Summary
여기에서 우리는 완전히 15 N 표시 애기 장대 세포 배양 레이블의 혼합물에 따라 세제 저항하고 세제 용해 막에 식물 세포막의 분별과 생체 내에서 강력한 방법을 설명합니다. 절차는 시그널링 프로세스를 이해하기 위해, 비교 단백체 연구에 적용된다.
Abstract
세포막 마이크로 도메인은 지질 및 스테롤 환경의 물리적 특성에 기초하여 기능하고 신호 전달 프로세스에서 특정 역할이있다. 프로테옴 분석을 위해 식물 세포에서 스테롤이 풍부한 막 마이크로 도메인을 추출하면 여러 준비 단계 및 다른 세포 구획에서의 오염 물질에 대한 소스에 주로 어려운 작업입니다. 세포막은 식물 세포에있는 멤브레인의 단지 대략 5-20 %에 구성하고, 따라서 고순도 세포막 분획의 분리 도전적이다. 자주 사용하는 방법은 95 % (1)의 순도 세포막 소포를 산출 폴리에틸렌 글리콜 및 덱스 트란의 수성 두 단계의 분할을 포함한다. 세포막 내 스테롤이 풍부한 막 마이크로 도메인은 알칼리 pH에서 차가운 비 이온 계 계면 활성제 치료에 불용성이다. 이 세제 저항 막 분획은 초 원심 분리에 의해 대량 세포막으로부터 분리 될 수있다ucrose 그라데이션 2. 이어서, 단백질은 메탄올 / 클로로포름 침전 자당 구배 저밀도 대역으로부터 추출 될 수있다. 추출 된 단백질은 소화 탈염 마지막 LC-MS/MS 분석 트립신됩니다. 스테롤이 풍부한 마이크로 도메인에 대한 우리의 추출 프로토콜은 애기 장대의 세포 배양에서 청소 세제 저항 막 분수의 준비를 위해 최적화되어 있습니다.
우리는 또한 3의 생물학적 처리 다음과 같은 정량적 인 비교 프로테오믹스 연구를위한 유일한 질소원으로 K 15 NO 3와 애기 장대 서스펜션 세포 배양의 전체 신진 대사 라벨을 사용합니다. 조인트 단백질 추출을위한 표지 및 표지되지 않은 세포 배양의 동등한 비율을 혼합하여 최종 정량 결과의 준비 단계의 영향은 최소로 유지된다. 또한 추출 중 물질의 손실은 제어와 같은 방법으로 처리 샘플 모두에 영향을 미칠 것이다D 따라서 빛과 올림 펩타이드의 비율이 일정하게 유지됩니다. 제안 된 방법으로 표시하거나 다른 컨트롤 4 역할을하면서 레이블이없는 세포 배양은 생물학적 처리를 거쳐 하나.
Introduction
1972 년, 조나단 가수와 거스 니콜슨은 일반적으로 1960 년대 초에 허용 된 단백질 지질 단백질 샌드위치 모델을 교체, 유체 모자이크 모델에게 세포막의 구조 모델을 제안했다. 가수 니콜슨은 생체막 모든 지질 및 단백질 분자는 자유롭게하고 쉽게 확산 5 이차원 액체로서 고려 될 수 있음을 가정했다. 그때 이후로, 막 조성의 세포막 및 지식의 구조 모델은 더 복잡하게되었다. 특히, 세포막 내에 그러한 단백질 복합체 및 지질 / 스테롤 기반 구조적 무질서 같은 마이크로 도메인 구조를 관찰 할 수있다. 인공 모델 막을 6,7에서 스테롤과 스핑 고리 피드 가로 방향으로 변형 된 신체 기능과 영역을 형성하기 위해 다른 지질 종에서 분리 할 수 있습니다. 세포막 내에서이 분리는 주로 스테롤 높은 SA의 자기 연관 특성에 의해 발생합니다phopsho 및 스핑 고지 8 turated 탄화수소 사슬. 특히, 강성 스테롤 반지 엄격한 및 똑바로 포화 지질 종과 이들의 상호 작용이 막 두께와 경도를 증가, 더 확장 된 입체 형태로 이웃 탄화수소 사슬을 강제로와의 상호 작용을 선호.
스테롤이 풍부한 막 마이크로 도메인의 일반적으로 관찰 된 기능 중 하나는 비 이온 계면 활성제 등의 트리톤 (Triton) X-100 BRIJ (35) 치료에 따라 자신의 불용성했다. 이 분획을 막 마이크로 도메인과 동일한 것으로 생각하고, 그들의 생화학 제조 방법 2에 따라 세제 저항 막 (DRM)라고했다. DRM 추출시 비이 온성 세제의 사용은 생화학 DRM 준비가 직접 사는 셀 (9) 내에서 특정 막 칸에 해당하지 않을 수 있으므로 약간의 비판을 받았다. 특히, 단백질의 비율 세제 등 준비에 중요한 것의 다른 세제뿐만 아니라 다른 세제 양의 세제 저항 막 분획 (10)의 다른 구성을 얻을 수 있습니다. 그러나, 특정 단백질의 종류는 특히 이러한 세포 스테롤이 풍부한 막 도메인과 연결하고,이 단백질이 잘 세제 저항 막 분수 (11)의 생화학 적 준비에 충실하는 증거가있다. 식물 DRM 분획에서 발견되었고,의 DRM에 존재 종속 스테롤했다하는 단백질의 핵심은, 이러한 fasciclin 같은 아라 비노 갈 락탄 단백질 (FLAs) 및 SKU 단백질 가족의 일원으로, 특히 GPI-고정 단백질이었다. 또한 수용체 같은 키나제 또는 포스 포 리파제 등 일부 신호 단백질은 11 발견되었다. 이러한 결과는 포유류 막 마이크로 도메인 12,13 많은 프로테오믹스 연구와 일치한다. 또한 식물에 스트레스 반응 (14)의 맥락에서 막 마이크로 도메인의 역할에 대한 증거가 증가하고있다 -16.
여기에 설명 된 프로토콜은 세포막 분획의 마이크로 도메인을위한 강력한 방법을 제공하고, 특히주세요 스테롤 풍부한 세포막 구획 4,11,14의 스트레스 유도 변화를 묘사 할 수의 세제 농도의 단백질을 사용한다.
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Protocol
절차
추출 프로토콜에서 사용되는 일반적인 시약 및 버퍼 :
- 애기 장대 서스펜션 세포 배양에 대한 JPL 매체
- 3 μM의 H 3 BO 3
- 3 μM MnSO 4 개의 x H 2 O
- 1.1 μM ZnSO 4 × 7 H 2 O
- 0.15 μM의 KJ
- 0.03 μM 나 2 무 4 × 2 H 2 O
- 3 nm의의 CoCl2 x 6 H 2 O
- 3 nm의 CuSO 4 × 5 H 2 O
- 0.9 mM의 염화칼슘 2 × 2 H 2 O
- 0.5 ㎜ 망초 X 7 H 2 O
- 0.5 μM FeSO 4 × 7 H 2 O
- 0.5 μM 2 EDTA × 2 H 나 2 O
- 0.12 μM 티아민 염산
- 0.16 μM 니코틴산
- 0.097 μM의 리드 키신 염산
- 0.107 μM의 NAA
- 0.375 밀리미터 KH 2 PO 4
- 0.061 밀리미터의 NaH2 PO 4 × 2 H 2 O
- 0.039 밀리미터 나 2 HPO 4
- 0.027 mM의 글리신
- 0.56 mM의 미오 이노시톨
- 1.5 % 자당
- 10 mM의 K 14 NO 3 또는 10 mM의 K 15 NO 3
참고 : JPL 매체의 pH가 KOH와 5.7로 조정해야합니다. 매체는 여과 또는 고압 증기 멸균에 사용하기 전에 소독해야합니다.
- 버퍼 H
- 100 mM의 HEPES-KOH (산도 7.5)
- 250 ㎜ 자당
- 10 % (w / v) 글리세롤
- 5 mM의 EDTA
- 아스코르브 산 5mM
- 0.6 % (w / v)의 PVP K-25 K-30
- 5 mM의 DTT (신선한 추가)
- 1 ㎜ PMSF (신선한 추가)
- 단백질 분해 효소와 인산 가수 분해 효소 억제제 (신선한 추가)
- 50 mM의 불화 나트륨
- 1 ㎜ 나 3 VO 4
- 1 ㎜ benzamidin
- 0.3 μM mikrocystin
- 4 μM의 류 펩틴
- 프로테아제 억제제 칵테일
- 버퍼 R
- 5 mM의 인산 칼륨
- 0.33 M 자당
- 3 밀리미터의 KCl
- 0.1 mM의 EDTA
- 1 mM의 DTT (신선한 추가)
- 버퍼 TNE
- 25 mM 트리스-HCl, pH7.5
- 150 mM의 NaCl을
- 5 mM의 EDTA
- 두 개의 상 시스템 (6 G-시스템은 샘플 신선한 무게의 최대 15g에 적합하다) 제조 방법
아래의 15 ML 팔콘 튜브 혼합 재료에 잘 혼합 :- 20 % (w / w) 덱스 트란 T500 - 2.6 g
- 40 % (w / w) 폴리 (에틸렌 글리콜) (PEG 3350) - 1.3 g
- 크로스 - 0.678 g
- 0.2 M 인산 칼륨, pH를 7.8-0.15 ML
- 2 M의 KCl - 0.014 ML
- 2 상 시스템의 총 질량은 6g 때까지 물을 첨가.
- TNE 버퍼 자당 솔루션
- 2.4 M, 1.6 M, 1.4 M, 0.15 M
- 트립신 소화 용 시약
- UTU : 6 M 요소, 2 M 티오 우레아 (10 MM 트리스 - 염산으로 pH 8.0) 감소 버퍼 (물에 1 ㎍ / ㎕의 DTT, 6.5 ㎜)
- 알킬화 버퍼 (물에 5 ㎍ / ㎕의 요오도 아세트 아미드, 27 MM)
- 의 lysC 엔도 펩 티다 제 (0.5 ㎍ / μL)
- 트립신, 수정 시퀀싱 등급 (0.4 ㎍ / μL)
- C 18 세 이상 펩타이드 탈염 용 시약
- 재 부유 용액 : 2 % 트리 플루오로 아세트산 (TFA), 물 중 5 % 아세토 니트릴
- 용액 A : 0.5 % 초산
- 용액 B : 80 % 아세토 니트릴, 0.5 % 초산
- 포스 포 농축을위한 시약
- 해결 방법 : 0.1 % TFA, 5 % 아세토 니트릴
- 솔루션 B : 0.1 % TFA, 80 % 아세토 니트릴
- 티오 2 10 ㎛
- 암모니아 (주식 25 % 용액)
- 피 페리 딘 (주식 100 %)
의정서
1. 애기 장대의 세포 현탁액의 문화 대사 라벨링
- 애기 장대 골 - 0 셀을 성장전체 14 N-JPL 매체에 잎 17에서 파생 된 서스펜션 문화, 80 ~ 100 μmol / m에서 일정한 빛 조건에서 멸균 플라스크에 15 N-JPL 매체와 문화의 한 세트 (18 "일반적인 시약 및 버퍼"절을 참조하십시오) 120 rpm으로 흔들어 일정에 따라 2 초, 23 ° C,.
- 세포 배양을 유지하기 위해, 1 L 플라스크 일곱 일 된 세포 배양의 40 ㎖와 신선한 JPL 배지 400 ㎖를 접종.
- 세포 배양의 수확은 스텐레스 메쉬 넓은 유리 깔때기를 통해 진공 흡인을 통해 발생한다. 세포는 메쉬 접시에와 깔때기에 축적 쉽게 거기에서 수집 할 수 있습니다. 세포를 분쇄하기 전에 -80 ° C에서 액체 질소에 냉동하는 것이 좋습니다.
참고 : 15 N의 경우 대사라는 세포 배양 2 주 19에 적어도 두 구절 질소의 유일한 소스로 K (15) NO 3을 사용합니다. expe을의비교 프로테오믹스에 대한 riments는 15 N 표시된 세포 배양을 사용하고 또한 일반 매체에 레이블이없는 문화를 유지한다. 다른 하나는 (그림 1) 제어 역할을하는 동안 생물학적 처리는 레이블 또는 레이블이없는 하나의 문화에 적용됩니다. 단백질 준비를 위해, 두 문화 (20)을 결합됩니다. 실험 설정을 계획 할 때, 우리는 상호 라벨 같은 처리를 한 번 레이블이없는 세포에 15 N-라는 세포에 한 번 적용되는 설정 (4)와 각각의 레이블이없는 15 N-라는 세포가 컨트롤 역할을 고려하는 것이 좋습니다. 이 경우, 세포 배양의 두 배 금액이 필요합니다.
2. 플라즈마 막 정화
참고 :이 달리 명시하지 않는 한 모든 추가 단계가 냉장실 및 / 또는 얼음에서 실시된다.
- 액체 질소 7 일 이전 세포 현탁액 문화의 약 1 L의 세포를 균질화한다.소재는 더 사용할 때까지 -80 ° C에 저장할 수 있습니다.
- 비커에 신선한 중량을 기준으로 레이블과 레이블이없는 냉동 세포 배양의 같은 양을 혼합 즉시 버퍼 H 2 볼륨을 추가합니다. 막 마이크로 도메인 준비의 경우는 최소 7g에게 두 레이블과 레이블이 지정되지 않은 세포의 신선한 무게를 사용하는 것이 좋습니다.
- 쉐이커에 비커를 넣고 재료가 녹아 용액이 액체와 얼음 결정없이 될 때까지 흔들어.
- 50 ㎖ 원심 분리 튜브에 Miracloth의 한 층을 파쇄를 필터링합니다.
- 8 분 10,000 XG에 버퍼 H 원심 분리기와 균형 샘플.
- 약 32 ㎖의 부피로, 사전 냉각 초 원심 분리기 튜브 (회 전자 베크만 쿨터 SW31Ti에 대한 예를 들어)에 뜨는로드
- 밸런스 버퍼 H와 샘플 및 베크 SW32Ti 로터를 사용하여 30 분 동안 4 ° C에서 10 만 XG에 원심 분리하여 미세 소체 펠렛.
- 원심 분리 후 상층 액을 제거합니다.
참고 : 뜨는는 수용성 단백질이 포함되어 있습니다. 이 분획의 소량은 또한 가용성 단백질의 추가의 단백질 침전 및 후속 분석을 위해 저장 될 수있다.
- 버퍼 R의 각각의 양의 각 샘플의 막 펠렛을 재현 탁하고 U1이 상 시스템의 상부 (도 2) 상에로드. 6g 개의 상 시스템을 사용하는 경우, 재 부유 막 펠릿 정확히 2g로드.
NOTE : 버퍼 R의 최종 부피는 (6g 시스템을 사용할 때 버퍼 R의 1.6 ㎖을 필요 ~)에 사용 예정이 상 시스템의 크기에 달려있다. 그것은 너무 순수 버퍼가 오히려 2 단계 시스템에 전체 샘플을로드 할 수 가용화 너무 많은 버퍼를 사용하지 않고 요구 무게를 얻기 위해 두 단계의 시스템에 추가 할 수있는 재 부상에 대한 작은 버퍼를 사용하는 것이 좋습니다.
- 회 사용으로 순수한 버퍼 R의 동일한 볼륨을로드U2 상에 전자 샘플 재 부상.
- 천천히 그들에게 30 배 (약 1 반전 / 초)를 반전 U1과 U2 튜브를 혼합한다.
참고 : 적극적으로 2 단계 시스템을 흔들지 마십시오. 이 원심 분리 공정에서 상 분리의 부족을 일으킬 수있다.
- 10 분 동안 4 ° C에서 1,500 XG에서 샘플을 원심 분리기.
- 원심 분리 후 상층 액을 제거합니다.
- U2에 U1에서 상위 단계를 전송하고 10 분 동안 4 ° C에서 1,500 XG에서 원심 분리를 반복합니다.
- SW41Ti의 초원 심 분리기 튜브에 U2에서 상위 단계를 이동하고 버퍼 R의 5 권으로 희석하고 철저하게 섞는다.
참고 : 최종 상위 단계는 다섯 배 희석되기 전에 별도의 초원 심 분리기 튜브로 분할해야 할 수 있습니다.
- SW41Ti 로터를 사용하여 한 시간 동안 4 ° C에서 20 만 XG에서 샘플을 원심 분리기.
- 스말에 재현 탁 막 펠렛TNE 버퍼의 L 양 세제 저항 막 분리를 위해 (일반적으로 버퍼 200 μL가 사용됩니다).
주 :이 분획의 소량 분획 원형질막의 분석을 위해 저장 될 수있다.
참고 : 세포막 분획 하룻밤 세제 저항 막 및 세제 용해 분수로 분류하기 전에 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
3. 세제 저항 막 준비
- 브래드 포드 분석에 의해 세포막 분획의 농도를 확인한다.
- 세포막 분획에 트리톤 X-100을 추가. 세제의 최종 농도는 0.5 % 사이에서 유지해야한다. 중량 비율로 단백질 무게 세제는 13 ~ 15 사이에 유지해야합니다.
- 30 분 동안 4 ° C에서 약 100 rpm으로 흔들어 샘플.
- 자당의 1.8 M 최종 농도를 얻기 위해 처리 세포막의 하나의 볼륨에 2.4 M 자당의 세 볼륨을 추가합니다. </ 리>
- (그림 3) 1.8 M 분수의 상단에 각각 자당 솔루션을로드하여 SW41Ti의 초원 심 분리기 튜브에 자당 기울기를 준비합니다.
- 베크 SW41Ti 로터를 사용하여 18 시간 동안 4 ° C에서 25 만 XG에서 샘플을 원심 분리기.
- 조심스럽게 0.15 M/1.4 M의 자당의 인터페이스에서 우유 링으로 볼 수있다 저밀도 밴드의 교란을 방지하기 위해 회 전자에서 초원 심 분리기 튜브를 제거합니다. 때로는 아무 것도 볼 수 없습니다 만, 일부는 여전히 세제 저항하는 단백질 부분이 포함되어 있습니다.
- 그라데이션의 상단에서 825 ml의 볼륨의 일부를 제거합니다. 상간 링 아래 0.5 ㎖ 이상 1.5 ㎖의 주위의 볼륨을 커버 분획 2 및 3은 세제 저항 막 분획을 나타낸다. 15 ML 팔콘 튜브에이 분수를 수집합니다. 분획 15 및 10는 세제 용해 막 분획을 포함하고 또한 비교를 위해 수집 될 수있다. 추가 분석, 풀 Fract에 들어이온 2 및 3뿐만 아니라 분획 (9, 10).
4. 메탄올 / 클로로포름에 의한 세제 저항 분수에서 단백질의 추출
NOTE : 모든 단계가 실온에서 수행된다.
- 철저하게 수집 된 분수와 소용돌이에 메탄올 4 볼륨을 추가합니다.
- 1 클로로포름의 양, 소용돌이 철저를 추가합니다.
- 철저하게 물을 3 권, 소용돌이를 추가합니다.
- 벤치 탑 원심 분리기 (예 : 에펜 도르프 5417R)를 이용하여 5 분 동안 2,000 XG에서 샘플을 원심 분리기.
- 계면에서의 단백질 층 위 수성 단계를 제거합니다.
- 철저하게 메탄올의 전 3 권, 소용돌이를 추가합니다.
- 10 분 동안 4,000 XG에서 샘플을 원심 분리기.
- 상층 액을 제거하고 펠렛을 건조. 건조 된 펠렛의 솔루션이 소화에 대한 준비가되어 있습니다.
5. 의 - 솔루션 트립신 소화
참고 :이 절차의 모든 단계에서 수행합니다변성제에 의해 아미노산 측쇄의 불필요한 유도체를 줄이기 실온.
- 6 M 요소, 2 M의 thiurea, pH가 8 (UTU)의 작은 양의 샘플을 녹입니다. 샘플 (일반적으로 약 40 μL)와 호환되는 최저 볼륨을 사용합니다.
- 불용성 물질을 펠렛 10 분 동안 벤치 탑 원심 분리기 (예 : 에펜 도르프 5417R)에서 5,000 XG에서 UTU에 용해 회전 샘플.
- 최종 용액의 pH는 최적의 트립신 소화 8.0 근처에 있어야한다. 산도 스트립 확인합니다.
- 시료 단백질의 매 50 μg위한 환원 완충액 1 μl를 추가하고 실온에서 30 분간 배양한다.
주 : 단백질 함량 만 대략적인 견적이 필요합니다. 시료의 양이 제한되는 경우에는 오히려 단백질 분석에서 샘플을 낭비보다 정확도를 희생하는 것이 낫다.
- 모든 50 μg 샘플 단백질 알킬화 버퍼 1 μl를 추가하고 어둠 속에서 실온에서 20 분 알을 품다.
- 50 μg 샘플 당 단백질의 lysC의 0.5 μl를 추가하고 상수는 700 rpm에서 진탕하면서 실온에서 3 시간 동안 배양한다. 필요한 경우, 다이제스트로는 밤새 수행 될 수있다. 그러나, 따뜻한 온도에서 확장 된 시간은 그것에 의한 수용액의 pH 8 조건에서 플라스틱 튜브 소재에 흡착 펩타이드 손실을 증가시킬 수 있습니다 사용하지 않는 것이 좋습니다.
- 4 권 10 MM 트리스 - 염산, pH가 8 샘플을 희석.
참고 :이 단계는 트립신, 염분에 매우 민감 같은 요소 농도를 희석하기 위해 절대적으로 필요하다.
- 50 μg 샘플의 단백질 당 트립신 1 μl를 추가하고 상수는 700 rpm에서 진탕하면서 실온에서 밤새 품어.
- 산도 2 (2 % 트리 플루오로 산의 약 1 / 10 볼륨을 추가)에 도달하는 0.2 % TFA 최종 농도 샘플을 산성화.
참고 : 샘플에 저장할 수 있습니다 - 추가 사용 20 ° C까지,하지만 저장하는 것이 더 좋습니다4 ° C에서 StageTips에 그들은 짧은 시간 (1 주) 또는 StageTips 탈염 후 보관됩니다.
6. C 18 StageTips의 제조
- 이러한 일회용 플라스틱 페트리 접시로 평평하고 깨끗한 표면에 Empore 디스크 C18를 놓습니다.
- 1.5 mm의 직경이 무딘 팁 피하 주사 바늘을 사용하여 작은 디스크를 펀치. 디스크가 바늘에 붙어 피펫 팁으로 전송할 수 있습니다.
- 바늘 밖으로 디스크를 밀어 용융 실리카 또는 바늘의 안쪽에있는 피팅 튜브의 조각에 의해 피펫 팁의 테이퍼에 고정합니다.
참고 : StageTips 실내 온도 21에서 건조 저장 될 수있다.
7. 펩타이드 탈염 및 농축을위한 C 18 StageTips의 사용
- 준비된 StageTip에 솔루션 B의 50 μl를 배치하여 C 18 StageTip을 정돈한다. 벤치 탑 C에서 2 분 동안 2,000 rpm으로 원심 분리기에 끝 스핀entrifuge (예 : 에펜 도르프 5417R).
참고 : 에펜 도르프 원심 분리기에 StageTips를 회전하는 데 사용하는 어댑터, 액체 2 ㎖의 반응 관에 수집됩니다. 큰 규모의 준비를 위해 무대 팁은 200 ㎕의 팁 (96) 팁 랙에 배치 할 수있는 액체는 마이크로 플레이트에서 수집 할 수 있습니다.
참고 : 인해 끝에서 C (18) 디스크를 회전의 위험에 벤치 탑 원심 분리기 (예 : 에펜 도르프 5417R)에서 3,000 XG보다 더 높은 속도를 사용하지 마십시오.
- 100 μL 솔루션 A.는 벤치 탑 원심 분리기 (예 : 에펜 도르프 5417R)에서 5,000 XG에서 원심 분리기에 끝 스핀 사용 StageTip을 평형.
- 2 단계를 반복합니다.
- 신중하게 내부 디스크와 피펫 팁으로 샘플을 피펫으로 디스크에로드 샘플.
참고 : 하나의 디스크가 약 바인딩 할 수 있습니다. 단백질 100 μg.
- CE의 팁을 회전ntrifuge 샘플의 전체 볼륨이 C 18 디스크를 통과 할 때까지.
- 솔루션 A. 100 ㎕의 원심 분리기에서 팁을 스핀 StageTips 두 번 씻으십시오.
참고 : 세척 및로드 StageTips은 최대 일주일 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
- 새로운 1.5 ㎖의 반응 관에 용출액을 수집 솔루션 B. 40 ㎕의 샘플을 용출.
- 속도 진공 청소기에 샘플을 집중한다. 왼쪽 막 1 또는 2 ㎕의 액체가로 이상적인 조건에서 탈수 프로세스를 중지합니다.
참고 : 말린 샘플 년 -80 ° C에 저장할 수 있습니다.
- 시료에 재 부유 용액 15 μL의 최종 부피를 추가하고 질량 분석 분석을위한 마이크로 타이로 전송.
NOTE : 사용 재 부유 버퍼의 최종 부피는 실험자와 질량 분석의 민감도의 요구에 의존사용.
8. 포스 포 농축을위한 대체 프로토콜
참고 : 포스 포 농축를 들어, 2 단계에서 단백질 추출은 인산 가수 분해 효소 억제제의 존재에서 수행해야합니다.
주 : 실제 단백질 농도는 다음 단계를 위해 결정될 필요가 없다. 그것은 불필요한 샘플 손실을 방지하기 위해 단백질 함량의 개산을 갖도록 충분한
- C 8 StageTips을 (6 단계에서 C 18 StageTips의 준비를위한 동일한 프로토콜을 따라) 준비합니다.
- 준비 C 8 StageTips의 상단에 전송 티오 2 구슬의 1 밀리그램 (단백질 100 μg 당 사용 1 밀리그램의 티오 2).
- 벤치 탑 원심 분리기 (예 : 에펜 도르프 5417R)에서 5 분 2,000 XG에서 솔루션 C, 스핀의 100 μL와 티오 2 - 팁을 평형.
- (이 용액 100 μL에 있어야 단계 7.7에서 소화 및 탈염 펩타이드 100 μg을 혼합B) 솔루션 A. 100 μL와
- 1,000 XG, 5 분에 스핀, 평형 티오 2 열에 혼합 된 샘플을로드합니다.
- 흐름을 통해 수집하고 (두 번째 패스를 통해 흐름을 유지) 다시 같은 팁에로드합니다.
- 용액 100 ㎕ 씩 팁을 세척, 2,000 XG에 스핀, 벤치 탑 원심 분리기 (예 : 에펜 도르프 5417R)에서 5 분.
- 5 %의 암모니아를 50 ㎕의 샘플을 용출.
- 5 %의 피 페리 딘 50 μL (모두 용출액은 결합 될 수있다)로 샘플을 용출.
- 즉시 20 % 인산 50 μL를 사용하여 샘플을 산성화. pH는 약 2에 있어야합니다.
참고 : 티오 2 팁을 저장하고 파우더를 검색 할 수 있습니다. 이 용액 B로 세척하고, 하나 또는 두 개 이상의 회전을 위해 다시 사용될 수있다.
- 또 (8 단계 참조) C (18) 팁을 통해 산성화 된 샘플을 탈염.
9. 펩타이드 혼합물의 LC-MS/MS 분석
- 탈염 phosph을 재현 탁재 부유 버퍼 opeptides.
- 로드 선택의 LC-MS/MS 시스템에 샘플을 재현 탁하고 반값 60,000 전체 폭의 권장 해상도에서 데이터 종속 모드의 스펙트럼을 획득.
참고 : 최적의 분열은, 중성 손실 스캔 하나는 다단계 활성화 23 22인가, 또는 가능하면해야한다. ETD를 사용할 수있는 경우에는 인산 (24)의 손실없이 펩티드 백본 조각을 수 있습니다.
참고 : 원시 데이터에서 피크 목록을 추출하여 데이터베이스를 식별뿐만 아니라 정량을 위해 제출해야합니다. 여기, 우리는 마스코트와 LTQ, LTQ-Orbitrap 및 LTQ-FT 악기 (온도 과학)에서 원시 데이터 파일을 작동 MSQuant를 사용하여 설정을 설명합니다.
- MSQuant에서 "도우미"메뉴 내에서 DTAsupercharge를 사용하여 피크 목록을 추출합니다. 기본 설정을 사용합니다.
- 마스코트의 검색 엔진에 피크 목록 파일을 결과로 제출합니다. CRitical 설정 : 질량 허용 오차는 10 ppm 이온 전구체, MS / MS 질량 허용 오차 0.5 다. 고정 수정 : 시스테인의 carbamidomethylation, 변수 수정 : 메티오닌의 산화, 세린의 인산화, 트레오닌, 타이로신. 정량 방법 : 15 N 대사 라벨링.
- 웹 페이지 파일로 마스코트 결과를 저장합니다.
- MSQuant에 마스코트 결과 파일과 RAW 파일을로드합니다. 그 모든 단백질을 선택하고 "자동 정량"을 실행합니다. 이 프로그램은 원시 파일에서 전체 검사 스펙트럼을 읽고 각 펩타이드의 레이블과 레이블이없는 파트너 피크 통합을 할 것입니다.
- 스프레드 시트 프로그램 또는 탭으로 구분 된 텍스트 파일로 내보내기 정량 결과. 데이터는 Excel에서 또는 Statquant 25 크래커 26으로 추가 소프트웨어 패키지를 사용하여 추가 통계 분석에 제출 될 수있다.
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Representative Results
대사 적으로 표지 된 애기 세포 배양을 이용하여 제시된 프로토콜로는 식물 조직 (STEP2가, 2 및도 4)에서 원형질막을 분리하고, 세포막 내에 세제 저항 막 분획에 대한 풍부 할 수있다 (단계 3, 4 및도 5). 이어서, 프로토콜은 수있는 세제 저항 막 분획 (단계 4) 및 비교 프로테옴 분석 (단계 5)에 대한 단백질의 소화로부터 단백질의 추출. 마지막으로, 포스 포 (8 단계)의 선택적 농축은 세포 신호 전달 과정을 공부에 특히 흥미 롭다. 마지막 단계는 레이블과 레이블이없는 세포 배양에서 막 분획의 단백질 풍부 비율의 정량적 데이터 분석 (9 단계, 그림 6)입니다.
2 상 시스템 (단계 2) 및 이후 원심 혼합 후 전형적인 결과는 투명 착색 상부 위상 및 아르녹색은 낮은 단계 (그림 2) 색깔. 녹색 엽록체 및 다른 실내 막에서 막 소포가 낮은 덱스 트란 상에 통합하는 동안 플라즈마 막 소포는 우선적으로, 상부 PEG 단계로 연결합니다. 색 분리가 관찰 될 수없는 경우에, 2 단계가 제대로 수행되지 않았고 원형질막 내부 멤브레인 상당량의 오염 될 것이다. 세포막 단백질의 농축은 2 상 시스템의 하부 상에있는 세포막 분획 및 단백질의 작은 분취 량의 프로테옴 해석에 의해 도시 될 수있다. 하부상은 세포의 내막을 포함한다. 예를 들면, 수용체 키나아제 단백질로서 특히 대표적인 알려진 세포막 단백질은, 세포막 분획 (PM) 및 내부 멤브레인 (IM)를 함유하는 하층 분획 (도 4A)에서 낮은 풍부 높은 풍부 하였다. 높은 endoplasmatic 그물 쇼의 차례로, 알려진 단백질이너 막 분획의 풍부함은 세포막 분획 (도 4b)에서 관찰되지 않았다.
세제 저항 막 분수 (3 단계)의 후속 농축 이상적인 경우 저밀도 막 소포 튜브 높이의 약 2 / 10 일 (그림 3)의 우유 링의 형성에 발생합니다. 단백질 비율 (단계 3.2)에 트리톤 X-100의 농도 또는 세제의 조정이 세제 내성 및 세제 수용성 분획으로 분리를위한 최적의 경우에, 추가로 고리 그라데이션의 하부 부분에서 관찰 될 수 있고, 또한 멤브레인 클럼프있을 것이다 저밀도 밴드. 이러한 경우에, 단백질 비율 또는 전체 세제 양 세제 개의 멤브레인 도메인 분획의 분리를 재현하기 위해 필요한 임계 미셀 농도는 다르다. 단백질의 비율로 최종 세제 농도와 세제를 사용하여의 Enr에게, 여기에 설명같은 remorin 전형적인 마이크로 도메인 단백질의 ichment은 (AT3G61260) (27)는 DRM 분율의 비교 질량 분광 분석, 세제 가용 (단계 3.8)뿐만 아니라 미분 획 세포막 내부 막에 의해 확인 될 수있다. (그림 6A) 예상대로 remorin 단백질의 최고 풍부은 DRM 분수에서 발견되었다. 이러한 ABC 운송업자의 AT1G59870 (그림 6B)와 막 마이크로 도메인에 존재하지 단백질, DRM 분율의 증가 풍요를 표시하지 않습니다. 이러한 60S 리보솜 (그림 6D)에서 ATP 아제 F0 복합체 (그림 6C)와 리보솜 단백질 (At1G001100)에서 미토콘드리아 단백질 (AT2G07707) 등 또한 일반적인 오염 물질은 DRM의 분수에 풍부한 풍요를 표시하지 않는 최소한의 금액은 할 수 있지만 아직 확인 될 수있다.
혈장 단백질 인산화 상태를 질량 분석, 단백질 존재비 비율 야간레이블과 레이블이없는 세포 배양의 막 분획을 정량적으로 (그림 6)를 구별 할 수 있습니다. MSQuant (전형적인 결과 msquant.alwaysdata.net ) 정량 창은 확인 된 펩티드 (그림 6A)의 대부분을위한 1-1의 이온 강도 비율을 표시해야합니다. 이온 강도 비율이 크게 1:1 ~ 일탈과 그 펩티드는 차이가 레이블과 레이블이없는 세포 배양 사이에 규제로 간주, (그림 6C) 적용 처리에 의해 영향을받는 단백질에 일치하는 후보는있다. 성공적인 대사 라벨의 좋은 품질 관리의 공동 용출입니다 표지와도 6B와 D에 나노 HPLC 분리 (9 단계)에서 단일 피크 라벨이없는 펩타이드 버전을 그림과 같이 두.
그림 1. 완전히 대사 레이블과 레이블이없는 A. thaliana의 세포 배양을 사용하여 실험적인 디자인의 두 가지 변종의 신진 대사 라벨링 실험 전략. 도식 표현. 실험 반대의 생물학적 처리 또는 받아야 제어 (대사 표시) 15 N 세포로 (레이블이없는) 14 N 세포를 사용하기로 결정 할 수 있습니다. 상호 실험 설계에서 두 변종은 병렬로 수행됩니다.
그림 2. 엽록체 및 기타 인테리어 막은 BOTT와 연관된 반면, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 덱스 트란에 기초하여 수성 개의 상 시스템에서 식물 막 소포의 분리를위한 워크 플로우. 세포막 소포가 상부 PEG 단계로 구분원심 분리 후 톰 덱스 트란 단계. 상부 상 밖의 세정 나은 정화를 달성 할 수 있고, 또한 재료 손실이 증가된다.
그림 3. 저밀도 막 분획을 농축 저밀도 세제 저항 막 분획의 농축을위한 자당 구배. 표현. 저밀도 막 소포 밴드 밤새 원심 분리 후 예상 위치가 표시된다.
그림 4. 두 개의 상 시스템에서 정제 후 세포막 단백질의 농축. 노멀라이징원형질막 (PM) 및 내부 멤브레인 (IM) 분획으로 측정하고 단백질에 대한 단백질 이온 강도. (A) 원형질막의 전형적인 알려진 성분은 IM 분획에 비해 PM 분획에서 훨씬 더 풍부를 보여준다. 내부 막 (B) 천연 알려진 구성 요소 반대의 동작을 보여줍니다. 정상화의 경우, 각 단백질에 대한 이온 강도 합은 샘플 당 총 이온 강도의 분수로 표현 된 다음 회 반복 사이에 평균. 총 이온 강도의 분획은 다음 두 가지 치료법들 사이의 평균을 기준으로 표현 하였다. 오차 막대가 독립적으로 성장 세포 배양에서 세 가지 준비의 표준 편차를 나타내는 것은. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 5. . 측정 분수 내에서 표준 단백질 마커의 풍부한 플롯은 특정 세포 내 구획을 선택 단백질 마커 (- 스테롤이 풍부한 마이크로 도메인, PM - 세포막, IM - 내부 세포막, SP - 수용성 단백질 DRM)의 정규화 된 단백질 이온 농도의 분포를 나타냅니다. (A) remorin 스테롤이 풍부한 막 마이크로 도메인에 대한 마커로, (B) ABC 형 수송 가족 단백질 스테롤 의존하지 단백질의 대표로서, (C)의 미토콘드리아 F0 복합체의 서브 유닛 (D) 60 년대의 풍요 패턴 일반적인 공동 정화 오염 물질 등의 리보솜 소단위. 정상화의 경우, 각 단백질에 대한 이온 강도 합은 샘플 당 총 이온 강도의 분수로 표현 된 다음 회 반복 사이에 평균. 총 이온 강도의 분획은 다음 두 개의 누 사이의 평균을 기준으로 표현되었다tments. 오차 막대가 독립적으로 성장 세포 배양에서 세 가지 준비의 표준 편차를 나타내는 것은. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 6. 분명히 펩타이드 DNNLLGK의 레이블과 레이블이없는 애기 장대 세포. (A) 전체 검사 스펙트럼에서 단백질 추출물의 1:1 혼합물로부터 펩타이드의 예상 1시 1분 이온 강도 비율을 보여주는 MSQuant에서 양적 단백질 질량 분석. 스크린 샷의 예상 결과 분리 (오른쪽 피크) 표시 및 M / Z 축에 펩티드의 레이블 (왼쪽 피크) 버전. 모노 이소 토픽 (monoisotopic) 질량과 최초의 동위 원소는 파란색 표시로 표시됩니다. (B) 레이블 (블루)나노 HPLC 크로마토 그래피 동안 단일 피크로 펩타이드 공동 용출의 D 레이블 (빨간색) 버전. (C) 차등 규제 단백질 후보로 1:5 이온 강도 비와 펩타이드의 전체 검사 스펙트럼. (D ) 또한 역상 크로마토 그래피 1:1 공동 용출 다른 비율과 단백질. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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Discussion
본 논문에서 제시하는 프로토콜은 여러 단계를 포함하고, 그들 모두는 세제 저항 막 및 세제 용해 분수에 식물 세포막의 순수하고 대표 분별을 얻을 매우 중요합니다. 따라서 지침에 따라 각 단계를 수행하는 것이 중요합니다.
비 - 이온 성 세제 (단계 3.2)와 세포막 분획의 치료는 막 마이크로 도메인 분획의 품질에 강한 영향을 미친다. 상이한 제제 사이 재현 가능한 결과를 얻기 위해, 그리고 동일한 실험에서 서로 다른 샘플을 비교할 수 있도록, 그것이 정확하게 세포막에서 단백질의 농도를 평가하고, 단백질 함량에 대해 동일한 비율을 항상 세제를 적용하는 것은 매우 중요 항상 같은 최종 농도. 실제로, 그것은 때때로 높은 단백질 농도를 가진 샘플을 희석하거나 다른 농도의 주식을 사용할 필요가 있다는 것을 의미트리톤 (Triton) X-100.
생화학 적 연구에서, 최근에는 막 마이크로 도메인 28-30의 분리를위한 세제가없는 방법을 사용하는 연구자들 경향이 있었다. 이러한 방법은 프랑스어 압력 셀 프레스 유사 극소 바늘을 통해 전단에서 세포막의 기계적 파괴에 기초한다. 이 절차가 성공적으로 막 마이크로 도메인이 풍부 포유 동물 세포 배양에 적용되었지만, 유기체 (효모, 식물 세포)를 포함하는 세포 벽 응용 프로그램은보고되지 않았습니다. 메틸-β-시클로 덱스트린과 같은 스테롤 중단시키는 작용제와 함께 정량 프로테오믹스를 사용하여,이 식물 세포막으로부터 제조 DRM 분획 막 마이크로 도메인 (11)을위한 마커이다 단백질을 함유 않는 것으로 나타났다.
질량 분석 정량의 최종 결과에 대해서는, 그림 6에 나타낸 전형적인 결과에 이상적인 상황을 나타냅니다레이블과 레이블이 지정되지 않은 펩타이드의 대부분의 이온 강도는 동일 가까이에있다. 그러나 경우에 표지 및 표지되지 않은 세포 배양의 세트 사이 생물학적 변이의 특정 정도가 관찰 될 수있다. 따라서, 생물학적 처리하기 전에 레이블 또는 레이블이없는 세포 배양이 레이블과 레이블이 지정되지 않은 대조군 세포의 혼합물의 분석을 수행 하나, 모두 어떤 처리하지 않고, 하나의 상황에 이상적인 하나에서 발산 비율이 펩티드를 식별 할 수 있습니다. 분기 비율이이 단백질은 생물학적 변화를 표시합니다. 생물학적 변화의 구별 치료 효과의 도전을 극복하기 위해, 우리는 따라서 쌍 실험 (20)의 상호 표시를 사용하도록 제안한다. 역수 실험 구성에서,도 1에 제시된 것처럼 실험의 두 변형이 수행되고, 설명 된 프로토콜의 단계가 따른다. 그리고, P의 이온 강도 비를 비교이온 강도 비 사이의 차이가 생물학적 변동이나 도포 처리의 영향 등으로 인해 경우에 상호 실험 모두에서 roteins, 하나는 구별 할 수있다.
치료 효과 및 생물학적 변형을 구별하는 문제를 해결하기위한 또 다른 방법은 모든먼트 (31)에 대한 기준으로서 내부 표지 된 표준의 사용이다. 이 접근법에서, 표지되지 않은 제어 및 생물학적 처리를 받아야 표지되지 않은 세포를 동일한 배치에서 오는 무거운 표지 된 대조군 세포의 동일한 양으로 혼합된다. 그것은 14 N-제어 / 15 N-제어 및 14 N 처리 / 15 N-제어의 이온 강도의 비율이 현저하게 다른 경우 단백질이 중요한 것으로 간주되기 때문에, 펩타이드 비율에 생물학적 변화의 영향을 제거 할 수 있습니다. 표시 기준은 모든 경우에 동일한 같이이 가능합니다.
하나의 DR여기서 설명한 DRM 농축 절차 awbacks는 세제 저항 막 분획에서 식별 될 수 CO 정화 단백질이다. 저밀도 세제 저항 막 분획에서 식별 된 단백질의 목록에서, 우리는 정기적 리보솜 단백질의 다수를 관찰 할 수있다. 때문에 리보솜 단백질의 상대적으로 낮은 농도로, 이들은 자당 구배 스테롤 종속 막 단백질과 동일한 분획에서 이동한다. 그것은 리보솜 단백질이 명확하게 막 마이크로 도메인 (11)의 성분없는 의심없이 표시했다. 이러한 사실은 세제 저항 저밀도 막 분획과 관련이없는 다른 공동 정화 단백질을 제외하려면, 우리는 또한 두에서 낮은 덱스 트란 단계에서 추출 할 수있는 세포의 세포막 (IM)의 프로테오믹스 구성을 분석하는 제안 상 시스템과 내막과 DRM 간의 추정 오염물의 풍부한 비율을 비교할분수 (그림 5의 예 참조). DRM-공동 정화 단백질은 모두 분수 (IM 및 DRM)에 유사한 풍부함이 있어야합니다.
세포 추출물 및 막 마이크로 도메인 분획은 프로테옴 분석 (32)에 대해 샘플에서 복잡도를 줄이는 일반적인 방법이다. 따라서, 여기에 설명 된 프로토콜은 식물 세포의 원형질막에 신호 전달 프로세스의 모든 연구에 유용하다. 생물학적 애플리케이션은 스트레스 반응뿐만 아니라 세포막 조성 및 막 단백질 14, 15의 변형 예에 변화를 유도하는 큰 정도 모든 병원체 감염 연구에있다. 스트레스 반응을 연구 외에, 다른 막 분획의 단백질 개체수의 정량 크게 아직 알 수없는 단백질 33 (34, 35)의 주석을 도움이 될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
저자되었습니다 Witold Szymanski는 분자 식물 생리학의 맥스 플랑크 연구소의 직원입니다. 저자는 트라우트 슐츠는 호헨 하임 대학, 독일의 직원입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Chemicals were ordered from Sigma-Aldrich unless noted otherwise | |||
| Ammonia (stock 25 % solution) | WAKO | 010-03166 | |
| TiO2 10 μm | GL-Science | 5020-75010 | |
| Empore Disk C18 | Varian | 12145004 | |
| Polyethylene glycol(PEG 3350) | Sigma | 88276 | |
| Dextran T500 | Roth | 9219.2 | |
| Trypsin | Promega | V5113 | |
| Protease inhibitor cocktail (PIC) | Sigma | P9599 | |
| K15NO3 | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-765-PK | |
| EQUIPMENT | |||
| Optima L-80 XP Ultracentrifuge | Beckman | ||
| Plate reader | BioTek | ||
| EASY-nLC II nano-Liquid Chromatograph | Thermo Scientific | ||
| LTQ-Orbitrap mass spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| Centrifuge 5417R | Eppendorf | ||
| Thermomixer | Eppendorf | ||
| Speed Vac RVC 2-25 | Christ | ||
| Shaker Unimax 2010 | Heidolph | ||
References
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