (PEG 3350) - 1,3 g
    • saccharose - 0,678 g
    • 0,2 M phosphate de potassium, pH 7,8 à 0,15 ml
    • 2 M KCl - 0.014 ml
    • ajouter de l'eau jusqu'à ce que la masse totale du système à deux phases est de 6 g.
  5. Solutions de saccharose dans un tampon TNE
    • 2,4 M, 1,6 M, 1,4 M, 0,15 M
  6. Réactifs pour digestion par la trypsine
    • TUT: 6 M d'urée, thiourée 2 M (pH 8,0 avec 10 mM de Tris-HCl) tampon de réduction (1 pg / pl TNT dans l'eau; 6,5 mM)
    • tampon d'alkylation (5 ug / ul iodacétamide dans l'eau; 27 mM)
    • LysC endopeptidase (0,5 pg / pl)
    • La trypsine, sequencing grade modifiée (0,4 ug / ul)
  7. Réactifs pour peptide C dessalage plus de 18
    • solution de remise en suspension: 2% d'acide trifluoroacétique (TFA), 5% d'acétonitrile dans de l'eau
    • solution A: acide acétique à 0,5%
    • solution B: 80% d'acétonitrile, l'acide acétique à 0,5%
  8. Réactifs pour enrichissement phosphopeptidique
    • Solution A: 0,1% de TFA, 5% d'acétonitrile
    • Solution B: 0,1% de TFA, 80% d'acétonitrile
    • TiO 2 10 pm
    • Ammoniac (Traduction solution à 25%)
    • Pipéridine (actions 100%)

PROTOCOLES

Une. Marquage métabolique d'Arabidopsis thaliana cultures de cellules en suspension

  1. Cultivez Arabidopsis Col-0 cellulecultures en suspension provenant de feuilles 17 en plein 14 milieu N-JPL, et un ensemble de cultures (18 section "réactifs et tampons ordinaires» voir) dans 15 moyen N-JPL en flacon stérile à condition de lumière constante à 80 à 100 pmol / m 2 s, 23 ° C, sous agitation constante à 120 tours par minute.
  2. Pour maintenir les cultures cellulaires, inoculer 400 ml de milieu JPL frais avec 40 ml de culture cellulaire de sept jours dans une L flacons.
  3. La récolte des cultures de cellules se fait par aspiration sous vide à travers un entonnoir en verre de large avec une maille en acier inoxydable. Les cellules s'accumulent sur la plaque de maille et dans l'entonnoir et peuvent facilement être collectées à partir de là. Les cellules sont recommandés pour être congelé à -80 ° C ou dans l'azote liquide avant le broyage.

NOTE: Pour les 15 N cultures de cellules métaboliquement marquées utilisent le K 15 NO 3 en tant que seule source d'azote pendant au moins deux passages sur deux semaines 19. Dans expériences pour protéomique comparative, utilisent une culture marquée de la cellule 15 N et également de maintenir une culture non marqué en milieu normal. Le traitement biologique sera alors appliquée à la culture soit marqué ou non marqué, tandis que l'autre sert de témoin (figure 1). Pour la préparation de la protéine, les deux cultures seront combinées 20. Lors de la planification de l'installation expérimentale, nous recommandons de considérer une configuration réciproque d'étiquetage 4, dans lequel le même traitement est appliqué une fois les 15 cellules N-marqués et une fois pour les cellules non marquées et la non marqué respectif ou 15 cellules N-étiquetés servent de témoins. Dans ce cas, les doubles montants des cultures de cellules sont nécessaires.

2. Plasma Membrane Purification

Remarque: Toutes les autres étapes sont réalisées dans la chambre froide et / ou sur de la glace à moins qu'il soit noté autrement.

  1. Homogénéiser les cellules d'environ 1 L de vieux 7 jours de cultures en suspension de cellules dans de l'azote liquide.Le matériau peut être stocké à -80 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.
  2. Mélanger les mêmes quantités de cultures de cellules congelées marqués et non marqués par rapport au poids frais dans un bêcher et ajouter 2 volumes de tampon H immédiatement. En cas de membrane préparation de microdomaine il est suggéré d'utiliser au moins 7 g de poids frais des deux cellules marquées et non marquées.
  3. Placer le bécher sur un agitateur et agiter jusqu'à ce que le matériau est fondu et la solution est liquide et sans cristaux de glace.
  4. Filtrer le broyat par une couche de Miracloth en tubes de 50 ml de centrifugeuses.
  5. échantillons d'équilibrage avec tampon H et centrifuger à 10 000 g pendant 8 min.
  6. Chargez le surnageant dans des tubes ultra-centrifugation pré-refroidis (par exemple pour rotor Beckman Coulter SW31Ti), avec un volume d'environ 32 ml
  7. échantillons d'équilibrage avec tampon H et granulés les microsomes par centrifugation à 100 000 g à 4 ° C pendant 30 min en utilisant Beckman SW32Ti rotor.
  8. Retirer le surnageant après centrifugation.

    NOTE: Le surnageant contient les protéines solubles. Une petite quantité de cette fraction peut être sauvegardée pour une nouvelle précipitation des protéines et analyse subséquente également des protéines solubles.

    1. Remettre en suspension le culot de membranes de chaque échantillon en une quantité respective de tampon R et de charger sur le dessus de U1 système à deux phases (figure 2). Si le 6 g système à deux phases est utilisé, charger exactement 2 g de culot remis en suspension membranaire.

    REMARQUE: Le volume final de tampon R dépend de la taille du système à deux phases qui va être utilisé (~ 1,6 ml de tampon R est nécessaire pour l'utilisation de 6 système de g). Il est recommandé d'utiliser moins de mémoire tampon pour la remise en suspension de manière tampon pur peut être ajouté sur système à deux phases pour obtenir le poids demandé, plutôt que d'utiliser trop de mémoire tampon pour la solubilisation et ne pas être en mesure de charger la totalité de l'échantillon sur le système à deux phases.

    1. Charger le même volume de tampon R pur que celui utilisé pour ee échantillon remise en suspension sur U2.
    2. Mélangez lentement tubes U1 et U2 en les inversant 30x (environ 1 inversion / sec).

    NOTE: Ne pas agiter vigoureusement le système à deux phases. Il peut provoquer une absence de séparation des phases dans l'étape d'ultracentrifugation.

    1. Centrifuger les échantillons à 1500 x g à 4 ° C pendant 10 min.
    2. Retirer le surnageant après centrifugation.
    3. Transférer la phase supérieure de U1 sur U2 et répéter centrifugation à 1 500 g à 4 ° C pendant 10 min.
    4. Déplacez la phase supérieure de U2 dans les tubes d'ultracentrifugation SW41Ti et diluer avec cinq volumes de tampon R et bien mélanger.

    REMARQUE: La phase supérieure final peut être divisé dans des tubes d'ultracentrifugation séparés avant d'être dilué cinq fois.

    1. Centrifuger les échantillons à 200 000 xg à 4 ° C pendant une heure en utilisant le rotor SW41Ti.
    2. Remettre le culot de membrane en small quantité de tampon TNE (typiquement 200 ul de tampon est utilisé) pour l'isolement des membranes résistantes détergentes.

    NOTE: Une petite quantité de cette fraction peut être sauvegardé pour l'analyse de la membrane plasmique non fractionnée.

    REMARQUE: La fraction de membrane de plasma peut être conservé à 4 ° C pendant une nuit avant le fractionnement dans les membranes résistantes des détergents et des fractions solubles dans des détergents.

    3. Détergent résistant Préparation de membranes

    1. Vérifier la concentration de la fraction de membrane plasmique par dosage de Bradford.
    2. Ajouter Triton X-100 à la fraction de membrane plasmique. La concentration finale de détergent doit rester entre 0,5-1%. Le détergent à poids de protéines au rapport de poids devrait rester entre 13-15.
    3. Échantillons serré à environ 100 rpm à 4 ° C pendant 30 min.
    4. Ajouter trois volumes de 2,4 M de saccharose à un volume de la membrane de plasma traité pour obtenir une concentration finale de 1,8 M de saccharose. </ Li>
    5. Préparer le gradient de saccharose dans des tubes d'ultracentrifugation SW41Ti en chargeant les solutions de saccharose respectifs sur le dessus de la fraction de 1,8 M, comme illustré sur la figure 3.
    6. Centrifuger les échantillons à 250 000 xg à 4 ° C pendant 18 heures en utilisant le rotor Beckman SW41Ti.
    7. Retirez délicatement les tubes d'ultracentrifugation du rotor pour éviter de perturber la bande de basse densité qui peut être visible comme un anneau laiteux à l'interface de 0,15 M/1.4 M de saccharose. Parfois, rien ne peut être vu mais la fraction contient encore la fraction de protéine résistant à la lessive.
    8. Retirer fraction de 0,75 ml de volume à partir de la partie supérieure du gradient. Les fractions 2 et 3 qui couvrent volume d'environ 1,5 ml au-dessus de la bague d'interphase et 0,5 ml ci-dessous représentent la fraction de membrane résistant à la lessive. Recueillir ces fractions en tubes de 15 ml Falcon. Les fractions 9 et 10 contiennent la fraction membranaire soluble de détergent et peuvent également être collectées pour la comparaison. Pour une analyse plus approfondie, piscine fractions 2 et 3 ainsi que les fractions 9 et 10.

    4. Extraction des protéines de la fraction résistant détergent par le méthanol / chloroforme

    Remarque: Toutes les étapes sont réalisées dans la température ambiante.

    1. Ajouter 4 volumes de méthanol pour les fractions collectées et vortex soigneusement.
    2. Ajouter 1 volume de chloroforme, vortex soigneusement.
    3. Ajouter 3 volumes d'eau, vortex soigneusement.
    4. Centrifuger les échantillons à 2000 g pendant 5 min à l'aide d'une centrifugeuse de paillasse (par exemple Eppendorf 5417R).
    5. Éliminer la phase aqueuse au-dessus de la couche de protéines dans l'interphase.
    6. Ajouter 3 volumes de méthanol, vortex soigneusement.
    7. Centrifuger les échantillons à 4000 g pendant 10 min.
    8. Retirer le surnageant et sécher le culot. Le culot séché est prêt pour la digestion en solution.

    5. En solution de trypsine-Digestion

    NOTE: Dans cette procédure toutes les mesures sont effectuées àtempérature ambiante pour réduire la dérivation indésirable de acides aminés des chaînes latérales par les dénaturants.

    1. Dissoudre l'échantillon dans un petit volume de 6 M d'urée, 2 M thiurea, pH 8 (TUT). Utilisation en tant que faible volume est compatible avec l'échantillon (habituellement environ 40 ul).
    2. échantillons de Spin solubilisés dans TUT à 5000 xg dans une centrifugeuse de paillasse (par exemple Eppendorf 5417R) pendant 10 min à granulés toute matière insoluble.
    3. Le pH de la solution finale doit être près de 8.0 pour optimiser la digestion de la trypsine. Vérifier avec des bandes de pH.
    4. Ajouter 1 pi de tampon de réduction pour 50 pg de protéine de l'échantillon et incuber 30 min à température ambiante.

    NOTE: Seulement une estimation approximative de la teneur en protéines est nécessaire. Quand la quantité d'échantillon est limité, il est préférable de sacrifier la précision plutôt que de perdre échantillon sur une analyse des protéines.

    1. Ajouter 1 pi de tampon d'alkylation pour toutes les protéines de l'échantillon de 50 pg et incuber 20 min à température ambiante dans l'obscurité.
    2. Ajouter 0,5 pl d'LysC par 50 pg de protéine de l'échantillon et incuber pendant trois heures à température ambiante avec agitation constante à 700 tours par minute. Si nécessaire, le produit de digestion peut également être effectuée pendant une nuit. Cependant, le temps prolongé à des températures chaudes n'est pas recommandé car il peut augmenter la perte de peptide due à l'adsorption de matière du tube plastique sous aqueuses de pH 8 conditions.
    3. Diluer l'échantillon avec quatre volumes de 10 mM Tris-HCl, pH 8.

    REMARQUE: Cette étape est absolument nécessaire de diluer la concentration d'urée que la trypsine est très sensible à haute teneur en sel.

    1. Ajouter 1 pi de trypsine par 50 pg de protéine de l'échantillon et incuber pendant une nuit à température ambiante avec agitation constante à 700 tours par minute.
    2. On acidifie les échantillons à 0,2% de TFA pour atteindre une concentration finale de pH 2 (ajout d'environ 1/10 de volume d'acide trifluoroacétique à 2%).

    NOTE: Les échantillons peuvent être stockés à - 20 ° C jusqu'à ce que de plus utilisé, mais il est préférable de stockereux sur StageTips à 4 ° C si c'est pour une courte période (une semaine) ou de les stocker après StageTips dessalage.

    6. Fabrication de C-18 StageTips

    1. Placez un disque C18 Empore sur une surface plane et propre comme un plat jetable en plastique Petri.
    2. Percez un petit disque à l'aide d'une aiguille hypodermique pointe arrondie d'un diamètre de 1,5 mm. Le disque se colle à l'aiguille et peut être transféré dans un embout de pipette.
    3. Poussez le disque de l'aiguille et le fixer dans le rétrécissement d'une pointe de pipette par un morceau de silice ou d'un raccord à l'intérieur de l'aiguille tube fondu.

    REMARQUE: StageTips peuvent être stockés au sec à température ambiante 21.

    7. L'utilisation de C-18 StageTips pour Peptide dessalage et concentration

    1. Conditionner un C-18 StageTip en plaçant 50 pi de solution B sur le StageTip prêt. Faites tourner la pointe dans la centrifugeuse à 2000 rpm pendant 2 min dans une paillasse centrifuge (par exemple Eppendorf 5417R).

    REMARQUE: Utilisez des adaptateurs pour filer StageTips dans une centrifugeuse Eppendorf, liquide sera recueilli dans un tube de réaction de 2 ml. Pour les préparations à plus grande échelle, des conseils de carrière peuvent aussi être placés dans un rack de pointe avec 96 des 200 conseils de pi et le liquide peuvent être collectées dans une plaque de microtitration.

    NOTE: Ne jamais utiliser des vitesses plus élevées que 3000 xg dans une centrifugeuse de paillasse (par exemple Eppendorf 5417R) en raison du risque de tourner le disque C 18 de la pointe.

    1. Equilibrer la StageTip en utilisant une solution de 100 pi A. Spin la pointe dans la centrifugeuse à 5000 xg dans une centrifugeuse de paillasse (par exemple Eppendorf 5417R).
    2. Répétez l'étape 2.
    3. échantillon de charge sur le disque par pipetage soigneusement l'échantillon dans la pointe de la pipette avec le disque à l'intérieur.

    REMARQUE: Un disque peut se lier env. 100 ug de protéine.

    1. Faites tourner les conseils de la CEntrifuge jusqu'à ce que la totalité du volume de l'échantillon passe à travers le disque C 18.
    2. Laver les StageTips deux fois avec 100 pi de solution A. Retombées les conseils dans la centrifugeuse.

    REMARQUE: Les StageTips lavées et chargés peuvent être conservés à 4 ° C pendant jusqu'à une semaine.

    1. Éluer l'échantillon avec 40 pi de solution B. Recueillir l'éluat dans un nouveau tube de 1,5 ml de réaction.
    2. Concentrer l'échantillon dans le speed vac. Dans des conditions idéales, arrêter le processus de déshydratation car il est à peu près 1 ou 2 liquide pi gauche.

    NOTE: Les échantillons séchés peuvent être stockés dans l'-80 ° C pendant des années.

    1. Ajouter un volume final de 9 pi de solution de remise en suspension de l'échantillon et le transférer à la plaque de microtitration pour l'analyse de spectrométrie de masse.

    NOTE: Le volume final de la mémoire tampon de remise en suspension utilisé est fonction des besoins de l'expérimentateur et la sensibilité du spectromètre de masseutilisé.

    8. Protocole alternative pour Phosphopeptide enrichissement

    NOTE: Pour l'enrichissement de phosphopeptide, l'extraction des protéines à l'étape 2 doit être effectuée en présence d'inhibiteurs de phosphatases.

    NOTE: la concentration de protéines exacte n'a pas besoin d'être établie pour les étapes suivantes. Il est suffisant d'avoir une estimation approximative de la teneur en protéines pour éviter une perte inutile de l'échantillon

    1. Préparer le C-8 StageTips (suivre le même protocole de préparation de C-18 StageTips à l'étape 6).
    2. Transfert 1 mg de TiO 2-billes vers le haut de prêt C 8-StageTips (utilisation 1 mg TiO 2 par 100 ug de protéine).
    3. Equilibrer les TiO 2-conseils avec 100 pi de la solution C, essorage à 2000 g pendant 5 min dans une centrifugeuse de paillasse (par exemple Eppendorf 5417R).
    4. Mélanger 100 ug de peptides digérés et dessalée à partir de l'étape 7.7 (elle devrait être dans 100 ul de solutionB) avec 100 pi de solution A.
    5. Chargez échantillon mixte sur les équilibrées TiO 2 colonnes; rotation à 1000 xg, 5 min.
    6. Recueillir le flux continu et le charger sur la même pointe de nouveau (garder l'écoulement à travers après la deuxième passe).
    7. Laver pointe avec 100 pi de la solution A, tournent à 2000 xg, 5 min dans une centrifugeuse de paillasse (par exemple Eppendorf 5417R).
    8. On élue l'échantillon avec 50 ul de 5% d'ammoniac.
    9. On élue l'échantillon avec 50 ul de 5% de pipéridine (deux éluats peuvent être combinés).
    10. Acidifier immédiatement l'échantillon en utilisant 50 ul de 20% d'acide phosphorique. pH devrait être d'environ 2.

    NOTE: Sauvegardez les conseils de TiO 2 et récupérer la poudre. Il peut être lavé avec la solution B et utilisé à nouveau pour un ou deux tours de plus.

    1. Encore une fois dessaler échantillons acidifiés sur C 18 conseils (voir l'étape 8).

    9. Analyse LC-MS/MS d'un peptide Mélanges

    1. Reprendre phosph dessaléeopeptides dans un tampon de remise en suspension.
    2. Charge remis en suspension l'échantillon sur le système LC-MS/MS de choix et d'acquérir les spectres en mode dépendant des données à résolution de 60 000 suggère des largeurs à mi-hauteur.

    NOTE: Pour la fragmentation optimale, soit neutre perte de balayage doit être appliqué 22, ou le cas échéant l'activation en plusieurs étapes 23. Si ETD est disponible, il permet la fragmentation du squelette peptidique sans perte de l'acide phosphorique 24.

    REMARQUE: Les listes de pointe à partir des données brutes doivent être extrait et soumis à l'identification de base de données ainsi que pour la quantification. Ici, nous décrivons les réglages pour utiliser la mascotte et MSQuant, qui fonctionne pour les fichiers de données brutes de LTQ, LTQ-Orbitrap et instruments LTQ-FT (Thermo Scientific).

    1. Extrait liste de pointe utilisant DTAsupercharge dans le menu "Aide" dans MSQuant. Utilisez les paramètres par défaut.
    2. Soumettre un fichier de liste de crête à moteur de recherche Mascot résultant. Crparamètres itical: précurseurs ion masse tolérance de 10 ppm, MS / MS de masse une tolérance de 0,5 Da. Modifications fixes: carbamidomethylation de cystéines, modifications variables: oxydation de la méthionine, la phosphorylation de la sérine, la thréonine, la tyrosine. Méthode de quantification: 15 N marquage métabolique.
    3. Enregistrer le résultat en tant que mascotte fichier de la page Web.
    4. De charger le fichier de résultat mascotte et le fichier brut en MSQuant. Sélectionnez toutes les protéines d'intérêt et exécuter "quantification automatique". Le programme va lire spectres complets du fichier brut et faire l'intégration de pointe pour les partenaires étiquetés et non étiquetés de chaque peptide.
    5. Exporter les résultats de quantification à un programme de feuille de calcul ou un fichier texte délimité par des tabulations. Les données peuvent ensuite être soumis à une analyse plus approfondie des statistiques dans Excel ou d'utiliser d'autres logiciels tels que Statquant 25 ou Cracker 26.

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Representative Results

Avec le protocole présenté à l'aide de cultures de cellules d'Arabidopsis métaboliquement marquées, il est possible d'isoler des membranes plasmatiques à partir de tissus végétaux (étape 2, les figures 2 et 4), et un enrichissement en résistant aux détergents des fractions de membrane à l'intérieur de la membrane plasmique (étape 3, les figures 3 et 5). Par la suite, le protocole permet l'extraction de protéines à partir de ces détergents résistant fractions membranaires (étape 4) et la digestion de la protéine pour l'analyse protéomique comparative (étape 5). Enfin, l'enrichissement facultative de phosphopeptides (étape 8) est particulièrement intéressante dans l'étude des processus de signalisation cellulaire. La dernière étape consiste alors l'analyse quantitative de données (étape 9, figure 6) de rapports d'abondance des protéines dans les fractions membranaires provenant de la culture de cellules marquées et non marquées.

Les résultats typiques après le mélange du système 2-phase (étape 2) et centrifugation ultérieure sont une phase supérieure de couleur claire et unvert coloré phase inférieure (Figure 2). Plasma vésicules membranaires s'associent préférentiellement avec la phase de PEG supérieure, tandis que les vésicules membranaires à partir de chloroplastes verts et d'autres membranes intérieures sont incorporés dans la phase dextrane inférieur. Si la séparation de couleur ne peut pas être observée, l'étape 2 n'a pas été effectuée correctement, et des membranes plasmiques est contaminé par des quantités significatives de membranes internes. L'enrichissement de protéines de la membrane plasmatique peut être démontré par l'analyse protéomique de petites fractions aliquotes de plasma des fractions membranaires et des protéines dans la phase inférieure du système à deux phases. La phase inférieure contient les membranes internes de la cellule. Par exemple, des protéines de membrane particulièrement typiques connus de plasma, telles que les protéines du récepteur de kinase ont montré une forte abondance dans la fraction de membrane plasmique (PM) et une faible abondance dans la fraction inférieure de phase (figure 4A) contenant les membranes internes (IM). À leur tour, les protéines connues de l'émission du réticulum endoplasmique hautabondance dans la fraction de membrane interne et n'a pas été observée dans la fraction de membrane plasmique (figure 4B).

L'enrichissement subséquent de détergents fractions membranaires résistantes (étape 3) dans le cas idéal aura pour résultat la formation d'un anneau laiteux de faible densité des vésicules membranaires à environ 1/5 ème de la hauteur du tube (figure 3). Si le réglage de Triton X-100 concentrations ou le détergent dans le rapport de la protéine (étape 3.2) est optimal pour la séparation en résistant aux détergents et des détergents fractions solubles, des bagues supplémentaires peuvent être observées dans les parties inférieures de la pente et il y aura aussi des touffes membranaires dans la bande de basse densité. Dans ces cas, le détergent dans le rapport de la protéine ou de la quantité totale de détergent est différente de la concentration micellaire critique nécessaire pour une séparation reproductible des deux fractions de domaines membranaires. En utilisant la concentration finale de détergent et détergent à taux de protéine décrite ici, Enrichment microdomaines de protéines typiques, tels que Remorin (AT3G61260) 27 a pu être confirmée par une analyse comparative par spectrométrie de masse de la fraction de DRM, détergent fraction soluble (étape 3.8) ainsi que de la membrane plasmatique non fractionnée et les membranes internes. Meilleure abondance de la protéine de Remorin a été trouvé dans les fractions de DRM comme prévu (figure 6A). Les protéines ne sont pas présentes dans les microdomaines membranaires tels que l'ABC-transporteur AT1G59870 (figure 6B), ne montrent pas une augmentation de l'abondance de la fraction de DRM. Contaminants également typiques, comme une protéine mitochondriale (AT2G07707) du complexe ATPase F0 (figure 6C) et la protéine ribosomique (At1G001100) du ribosome 60S (figure 6D) ne montrent pas une abondance enrichi dans la fraction de DRM, bien que des quantités minimes peuvent encore être identifiés.

Après abondances analyse par spectrométrie de masse, les protéines des rapports de statut de phosphorylation de protéine dans le plasmafractions membranaires des cultures de cellules marquées et non marquées peuvent être distingués quantitativement (figure 6). Des résultats typiques de l'MSQuant ( msquant.alwaysdata.net fenêtre de quantification) doivent montrer un rapport d'intensité de l'ion de un pour un pour la plupart des peptides identifiés (Figure 6A). Ces peptides avec ratio de l'intensité d'ions s'écartant sensiblement de 1:1 sont considérés comme différentielle réglée entre la culture cellulaire marqué et non marqué, et sont des candidats pour correspondre à des protéines affectées par le traitement appliqué (Figure 6C). Un bon contrôle de la qualité du marquage métabolique avec succès est la co-élution des versions à la fois marqués et non marqués peptidiques comme un pic unique dans la séparation nano-HPLC (étape 9), comme illustré sur les figures 6B et D.

Figure 1 Figure 1. Le marquage métabolique stratégie expérimentale. Représentation schématique de deux variantes de design expérimental lors de l'utilisation de cultures de cellules non marquées A. thaliana entièrement métabolique marqués et. L'expérimentateur peut soit décider d'utiliser 14 N cellules (sans étiquette) en tant que témoin et 15 N (cellules marquées métaboliquement) qui subissent un traitement biologique ou vice versa. Dans un modèle expérimental réciproque les deux variantes sont effectuées en parallèle.

Figure 2
Figure 2. Procédure pour la séparation des vésicules de membrane de l'installation sur un système aqueux à deux phases à base de polyéthylène glycol (PEG) et le dextrane. Vésicules de membrane de plasma séparé en phase de PEG supérieure tandis que les membranes des chloroplastes et d'autres associés à l'intérieur Bottphase de dextran om après centrifugation. Avec lavage supplémentaire de phase supérieure mieux purification peut être réalisée, mais aussi la perte matériau est augmentée.

Figure 3
Figure 3. L'enrichissement des fractions membranaires de faible densité. Représentation du gradient de saccharose pour l'enrichissement de détergents résistant fractions de membrane à faible densité. L'emplacement prévu après la centrifugation pendant une nuit de la bande de membrane à faible densité vésicule est indiqué.

Figure 4
Figure 4. L'enrichissement de protéines de la membrane plasmatique après purification dans le système à deux phases. Normalizedintensités protéine d'ions pour des protéines mesurées dans la membrane plasmique (PM) et les membranes internes (IM) de la fraction. (A) constituants connus typiques de la membrane plasmique montrent beaucoup plus abondantes dans la fraction de PM que dans la fraction IM. composants connus (B) Naturel des membranes internes montre le comportement inverse. Pour la normalisation, de l'intensité des sommes d'ions pour chaque protéine ont été exprimées comme une fraction de l'intensité totale d'ions par échantillon et ensuite la moyenne entre les réplicats. Fraction d'intensités ioniques totaux ont alors été exprimée en tant que rapport à la moyenne entre les deux traitements. Les barres d'erreur représentent la déviation standard de trois préparations de cultures de cellules cultivées de façon indépendante. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 5 Figure 5. . L'abondance des protéines marqueurs standard dans les fractions mesurées parcelles représentent la répartition des normalisées intensités protéine d'ions de marqueurs choisis de protéines vers des compartiments intracellulaires (DRM - microdomaines riche en stérols, PM - la membrane plasmique, messagerie instantanée - membranes internes, SP - protéines solubles). modèles d'abondance de (A) Remorin comme marqueur de microdomaines membranaires riche en stérols, (B) de type ABC protéine de la famille du transporteur en tant que représentant d'une protéine non stérols dépendant, (C) sous-unité du complexe F0 mitochondrial, (D) 60S sous-unité de ribosomes comme un contaminant typique co-purification. Pour la normalisation, de l'intensité des sommes d'ions pour chaque protéine ont été exprimées comme une fraction de l'intensité totale d'ions par échantillon et ensuite la moyenne entre les réplicats. Fraction des intensités ioniques totaux ont ensuite été exprimée en rapport à la moyenne entre les deux traitéstments. Les barres d'erreur représentent la déviation standard de trois préparations de cultures de cellules cultivées de façon indépendante. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 6
Figure 6. Les résultats attendus de protéines par spectrométrie de masse quantitative. Capture d'écran de MSQuant montrant le rapport 1:1 d'intensité d'ions attendu d'un peptide à partir d'un mélange 1:1 d'extraits de protéines de cellules marquées et non marquées d'Arabidopsis. (A) spectre Analyse complète du peptide DNNLLGK clairement séparation marquée (pic à droite) et non marquée la version (pic de gauche) des peptides sur l'axe m / z. La masse monoisotopique et le premier isotope sont indiquées par des marques bleues. (B) marqué (bleu) uned non marqués (rouge) versions du peptide co-élution à un seul pic au cours de la chromatographie nano-HPLC. (C) du spectre de balayage complet d'un peptide avec un rapport d'intensité de l'ion de 1:5 en tant que candidat pour une protéine différentiellement régulée. (D ) également des protéines avec des rapports différents de 1:1 coéluent en chromatographie en phase inverse. Cliquez ici pour agrandir la figure .

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Discussion

Le protocole présenté dans ce document comporte de nombreuses étapes et chacun d'eux est crucial pour obtenir un fractionnement pur et représentatif de la membrane plasmique de la plante dans les membranes résistantes des détergents et des fractions solubles dans des détergents. Par conséquent, il est important de suivre chaque étape les instructions.

Le traitement de la fraction de membrane plasmatique avec un détergent non-ionique (étape 3.2) a la plus forte influence sur la qualité de la membrane micro-domaine fractionnement. Pour obtenir des résultats reproductibles entre les différentes préparations, et à être en mesure de comparer des échantillons différents de la même expérience, il est très important d'évaluer avec précision la concentration de protéines dans la membrane plasmique et d'appliquer le détergent toujours dans le même rapport par rapport à la teneur en protéines et toujours à la même concentration finale. Pratiquement, cela signifie que, parfois, il est nécessaire de diluer les échantillons avec une concentration élevée de protéine ou d'utiliser différentes valeurs de concentrationde Triton X-100.

Dans les études biochimiques, il ya eu récemment une tendance parmi les chercheurs d'utiliser une méthode sans détergent pour l'isolement de microdomaines membranaires 28-30. Ces méthodes sont basées sur une rupture mécanique de la membrane plasmique par cisaillement à travers une très petite aiguille de manière analogue à la presse à cellule de pression française. Ces procédures ont été appliquées avec succès à des cultures de cellules de mammifères riches en microdomaines de la membrane, mais l'application à la paroi cellulaire contenant des organismes (levures, cellules végétales) n'a pas été signalée. Utilisation de la protéomique quantitative avec des produits de stérol perturbateurs, tels que le méthyl-bêta-cyclodextrine, il a été montré que les fractions DRM préparés à partir de la membrane plasmique de la plante ne contiennent des protéines qui sont des marqueurs pour les microdomaines de la membrane 11.

En ce qui concerne les résultats définitifs de spectrométrie de masse quantitative, les résultats typiques illustrés à la figure 6 représentent la situation idéale dansoù l'intensité d'ions pour la majorité des peptides marqués et non marqués sont proches identique. Cependant, dans certains cas, un certain degré de variation biologique entre les ensembles de cultures de cellules marquées et non marquées peuvent être observées. Ainsi, avant le traitement biologique de l'une étiquette ou une culture de cellules non marqué est effectuée, l'analyse d'un mélange de cellules témoins marqués et non marqués, à la fois, sans aucun traitement, permet l'identification de peptides avec une ratios divergents à partir de l'idéal pour une situations. Ces protéines ayant des rapports divergents des indications de la variation biologique. Pour relever le défi de distinguer les effets du traitement de la variation biologique, nous proposons donc d'utiliser l'étiquetage réciproque des expériences appariées 20. Dans le dispositif expérimental réciproque, les deux variantes de l'expérience sont effectuées de la manière proposée sur la figure 1 et les étapes du protocole sont suivis comme décrit. Ensuite, on compare les ratios de p de l'intensité d'ionsroteins à la fois des expériences réciproques, on peut distinguer si les différences entre les taux d'intensité d'ions sont dues à la variation biologique ou comme un effet du traitement appliqué.

Une autre méthode pour résoudre le problème de la différence entre les effets du traitement et de la variation biologique est l'utilisation d'un standard interne marqué comme référence pour tous les traitements 31. Dans cette approche, le contrôle non marqué et cellules non marquées qui subissent un traitement biologique sont mélangés avec la même quantité de cellules de contrôle marqués lourds, provenant du même lot. Il permet d'éliminer l'influence de la variation biologique sur le rapport de peptide, car les protéines sont considérées comme significatives, si les ratios de 14 N-contrôle / 15 N-commande et 14 N-traitement / 15 N-contrôle l'intensité des ions sont significativement différentes. Ceci est possible, comme le standard marqué est exactement la même dans tous les cas.

Un des drawbacks de la procédure d'enrichissement de DRM est décrit ici sont les co-purification des protéines qui peuvent être identifiés dans la fraction de membrane résistant à la lessive. Dans la liste des protéines identifiées à partir de la fraction de membrane résistant aux détergents de faible densité, on peut observer régulièrement un grand nombre de protéines ribosomiques. En raison de la densité relativement faible des protéines ribosomales, ils migrent à la même fraction stérol comme dépendantes de protéines membranaires dans le gradient de saccharose. Il a été démontré sans aucun doute que les protéines ribosomales sont clairement pas des constituants de microdomaines membranaires 11. Pour exclure ces derniers et d'autres protéines co-purification pas réellement associés aux résistants détergents fractions membranaires de faible densité, nous proposons d'analyser également la composition protéomique des membranes intracellulaires (GI) qui peuvent être extraites de la phase de dextran inférieure des deux- système en phase et à comparer les rapports des contaminants possibles entre la membrane interne et la DRM abondancefraction (voir les exemples de la figure 5). Protéines DRM co-purification devraient avoir abondances similaires dans les deux fractions (IM et DRM).

Fractionnement d'extraits cellulaires et des microdomaines membranaires est une stratégie commune pour réduire la complexité dans un échantillon pour analyse protéomique 32. Par conséquent, le protocole décrit ici est utile pour toutes les études sur les processus de signalisation à la membrane plasmique des cellules végétales. Applications biologiques sont à étudier les réactions de stress ainsi que des infections pathogènes qui tous dans une large mesure induisent des altérations dans la composition de la membrane plasmique et la modification des protéines de la membrane 14,15. En plus d'étudier les réactions de stress, la quantification de l'abondance des protéines dans différentes fractions membranaires peut grandement aider à l'annotation des protéines inconnues encore 33 34,35.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.

L'auteur, Witold Szymanski, est un employé de l'Institut Max Planck de physiologie moléculaire des plantes. L'auteur, Waltraud Schulze est un employé de l'Université de Hohenheim, en Allemagne.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Chemicals were ordered from Sigma-Aldrich unless noted otherwise
Ammonia (stock 25 % solution) WAKO 010-03166
TiO2 10 μm GL-Science 5020-75010
Empore Disk C18 Varian 12145004
Polyethylene glycol(PEG 3350) Sigma 88276
Dextran T500 Roth 9219.2
Trypsin Promega V5113
Protease inhibitor cocktail (PIC) Sigma P9599
K15NO3 Cambridge Isotope Laboratories NLM-765-PK
EQUIPMENT
Optima L-80 XP Ultracentrifuge Beckman
Plate reader BioTek
EASY-nLC II nano-Liquid Chromatograph Thermo Scientific
LTQ-Orbitrap mass spectrometer Thermo Scientific
Centrifuge 5810R Eppendorf
Centrifuge 5417R Eppendorf
Thermomixer Eppendorf
Speed Vac RVC 2-25 Christ
Shaker Unimax 2010 Heidolph

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References

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