Summary
ここでは、 シロイヌナズナの細胞培養というラベルのN 15、完全に標識されていないとの混合物をベース洗剤に耐性と洗剤の可溶性膜にし、 生体内で植物の形質膜の分画するための堅牢な方法が記載されている。手順は、シグナリングプロセスを理解するために、比較プロテオミクス研究のために適用される。
Abstract
原形質膜マイクロドメインは、脂質やステロール環境の物理的性質に基づいて特徴であり、プロセスのシグナル伝達に特定の役割を持っている。プロテオーム解析のための植物細胞からのステロールに富む膜マイクロドメインを抽出し、他の細胞区画からの汚染のために複数の準備手順とソースに主に困難な作業です。原形質膜は、植物細胞内のすべての膜の約5〜20％を構成し、従って、高度に精製された原形質膜画分の単離は困難である。頻繁に使用される方法は、95％の純度を有する1原形質膜小胞を生じるポリエチレングリコールおよびデキストラン中水性二相分配を伴う。原形質膜内のステロールに富む膜マイクロドメインは、アルカリ性pHで冷非イオン性界面活性剤での処置の際に不溶性である。この界面活性剤耐性膜画分は、で超遠心分離によりバルクプラズマ膜から分離することができるucroseグラデーション2。続いて、タンパク質は、メタノール/クロロホルム沈殿によってショ糖勾配密度の低いバンドから抽出することができる。抽出したタンパク質は、その後、脱塩し、最終的に、LC-MS/MSで分析トリプシン消化されます。ステロールに富むミクロドメインのための私達の抽出プロトコルは、 シロイヌナズナ細胞培養物からの清浄な界面活性剤耐性膜画分の調製のために最適化される。
我々は興味3の生物学的処理を以下の定量的な比較プロテオミクス研究のための唯一の窒素源としてK 15 NO 3とシロイヌナズナ懸濁細胞培養の完全な代謝標識を使用しています。関節タンパク質抽出のための標識および非標識細胞培養物の等量比を混合することにより、最終的な定量的結果についての準備段階の影響を最小限に維持される。また抽出時の材料の喪失は、コントロールと同じように処理サンプルの両方に影響を与えるDそのため、光とヒーブペプチドの比率は一定のままである。もう一方は対照4として機能する提案方法のいずれかで標識するか、または非標識の細胞培養は、生物学的処理を受ける。
Introduction
1972年には、ジョナサン·シンガーとガースニコルソンは、一般的に1960年代初頭に受理されたタンパク質 - 脂質 - タンパク質サンドイッチモデルを置き換え、流動モザイクモデルの細胞膜の構造モデルを提案した。歌手とニコルソンは生体膜は、すべての脂質およびタンパク質の分子が自由に拡散し、容易に5二次元液体として考えることができると仮定した。その時以来、膜組成の原形質膜と知識の構造モデルがさらに複雑になった。特に、原形質膜内に、そのようなタンパク質複合体および脂質/ステロール基づいて構造的に無秩序なミクロドメインのような構造を観察することができる。人工モデル膜6,7において、ステロールおよびスフィンゴ脂質は、横方向に変化した物理的特徴を有する領域を形成するために、他の脂質種から分離することができる。細胞膜内でのこの分離は、主にステロールの高いSA間の自己会合特性によって引き起こされるphopshoとスフィンゴ脂質8の炭化水素鎖をturated。特に、剛性ステロールリングは、剛性がまっすぐ飽和脂質種との相互作用に有利とこれらの相互作用は、膜の厚さ及び硬度を高める、より拡張された立体配座に隣接する炭化水素鎖を強制。
ステロール濃縮膜マイクロドメインの一般的に観察特徴の一つは、非イオン性界面活性剤、トリトンX-100またはブリジ35で処理するとそれらの不溶性だった。これらの画分を膜マイクロドメインと同一であると考えられていたし、その生化学的製造法2に基づいて、洗剤耐性膜（DRM）と呼ばれていました。 DRM抽出中の非イオン性界面活性剤の使用は、生化学的なDRMの準備を直接生きた細胞9内の任意の特定の膜コンパートメントに対応しないことなど、いくつかの批判を受けた。特に、タンパク質の比洗剤は、このような調製において重要と思われる異なる界面活性剤だ、ならびに異なる界面活性剤の量は、界面活性剤耐性膜画分10の異なる組成物を得ることができる。しかし、特定のタンパク質種は、これらの特異的細胞性ステロールに富む膜ドメインに関連付けることを示す証拠があり、これらのタンパク質がよく界面活性剤耐性膜画分11の生化学的調製物において富化される。植物DRM画分に認められた、とのDRMでの存在が依存ステロールであったために、タンパク質のコアは、このようなファスシクリン様アラビノガラクタンタンパク質（のFLA）とのSKUタンパク質ファミリーのメンバーとして特にGPIアンカー型タンパク質であった。また、このような受容体様キナーゼまたはホスホリパーゼのようないくつかのシグナル伝達タンパク質は、11を発見された。これらの結果は、哺乳類の膜マイクロドメイン12,13に関する多くのプロテオミクス研究と一致している。また、植物のストレス応答14の文脈における膜マイクロドメインの役割のための証拠が増えている-16。
ここに記載されているプロトコルは、細胞膜マイクロドメインの分別のための堅牢な方法を提供し、特に、私たちは、ステロールが豊富な膜コンパートメント4,11,14のストレス誘発性の変化を描くことを可能にする界面活性剤濃度、タンパク質を使用しています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
手順
抽出プロトコルで使用される一般的な試薬および緩衝液：
- シロイヌナズナ懸濁細胞培養のための培地JPL
- 3μMのH 3 BO 3
- 3μMのMnSO 4×H 2 O
- 1.1μMのZnSO 4×7、H 2 O
- 0.15μMKJ
- 0.03μMのNa 2のMoO 4×2、H 2 O
- 3 nMののCoCl 2×6、H 2 O
- 3 nMでのCuSO 4×5、H 2 O
- 0.9のCaCl 2×2、H 2 O
- 0.5のMgSO 4×7、H 2 O
- 0.5μMのFeSO 4×7、H 2 O
- 0.5μMEDTA、X 2、H 2 O 2のNa
- 0.12μMチアミン塩酸
- 0.16μMのニコチン酸
- 0.097μM塩酸ピリドキシン
- 0.107μMNAA
- 0.375 mMのKH 2 PO 4
- 0.061のNaH2 PO 4×2 H 2 O
- 0.039のNa 2 HPO 4
- 0.027 mMグリシン
- 0.56 mMのミオイノシトール
- 1.5％スクロース
- 10のK 14 NO 3または10のK 15 NO 3
NOTE：JPL培地のpHはKOHで5.7に調整されるべきである。培地は、ろ過または使用前にオートクレーブ滅菌しなければならない。
- バッファH
- 100mMのHEPES-KOH（pH7.5）で
- 250 mMスクロース
- 10％（w / v）のグリセロール
- 5のEDTA
- 5mMのアスコルビン酸
- 0.6％（w / v）のPVP K-25またはK-30
- 5のDTT（新鮮追加）
- 1mMのPMSF（新鮮追加）
- プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤（フレッシュ追加）
- 50のNaF
- を1mMのNa 3 VO 4
- 1 mMのbenzamidin
- 0.3μMmikrocystin
- 4μMロイペプチン
- プロテアーゼ阻害剤カクテル
- バッファR
- 5 mMリン酸カリウム
- 0.33 Mショ糖
- 3のKCl
- 0.1mMのEDTA
- 1のDTT（新鮮追加）
- バッファTNE
- 25mMのトリス-HCl、pH7.5で
- 150のNaCl
- 5のEDTA
- 二相系（6グラムシステムは、試料の新鮮重量の最大15グラムに適しています）の調製方法
以下に挙げると、15ミリリットルファルコンチューブミックス成分でよく混ぜる。- 20％（w / w）のデキストランT500 - 2.6グラム
- 40％（w / w）のポリ（エチレングリコール）（PEG 3350） - 1.3グラム
- ショ糖 - 0.678グラム
- 0.2 Mリン酸カリウム、pHを7.8〜0.15ミリリットル
- 2 MのKCl - 0.014ミリリットル
- 二相系の総質量が6グラムになるまで水を加える。
- TNE緩衝液中のショ糖のソリューション
- 2.4 M、1.6 M、1.4 M、0.15 M
- トリプシン消化のための試薬
- UTU：6 M尿素、2 Mチオ尿素（10mMトリス-HClでpH 8.0） 縮小バッファ（水中1μgの/μLのDTT、6.5 mM）を
- アルキル化緩衝液（水中の5μg/μLヨードアセトアミド; 27ミリモル）
- のLysCエンドペプチダーゼ（0.5μgの/μL）
- トリプシン、修正された配列決定グレード（0.4μgの/μL）
- C 18以上のペプチドの脱塩のための試薬
- 再懸濁溶液：2％トリフルオロ酢酸（TFA）、水中5％アセトニトリル
- 溶液A：0.5％酢酸
- 溶液B：80％アセトニトリル、0.5％酢酸
- リン酸化ペプチド濃縮のための試薬
- 溶液A：0.1％TFA、5％アセトニトリル
- 溶液B：0.1％TFA、80％アセトニトリル
- TiO 2の 10ミクロン
- アンモニア（株式25％溶液）
- ピペリジン（株式100％）
プロトコール
1。 シロイヌナズナ細胞懸濁培養の代謝標識
- シロイヌナズナ COL-0細胞を成長さフル14 N-JPL培地で葉17から派生した懸濁培養、80から100マイクロモル/ mにおける一定の光条件での無菌フラスコ内の15のN-JPL媒体に、文化の1セット（18 " は一般的な試薬および緩衝液」の項を参照してください） 2秒、23℃、120 rpmで振とう定数の下で。
- 細胞培養物を維持するために、1 Lフラスコ七日齢の細胞培養物を40mlの新鮮なJPLの培地400mlに接種する。
- 細胞培養物の採取は、ステンレス鋼メッシュの広いガラス漏斗を通して真空吸引を介して起こる。細胞は、メッシュ板上に漏斗内に蓄積し、そこから容易に収集することができる。細胞は、粉砕する前に、-80℃で、液体窒素中で凍結することをお勧めします。
注：15 Nに対して代謝的に標識された細胞の培養は2週間19よりも少なくとも2継代のための窒素の唯一の供給源として、K 15 NO 3を使用しています。 EXPE中比較プロテオミクス用riments、15 N標識した細胞培養を使用して、通常の培地中で標識されていない文化を維持します。他方は対照（ 図1）として機能する生物学的処理は、次いで、標識又は非標識のいずれかで培養物に適用される。タンパク質調製のために、両方の培養物を20組み合わされる。実験を計画するとき、私たちは相互のラベルと同じ処理が一度非標識細胞への15 N標識細胞に一度適用されるセットアップ4とそれぞれ標識されていないか、15 N標識細胞は対照とするを検討することをお勧めします。この場合には、細胞培養物の二量が必要とされている。
2。形質膜精製
NOTE：それは特に断りのない限り、すべてされ、さらにステップは低温室で、および/または氷上で行われる。
- 液体窒素中で7日間、古い細胞懸濁培養の約1Lから細胞を均質化する。物質をさらに使用するまで-80℃で保存することができる。
- ビーカーに新鮮重量を基準にして標識し、非標識凍結細胞培養の同量を混ぜ、すぐにバッファのH 2容量を追加します。膜マイクロドメイン調製物の場合には、両方の標識および非標識細胞の少なくとも7 g生重量を使用することが提案されている。
- シェーカー上ビーカーを置き、材料が溶融し、溶液が液体と氷の結晶なしであるされるまで振る。
- 50mlの遠心管にミラクロスの1層を通してホモジネートをフィルタリングします。
- 8分間万×gでバッファHと遠心分離機とのバランスサンプル。
- 約32ミリリットルの容量で、予め冷却した超遠心分離管（ローターベックマン·コールターSW31Ti用など ）に上清をロード
- 緩衝液HとのバランスサンプルとベックマンSW32Tiローターを用いて30分間4℃で10万×gで遠心分離することによりミクロソームをペレット。
- 遠心分離後の上澄み液を除去します。
注：上清を可溶性タンパク質が含まれています。この画分の少量はまた、可溶性タンパク質のさらなるタンパク質沈殿およびその後の分析のために保存することができる。
- 緩衝Rのそれぞれの量は、各試料の膜ペレットを再懸濁し、U1二相系（ 図2）の上部にロードする。 6グラム二相系が使用される場合、再懸濁した膜ペレットを正確に2グラム読み込む。
NOTE：Rバッファの最終容量（6グラム系を使用した場合、バッファR 1.6mlのが必要とされる〜）使用されようとしている二相系のサイズに依存する。それは、その純粋なバッファがなく、2相システムにサンプル全体をロードできる可溶化のためにあまりにも多くのバッファを使用していないよりも、要求される量を得るために2相系に加えることができ、再懸濁にはあまりバッファを使用することをお勧めします。
- 目に使用した純粋な緩衝液Rの同じボリュームをロードU2へのEサンプルの再懸濁。
- ゆっくり30X（約1反転/秒）、それらを反転させて、U1とU2チューブを混ぜる。
注：積極的に2相系を振らないでください。これは、超遠心分離工程での相分離の欠如を引き起こす可能性があります。
- 10分間、4℃で1500×gでサンプルを遠心分離する。
- 遠心分離後の上澄み液を除去します。
- U2の上に、U1から上相を移し、10分間、4℃で1500×gの遠心分離を繰り返します。
- SW41Ti超遠心管にU2から上相を移動し、バッファRの5倍量に希釈し、十分に混合します。
注記：最終の上相は、それが5倍に希釈することができる前に、別個の超遠心管に分割しなければならないかもしれない。
- SW41Tiローターを用いて1時間4℃で20万×gでサンプルを遠心分離する。
- Smalの中で再懸濁膜ペレット界面活性剤耐性膜の単離のためのTNE緩衝lの量（典型的には、緩衝液200μlを使用している）。
注：この画分は少量の未分画細胞膜の分析のために保存することができる。
注：原形質膜画分を一晩洗浄剤および界面活性剤耐性膜可溶性画分へ分別する前に4℃で保存することができる。
3。洗剤耐性膜調製
- Bradfordアッセイにより、細胞膜画分の濃度を確認してください。
- 原形質膜画分へのトリトンX-100を追加します。洗浄剤の最終濃度は0.5〜1％の間を維持する必要があります。重量比へのタンパク質重量の洗剤は13〜15の間滞在する必要があります。
- 30分間、4℃で約100 rpmでサンプルを振る。
- ショ糖の1.8 Mの最終濃度を得るために、プラズマ処理膜の1の体積に2.4 Mショ糖の3ボリュームを追加します。</李>
- 図3に示すように、1.8 Mの分数の上にそれぞれのショ糖液をロ ードすることによってSW41Tiの超遠心管中のショ糖勾配を準備します。
- ベックマンSW41Tiローターを用いて18時間、4℃で25万×gでサンプルを遠心分離する。
- 慎重に0.15 M/1.4 Mスクロースの界面で乳白色のリングのような目に見えるかもしれ低密度バンドのかく乱を避けるために、ロータから超遠心管を取り外します。時々、何も見られないが、端数はまだ洗剤耐性タンパク質画分が含まれています。
- 勾配の上部から0.75ミリリットルの体積の割合を削除します。相間環および以下0.5ミリリットル上述約1.5 mlの容量をカバーする画分2および3は、界面活性剤耐性膜画分を表す。 15ミリリットルファルコンチューブにこれらの画分を集める。画分9および10は、界面活性剤可溶性膜画分を含有し、また比較のために収集することができる。さらに分析、プールFRACT用イオン2と3だけでなく、画分9と10。
4。メタノール/クロロホルムによる洗浄剤抵抗性画分からのタンパク質の抽出
注：すべての操作は室温で行われる。
- 徹底的に集めた画と渦にメタノール4ボリュームを追加します。
- クロロホルムの1ボリュームを追加し、ボルテックス徹底的に。
- よく水の3容量、渦を追加します。
- 卓上遠心機（ 例えばエッペンドルフ5417R）を使用して、5分間2000×gでサンプルを遠心分離する。
- 間期におけるタンパク質層上の水相を除去します。
- 徹底的にメタノール3容量、渦を追加します。
- 10分間4000×gでサンプルを遠心分離する。
- 上清を除去し、ペレットを乾燥させます。乾燥したペレットを溶液内消化の準備ができている。
5。溶液内トリプシン消化
注：この手順のすべてのステップがで行われている変性剤によってアミノ酸側鎖の望ましくない誘導体化を低減するため、室温。
- 6 M尿素、2 Mのチオウレア、pHは8（UTU）少量の試料を溶解する。サンプル（通常は約40μL）と互換性があると低く、ボリュームを使用してください。
- スピン試料は、不溶性物質をペレット化し、10分間ベンチトップ遠心分離機（ 例えばエッペンドルフ5417R）で5000×gでUTUに可溶化。
- 最終的な溶液のpHは、最適なトリプシン消化のために8.0の近くにある必要があります。 pHのストリップに確認してください。
- サンプルタンパク質の各50μgの還元のための緩衝液1μlを加え、室温で30分間インキュベートする。
注：タンパク質含有量のわずか概算が必要です。サンプル量が限られているとき、それはむしろタンパク質アッセイで試料を無駄にするよりも、精度を犠牲にした方がよい。
- すべての50μgのサンプルタンパク質のアルキル化バッファの1μl加え、暗所で室温で20分間インキュベート。
- 50μgのサンプルのタンパク質あたりのLysCの0.5μLを加え、定数は700 rpmで振とうしながら室温で3時間インキュベートする。必要であれば、ダイジェストはまた、一晩行うことができる。しかし、暖かい温度での延長時間は、それが原因で、水性pH 8の条件下でプラスチック管材料への吸着へのペプチドの損失を増加させることができるように推奨されていません。
- 4容量の10mMトリス-HCl、pH8で試料を希釈。
注：この手順は、トリプシンが高い塩に非常に敏感であるように尿素濃度を希釈するために絶対に必要です。
- 50μgのサンプルタンパク質あたりのトリプシンの1μLを加え、定数は700 rpmで振とうしながら室温で一晩インキュベートする。
- （2％トリフルオロ酢酸の約1/10容量の追加）をpHが2に到達するために、0.2％TFAの最終濃度にサンプルを酸性化する。
注：サンプルで保存することができます - さらに使用20℃になるまで、それを保管することをお勧めします4℃でStageTips上に、短時間（1週間）のためのものか、StageTips脱塩後にそれらを格納する場合。
6。 C 18 - StageTipsの製造
- このような使い捨てのプラスチックシャーレなどの平らで清潔な面にEMPOREディスクC18を配置します。
- 直径1.5mmの鈍先端が皮下注射針を使用して、小さなディスクを打ち抜く。ニードルのディスクスティック、ピペットチップに導入することができる。
- 針からディスクを押して、溶融シリカまたは針の内部のフィッティングチューブの一片によってピペットチップの先細りで固定します。
注：StageTipsは、室温21で乾燥保存することができます。
7。ペプチドの脱塩および濃縮のためのC 18-StageTipsの使用
- 準備StageTip上にB液を50μlを配置することにより、C 18-StageTipを条件付ける。ベンチトップCで2分間2,000 rpmで遠心分離器で先端を回転entrifuge（ 例えばエッペンドルフ5417R）。
NOTE：エッペンドルフ遠心機でStageTipsスピン使用するアダプタ液を2ml反応管に収集することができる。大規模調製のために、ステージのヒントはまた、200μlの先端96とチップラック内に配置することができ、液体は、マイクロタイタープレートに回収することができる。
注：原因先端からC 18のディスクをスピンアウトするリスクに卓上遠心機（ 例えばエッペンドルフ5417R）における3000 XGよりも高い速度を使用しないでください。
- 卓上遠心機（ 例えばエッペンドルフ5417R）で5000×gで遠心分離器で先端を回し100μlの溶液Aを使用してStageTipを平衡化させます。
- 手順2を繰り返します。
- 慎重に内部のディスクをピペットチップにサンプルをピペッティングすることにより、ディスクへの負荷サンプル。
注：1ディスクには、約バインドすることができます。 100μgのタンパク質。
- CEでのヒントを紡ぐntrifugeサンプル全体の体積は、C 18のディスクを通過するまで。
- 溶液A100μlを遠心分離器で先端を回してStageTipsを2回洗浄する。
注：洗浄し、ロードされたStageTipsは週まで4℃で保存することができます。
- 新しい1.5ml反応チューブ内の溶出液を回収し溶液B40μlのサンプルを溶出。
- スピードバックでサンプルを濃縮。左わずか約1又は2μlの液体が存在するように理想的な条件下で、脱水プロセスを停止する。
NOTE：乾燥サンプルは、年間、-80℃で保存することができる。
- サンプルに再懸濁溶液を9μLの最終容量を追加し、質量スペクトル分析のためのマイクロタイタープレートに移す。
注記：使用済みの再懸濁緩衝液の最終容量は実験者のニーズや質量分析計の感度に依存する使用。
8。リン酸化ペプチド濃縮のための代替プロトコル
注：リン酸化ペプチドの濃縮には、ステップ2でタンパク質抽出は、ホスファターゼ阻害剤の存在下で行わなければなりません。
注：正確なタンパク質濃度は、以下の工程のために決定される必要はない。これは、不必要なサンプルの損失を回避するために、タンパク質含有量の概算を有することが十分である
- C 8-StageTipsを（ステップ6で、C 18-StageTipsの製造のための同じプロトコルに従って）準備します。
- 準備されたC 8-StageTipsの先頭に転送TiO 2をビーズ1mgの（100μgのタンパク質あたりの使用1mgのTiO 2）を 。
- 溶液Cを100μl、卓上遠心機（ 例えばエッペンドルフ5417R）中で5分間2000×gでスピンしてTiO 2をヒントを平衡化させます。
- （それは溶液100μlにする必要がありますステップ7.7から消化し、脱塩したペプチド100μgのを混ぜるB）溶液A100μlの
- 1,000×gで、5分でスピン、平衡化したTiO 2カラムに混合試料をロードします。
- フロースルーを収集し、（第二のパスの後に通る流れを維持する）再度同じチップ上にロードします。
- A液100μlで先端を洗浄し、2000×gでスピン、卓上遠心機（ 例えばエッペンドルフ5417R）で5分間。
- 5％アンモニア50μlのサンプルを溶出。
- 5％のピペリジン（両方の溶出物を組み合わせることができます）50μlのサンプルを溶出。
- すぐに20％リン酸を50μLを使用してサンプルを酸性化する。 pHは約2である必要があります。
注：TiO 2のヒントを保存し、粉末を取得します。これは、溶液Bで洗浄し、1つまたは2つ以上のラウンドのために再度使用することができる。
- 再びC 18のヒント（ステップ8を参照）上で酸性化した試料を脱塩。
9。ペプチド混合物のLC-MS/MS分析
- 脱塩ホスホンを再懸濁再懸濁緩衝液中でopeptides。
- 負荷は、選択したLC-MS/MSシステムにサンプルを再懸濁し、半値60,000全幅の推奨解像度でデータ依存モードのスペクトルを取得する。
注：多段活性化23ニュートラルロススキャンが22を適用する必要があるのどちらか、最適な断片化のため、または利用可能な場合。 ETDが利用可能な場合には、リン酸24を失うことなく、ペプチド骨格の断片化を可能にする。
注：生データからピークリストを抽出し、データベースの識別にだけでなく、定量のために提出される必要がある。ここでは、マスコットとLTQ、LTQ-オービトラップおよびLTQ-FT器（サーモサイエンティフィック）からの生データファイルのために働くMSQuantを使用するための設定について説明します。
- MSQuantの「ヘルパー」メニュー内DTAsuperchargeを使用してピークリストを抽出します。デフォルト設定を使用してください。
- Mascot検索エンジンにピークリストファイルを結果として提出してください。 CRitical設定：質量許容10ppmのイオン前駆体、MS / MS質量許容度0.5ダ。固定の修正：システインのカルバミドメチル化、変数の変更：メチオニンの酸化、セリンのリン酸化、スレオニン、チロシン。定量法：15 N代謝ラベリング。
- ウェブ·ページ·ファイルとしてマスコット結果を保存します。
- MSQuantにマスコット結果ファイルとRAWファイルをロードします。興味のある全てのタンパク質を選択し、「自動定量」を実行します。プログラムは、RAWファイルからフルスキャンスペクトルを読み、各ペプチドの標識され、標識されていないパートナーのためのピークの統合を行います。
- スプレッドシートプログラムまたはタブ区切りのテキストファイルにエクスポート定量結果。データは、次にExcelでさらなる統計分析にかけ、又はStatquant 25または26クラッカーなどのさらなるソフトウェアパッケージを使用してすることができる。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
代謝的に標識されたシロイヌナズナの細胞培養物を使用して提示プロトコルでは、植物組織（ステップ2は、2および図4）から、原形質膜を分離し、原形質膜内の界面活性剤耐性膜画分を濃縮することができる（ステップ3,3および図5）。その後、プロトコルは、これらの界面活性剤耐性膜画分（ステップ4）からのタンパク質の抽出、比較プロテオーム解析（ステップ5）のためのタンパク質の消化を可能にする。最後に、リン酸化ペプチド（ステップ8）のオプションの濃縮は、細胞シグナル伝達過程を研究する上で特に興味深い。最後のステップは、標識し、非標識細胞培養由来の膜画分中のタンパク質存在比の定量的データ分析（ステップ9、 図6）である。
2相系（ステップ2）、およびその後の遠心分離混合後の典型的な結果は、明確な色の上相とある緑は下相（ 図2）色。緑の葉緑体や他の内部の膜から膜小胞が低いデキストラン相に取り込まれている間に原形質膜小胞は、優先的に、上方のPEG相に関連付ける。色分離を観察することができない場合、ステップ2が正しく行われておらず、原形質膜は、膜内部のかなりの量で汚染されるであろう。原形質膜タンパク質の濃縮は、二相系の下相における形質膜画分およびタンパク質の少量のアリコートのプロテオミクス分析によって示すことができる。下相は、細胞の内膜が含まれています。例えば、このような受容体キナーゼタンパク質として特に代表的な既知の原形質膜タンパク質は、原形質膜画分（PM）および内膜（IM）を含有する下相画分（ 図4A）における低存在量で高い存在量を示した。高小胞体ショーのターンでは、既知のタンパク質内膜画分における存在量とは、原形質膜画分（ 図4B）においては観察されなかった。
界面活性剤耐性膜画分（工程3）のその後の濃縮は、理想的なケースでは、チューブの高さの略1/5 番目 （ 図3）低密度膜小胞の乳白色のリングの形成をもたらすであろう。タンパク質比（ステップ3.2）にトリトンX-100の濃度または界面活性剤の調整は、界面活性剤耐性および界面活性剤の可溶性画分への分離のために最適である場合には、追加の環は、勾配の下部において観察することができ、また、膜の塊が存在する低密度帯で。これらの場合において、タンパク質比又は合計の洗剤量に対する界面活性剤は、2つの膜ドメイン画分の再現可能な分離に必要な臨界ミセル濃度とは異なる。ここで説明するタンパク質比、のENRに最終的な界面活性剤濃度と洗剤を使用して例えばremorin（AT3G61260）27のような典型的なミクロドメインタンパク質のichmentはDRM画分の比較質量分析、洗浄剤可溶性画分（ステップ3.8）ならびに未分画血漿膜および内膜により確認することができた。 （ 図6A）、予想通りremorinタンパク質の最も高い存在量は、DRM画分に認められた。このようなABCトランスポーターAT1G59870（ 図6B）のような膜マイクロドメインには存在しないタンパク質は、DRM画分中の存在量の増加を示していない。最小量が可能であるが、また60Sリボソーム（ 図6D）からのATPアーゼF0複合体（ 図6C）とリボソームタンパク質（At1G001100）からこのようなミトコンドリアタンパク質（AT2G07707）のような典型的な汚染物質は、DRM画分が濃縮された豊かさを表示しないまだ特定され。
血漿中のタンパク質のリン酸化状態の質量分析の後、タンパク質存在量比標識及び非標識細胞培養物の膜画分を定量的に（ 図6）を区別することができる。 MSQuant（からの典型的な結果msquant.alwaysdata.net ）定量ウィンドウが同定されたペプチド（ 図6A）のほとんどのための一から一のイオン強度比を示すべきである。イオン強度比が著しく1:1逸脱有するそれらのペプチドは、差動標識および非標識細胞培養の間に調節されるよう考えられており、（ 図6C）適用される処理によって影響を受けたタンパク質へのマッチングの候補であるている。成功した代謝標識の良好な品質管理の共溶出で標識し、 図6BおよびDナノ-HPLC分離（ステップ9）での単一ピークとして非標識ペプチドのバージョンを示すように、両方。
図1。完全に代謝標識し、非標識シロイヌナズナ培養細胞を用いた実験デザインには2種類の代謝標識実験戦略。模式図。実験者は、生物学的処理、あるいはその逆を受けるコントロールおよび15 N細胞（代謝標識）として14 Nのセル（ラベル）を使用することを決定するか。相反実験計画では、両方の変異体は、並行して行われる。
図2。葉緑体および他の内部の膜がボットに関連付けられている間、ポリエチレングリコール（PEG）およびデキストランに基づく水性二相系のプラント膜小胞を分離するためのワークフローは、血漿膜小胞は、上部PEG相に分離遠心分離後のOMデキストラン相。上相をさらに洗浄して良好な精製を達成することができるだけでなく、材料のロスが大きくなる。
図3。低密度膜画分を濃縮する。低密度界面活性剤耐性膜画分の濃縮のためのショ糖勾配の表現。低密度膜小胞バンドの晩遠心分離後の期待される場所が示されている。
図4。二相系での精製後の血漿膜タンパク質を濃縮する。正規化原形質膜（PM）及び内膜（IM）画分で測定したタンパク質についてのタンパク質イオン強度（A）原形質膜の典型的な公知の構成要素は、IM画分におけるよりもPM画分中のより高い存在量を示す。内膜の（B）ナチュラル公知の成分逆の挙動を示している。正規化のために、各タンパク質のイオン強度和は、サンプルあたりの総イオン強度の割合として表した、その後の反復の間に平均した。総イオン強度の画分は、その後、二つの治療の間の平均相対として表した。エラーバーは、独立して成長した細胞培養から3調剤の標準偏差を表す。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。
図5。 。測定された画分中の標準的なタンパク質マーカーの存在量は、プロットは、特定の細胞内コンパートメントに選ばタンパク質マーカー（ -ステロールが豊富なマイクロドメイン、PM -細胞質膜、IM -内膜、SP -可溶性タンパク質DRM）の正規化されたタンパク質イオン強度の分布を表す。 （A）remorinステロールが豊富な膜マイクロドメインのためのマーカーとして、（B）の ABC型輸送体ファミリータンパク質ステロール依存しないタンパク質の代表として、（C）は 、ミトコンドリアF0複合体のサブユニット、（D）60Sの存在パターン典型的な同時精製汚染物質としてのリボソームのサブユニット。正規化のために、各タンパク質のイオン強度和は、サンプルあたりの総イオン強度の割合として表した、その後の反復の間に平均した。全イオン強度の割合は、その後2トリートメントルーム、間の平均の相対で表したtments。エラーバーは、独立して成長した細胞培養から3調剤の標準偏差を表す。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。
図6。ペプチドDNNLLGKの定量的タンパク質質量分析の期待される結果。ラベルおよび非標識シロイヌナズナ細胞からのタンパク質抽出物の1:1混合物からのペプチドの予測される1時01分、イオン強度比を示すMSQuantからのスクリーンショット。（A）のフルスキャンスペクトルを明確にラベルされた（右ピーク）およびm / z軸に対するペプチドの標識されていない（左ピーク）のバージョンを分離。モノアイソトピック質量と第同位体は青色のマークで示されている。（B）標識（青）ANペプチドの共溶出のdの非標識（赤色）のバージョン単一ピークとしてナノ-HPLCクロマトグラフィーの間。示差的に調節されたタンパク質の候補として1:5のイオン強度比を有するペプチドの（C）フルスキャンスペクトル（D逆相クロマトグラフィー1:1共溶出とは異なる比で）、タンパク質。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
本論文で提示プロトコルは、多くのステップが含まれており、それらのすべては、洗剤耐性膜と洗剤の可溶性画分に植物細胞膜の純粋で代表画を得ることが重要である。したがって、指示に従って、各ステップに従うことが重要である。
非イオン性界面活性剤（ステップ3.2）を用いて原形質膜画分の処理は、膜マイクロドメイン分別の品質に最も強い影響を有する。異なる製剤間で再現性のある結果を得るために、同じ実験からの異なるサンプルを比較することができるように、それが正確に原形質膜中のタンパク質の濃度を評価し、タンパク質含有量に対して同じ比で常に清浄剤を適用することが非常に重要である常に同じ最終濃度まで。実際に、それは時々、高いタンパク質濃度を有する試料を希釈する、または異なる濃度のストックを使用する必要があることを意味トリトンX-100の。
生化学的研究では、最近、膜マイクロドメイン28〜30の単離のために界面活性剤を含まない方法を使用する研究者の間で傾向があった。これらの方法は、フレンチ圧力セルプレスと同様に非常に小さな針を通して剪断により原形質膜の機械的破壊に基づいている。これらの手順は、正常膜マイクロドメインの豊富な哺乳動物細胞培養物に適用したが、生物（酵母、植物細胞）を含む細胞壁への応用が報告されていない。例えば、メチル-β-シクロデキストリンのようなステロール破壊剤と共に定量的プロテオミクスを用いて、それが植物原形質膜から調製されたDRM画分は、膜ミクロドメイン11のマーカーであるタンパク質を含まないことが示された。
質量分析定量化の最終的な結果について、 図6に示す典型的な結果では、理想的な状況を表すどのラベルおよび非標識ペプチドの大多数のためのイオン強度は同じに近い。しかし、場合によって標識し、非標識細胞培養物のセット間の生物学的変動のある程度を観察することができる。従って、標識および非標識対照細胞の混合物の標識又は非標識細胞培養が行われ、分析のいずれかの生物学的処理の前に、両方の任意の処理なしに、一つの状況に理想的なものからの発散比を有するペプチドの同定を可能にする。発散比でこれらのタンパク質は、生物学的変動の適応である。生物学的変動から区別する治療効果の課題を克服するために、我々は、したがって、対になった実験20で往復標識を使用することを提案する。逆数実験では、実験の両方の変異体は、図1に提案されているように実行され、説明されているように、プロトコルのステップが続く。そして、pは、イオン強度比を比較するイオン強度比の違いは生物学的変動、または適用される処理の効果とによるものである場合には逆数の実験の両方からroteins、人は区別することができる。
治療効果および生物学的変動とを区別する問題に対処するための別の方法は、全ての処理31の基準となる内部標識された標準の使用である。そのアプローチでは、非標識コントロールおよび生物学的治療を受ける非標識細胞は、同じバッチからの、重標識された対照細胞の同量と混合する。それは14 N-コントロール/ 15 N-対照および14 N-治療/ 15 N-コントロールのイオン強度比が著しく異なる場合、タンパク質は、有意であると見なされるため、ペプチド比に生物学的変動の影響を排除することができる。標識された標準は、全ての場合において正確に同じであるので、これは可能である。
DRの一つここで説明するDRMの濃縮手順のawbacks洗剤耐性膜画分に同定することができる同時精製タンパク質である。低密度界面活性剤耐性膜画分から同定されたタンパク質のリストでは、定期的にリボソームタンパク質を大量に観察することができます。によるリボソームタンパク質の比較的低い密度のために、それらは、ショ糖勾配におけるステロール依存性膜タンパク質として同じ画分に移行する。それは、リボソームタンパク質は明らかに膜マイクロドメイン11の構成成分ではないことを疑問なしで示された。これらの界面活性剤耐性、実際に低密度膜画分に関連付けられていない他の同時精製タンパク質を排除するために、我々は、2から下部デキストラン相から抽出することができる細胞内膜（IM）のプロテオミクス組成を分析することを提案相系と内膜とDRM間の推定される汚染物質の存在比を比較する画分（ 図5の例を参照してください）。 DRMで同時精製タンパク質は、両方の画分（IMおよびDRM）で同様の存在量を持つべきである。
細胞抽出物および膜マイクロドメインの分別は、プロテオーム解析のための32サンプル中の複雑さを低減する一般的な戦略である。したがって、ここで説明するプロトコルは、植物細胞の形質膜でシグナリングプロセスの全ての研究に有用である。生物学的用途は大幅に膜タンパク質14,15の原形質膜組成および変更の変化を誘発し、すべてのストレス反応だけでなく、病原体感染を研究している。ストレス反応を研究に加えて、別の膜画分中のタンパク質の存在量の定量が大幅に未知のタンパク質33 34,35の注釈を支援することができる。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
著者、ヴィトルドスジーマンスキーは分子植物生理学のマックスプランク研究所の従業員である。著者は、ラウドシュルツはホーエンハイム大学、ドイツの従業員である。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Chemicals were ordered from Sigma-Aldrich unless noted otherwise | |||
| Ammonia (stock 25 % solution) | WAKO | 010-03166 | |
| TiO2 10 μm | GL-Science | 5020-75010 | |
| Empore Disk C18 | Varian | 12145004 | |
| Polyethylene glycol(PEG 3350) | Sigma | 88276 | |
| Dextran T500 | Roth | 9219.2 | |
| Trypsin | Promega | V5113 | |
| Protease inhibitor cocktail (PIC) | Sigma | P9599 | |
| K15NO3 | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-765-PK | |
| EQUIPMENT | |||
| Optima L-80 XP Ultracentrifuge | Beckman | ||
| Plate reader | BioTek | ||
| EASY-nLC II nano-Liquid Chromatograph | Thermo Scientific | ||
| LTQ-Orbitrap mass spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| Centrifuge 5417R | Eppendorf | ||
| Thermomixer | Eppendorf | ||
| Speed Vac RVC 2-25 | Christ | ||
| Shaker Unimax 2010 | Heidolph | ||
References
- Alexandersson, E., Saalbach, G., Larsson, C., Kjellbom, P. Arabidopsis plasma membrane proteomics identifies components of transport, signal transduction and membrane trafficking. Plant Cell Physiol. 45, 1543-1556 (2004).
- Brown, D. A., Rose, J. K. Sorting of GPI-anchored proteins to glycolipid-enriched membrane subdomains during transport to the apical cell surface. Cell. 68, 533-544 (1992).
- Lanquar, V., et al. 15N-metabolic labeling for comparative plasma membrane proteomics in Arabidopsis cells. Proteomics. 7, 750-754 (2007).
- Kierszniowska, S., Walther, D., Schulze, W. X. Ratio-dependent significance thresholds in reciprocal 15N-labeling experiments as a robust tool in detection candidate proteins responding to biological treatment. Proteomics. 9, 1916-1924 (2009).
- Singer, S. J., Nicolson, G. L. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science. 175, 720-731 (1972).
- Simons, K., Ikonen, E. Functional rafts in cell membranes. Nature. 387, 569-5672 (1997).
- Baumgart, T., et al. Large-scale fluid/fluid phase separation of proteins and lipids in giant plasma membrane vesicles. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 3165-3170 (2007).
- Silvius, J. R. Partitioning of membrane molecules between raft-and non raft-domains: insights from model membrane studies. Biochim. Biophys. Acta. 1746, 193-202 (2005).
- Tanner, W., Malinsky, J., Opekarova, M. In plant and animal cells, detergent-resistant membranes do not define functional membrane rafts. Plant Cell. , (2011).
- Lauwers, E., Andre, B. Association of yeast transporters with detergent-resistant membranes correlates with their cell-surface location. Traffic. 7, 1-15 (2006).
- Kierszniowska, S., Seiwert, B., Schulze, W. X. Definition of Arabidopsis sterol-rich membrane microdomains by differential treatment with methyl-ß-cyclodextrin and quantitative proteomics. Mol. Cell. Proteomics. 8, 612-623 (2009).
- Simons, K., Toomre, D. Lipid rafts and signal transduction. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, 31-39 (2000).
- Maeda, Y., Kinoshita, T. Structural remodeling, trafficking and functions of glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins. Prog. Lipid Res. 50, (2011).
- Keinath, N. F., et al. PAMP-induced changes in plasma membrane compartmentalization reveal novel components of plant immunity. J. Biol. Chem. 285, 39140-39149 (2010).
- Stanislas, T., et al. Quantitative proteomics reveals a dynamic association of proteins to detergent resistant membranes upon elicitor signaling in tobacco. Mol. Cell. Proteomics. 8, 2186-2198 (2009).
- Minami, A., et al. Alterations in detergent-resistant plasma membrane microdomains in Arabidopsis thaliana during cold acclimation. Plant Cell Physiol. 50, 341-359 (2008).
- Pauly, M., Eberhard, S., Albersheim, P., Darvill, A., York, W. S. Effects of the mur1 mutation on xyloglucans produced by suspension-cultured Arabidopsis thaliana cells. Planta. 214, 67-74 (2001).
- Jouanneau, J. P., Peaud-Lenoel, C. Growth and synthesis of proteins in cell suspensions of a kinetin dependent tobacco. Physiol. Plant. 20, 834-850 (1967).
- Engelsberger, W. R., Erban, A., Kopka, J., Schulze, W. X. Metabolic labeling of plant cell cultures with K15NO3 as a tool for quantitative analysis of proteins and metabolites. Plant Methods. 2, 1-11 (2006).
- Arsova, B., Kierszniowska, S., Schulze, W. X. The use of heavy nitrogen in quantitative proteomics experiments in plants. Trends Plant Sci. 17, 102-112 (2012).
- Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. Stop And Go Extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics. Anal. Chem. 75, 663-670 (2003).
- Olsen, J. V., Macek, B. High accuracy mass spectrometry in large-scale analysis of protein phosphorylation. Methods Mol. Biol. 492, 131-142 (2009).
- Schroeder, M. J., Shabanowitz, J., Schwartz, J. C., Hunt, D. F., Coon, J. J. A neutral loss activation method for improved phosphopeptide sequence analysis by quadrupole ion trap mass spectrometry. Anal. Chem. 76, 3590-3598 (2004).
- Frese, C. K., et al. Improved peptide identification by targeted fragmentation using CID, HCD and ETD on an LTQ-Orbitrap Velos. Journal of Protrome Research. 10, 2377-2388 (2011).
- van Breukelen, B., vanden Toorn, H. W., Drugan, M. M., Heck, A. J. StatQuant: a post-quantification analysis toolbox for improving quantitative mass spectrometry. Bioinformatics. 25, 1472-1473 (2009).
- Zauber, H., Schulze, W. X. Proteomics wants cRacker: Automated standardized data analysis of LC/MS derived proteomic data. J. Proteome Res. 11, 5548-5555 (2012).
- Raffaele, S., Mongrand, S., Gamas, P., Niebel, A., Ott, T. Genome-wide annotation of remorins, a plant-specific protein family: Evolutionary and functional perspectives. Plant Physiol. 145, 593-600 (2007).
- Shah, M. B., Sehgal, P. B. Nondetergent isolation of rafts. Methods Mol. Biol. 398, 21-28 (2007).
- Persaud-Sawin, D. -A., Lightcap, S., Harry, G. J. Isolation of rafts from mouse brain tissue by a detergent-free method. Journal of Lipid Research. 50, 759-767 (2009).
- Macdonald, L. J., Pike, L. J. A simplified method for the preparation of detergent-free lipid rafts. Journal of Lipid Research. 46, 1061-1067 (2005).
- Mühlhaus, T., Weiss, J., Hemme, D., Sommer, F., Schroda, M. Quantitative shotgun proteomics using a uniform 15N-labeled standard to monitor proteome dynamics in time course experiments reveals new insights into the heat stress response of Chlamydomonas reinhardtii. Mol. Cell. Proteomics. 10, M110.004739 (2011).
- Schulze, W., Usadel, B. Quantitation in mass-spectrometry-based proteomics. Annu. Rev. Plant Biol. 61, 491-516 (2010).
- Foster, L. J., de Hoog, C., Mann, M. Unbiased quantiative proteomics of lipid rafts reveales high specificity for signaling factors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 5813-5818 (2003).
- Lilley, K. S., Dupree, P. Plant organelle proteomics. Curr. Opin. Plant Biol. 10, 594-599 (2007).
- Sadowski, P. G., Groen, A. J., Dupree, P., Lilley, K. S. Sub-cellular localization of membrane proteins. Proteomics. 8, 3991-4011 (2008).
