Summary
Her beskriver vi en robust fremgangsmåde til fraktionering af plante-plasmamembraner i detergent-resistente og detergentopløselige membraner baseret på en blanding af umærket og in vivo fuldt 15 N mærkede Arabidopsis thaliana cellekulturer. Proceduren anvendes til komparative proteom undersøgelser for at forstå signalering processer.
Abstract
Plasmamembran mikrodomæner er funktioner baseret på de fysiske egenskaber af lipid-og sterol-miljø og har særlige roller i signalering processer. Udpakning beriget membran mikrodomæner fra planteceller for proteom analyse er en vanskelig opgave primært på grund af flere forberedelse trin og kilder for forureninger fra andre cellulære rum. Plasmamembranen kun udgør omkring 5-20% af alle membranerne i en plantecelle, og dermed isolering af fraktion højt oprenset plasmamembranen er udfordrende. En hyppigt anvendt metode involverer vandig to-faset opdeling i polyethylenglycol og dextran, som giver plasmamembranvesikler med en renhed på 95% 1. Sterol-rige membran mikrodomæner i plasmamembranen er uopløselige ved behandling med koldt ikke-ioniske detergenter ved alkalisk pH. Denne membranfraktion detergent-resistente kan separeres fra størstedelen plasmamembranen ved ultracentrifugering i såucrose gradient 2. Efterfølgende kan proteiner ekstraheres fra lav densitet bånd af saccharosegradienten med methanol / chloroform udfældning. Ekstraheret protein vil derefter blive trypsin fordøjet, afsaltet og endelig analyseret ved LC-MS/MS. Vores udvinding protokol for sterol-rige mikrodomæner er optimeret til fremstilling af rene detergent-resistente membranfraktioner fra Arabidopsis thaliana cellekulturer.
Vi bruger fuld metabolisk mærkning af Arabidopsis thaliana suspension cellekulturer med K 15 NO 3 som den eneste kvælstof kilde til kvantitative komparative proteom undersøgelser efter biologisk behandling af interesse 3. Ved blanding af lige forhold af mærkede og umærkede cellekulturer for fælles proteinekstraktion indflydelse forberedelsestrin om den endelige kvantitativt resultat holdes på et minimum. Også tab af materiale under udvinding vil påvirke både kontrol og behandling prøver på samme måde, end derfor forholdet mellem lys og hævning peptid forbliver konstant. I den foreslåede metode enten mærket eller umærket cellekultur underkastes en biologisk behandling, mens den anden tjener som kontrol 4..
Introduction
I 1972 Jonathan Singer og Garth Nicolson foreslog flydende mosaik model en struktur model af cellulære membraner, erstatter den protein-lipid-protein-sandwich model, der blev generelt accepteret i begyndelsen af 1960'erne. Sanger og Nicolson postuleres, at den biologiske membran kan betragtes som en todimensionel væske, hvor alle lipid-og proteinmolekyler diffunderer frit og let 5. Siden dengang struktur model af plasmamembranen og kendskab til membranens sammensætning blev endnu mere kompleks. Især inden plasmamembranen strukturer såsom protein komplekser og lipid / sterol baseret strukturelt uordnede mikrodomæner kan iagttages. I kunstige modelmembraner 6,7, kan steroler og sphingolipider sideværts adskille fra andre lipidarter at danne områder med ændrede fysiske funktioner. Denne adskillelse inden for den cellulære membran er primært forårsaget af de selvstændige knytte egenskaber mellem steroler og meget saumættede kulbrinte kæder af phopsho-og sphingolipider 8. Især de stive sterol ringe favorisere interaktioner med stivere og mere lige mættede lipidarter og disse interaktioner tvinge tilstødende kulbrintekaeder i flere udvidede konformationer, øge membran tykkelse og hårdhed.
En af de almindeligt observerede træk beriget membran mikrodomæner var deres uopløselighed ved behandling med non-ioniske detergenter, såsom Triton X-100 eller Brij 35. Disse fraktioner blev anset for at være identisk med membran mikrodomæner og blev kaldt vaskemiddel resistente membraner (DRM) på grundlag af deres biokemiske forberedelse metode 2. Brugen af ikke-ioniske detergenter under DRM udvinding modtaget nogle kritik som den biokemiske DRM præparatet kan ikke direkte svarer til nogen specifik membran rum inden for den levende celle 9. Især vaskemiddel til protein-forhold synes afgørende i sådanne præparater, ens forskellige rengøringsmidler, samt forskellige rengøringsmidler mængder kan give forskellig sammensætning af vaskemiddel modstandsdygtig membran fraktion 10. Der er imidlertid bevis for, at bestemte proteinarter specifikt forbinder med disse cellulære sterol-rige membran domæner, og at disse proteiner er godt beriget i biokemiske præparater af detergent-resistente membranfraktioner 11. Kernen af proteiner, der blev fundet i plante DRM fraktion, og hvor tilstedeværelsen i DRM var sterol afhængige, var især GPI-forankrede proteiner, såsom fasciclin-lignende arabinogalactan proteiner (fla) og medlemmer af SKU protein familien. Også nogle signalproteiner, såsom receptor-lignende kinaser eller phospholipaser blev fundet 11. Disse resultater er i overensstemmelse med mange proteom undersøgelser om pattedyr membran mikrodomæner 12,13. Også i planter der er stigende evidens for den rolle membran mikrodomæner i forbindelse med stress respons 14 -16..
Den her beskrevne protokol giver en robust metode til fraktionering af plasma membran mikrodomæner og især benytter et protein til vaskemiddel koncentration, der giver os mulighed for at skildre stress inducerede ændringer af sterol-rige membran rum 4,11,14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
FREMGANGSMÅDE
Fælles reagenser og buffere, der anvendes i udvinding protokol:
- JPL medium for Arabidopsis thaliana suspension cellekulturer
- 3 uM H 3 BO 3
- 3 uM MnSO4 x H 2 O
- 1,1 uM ZnSO4 x 7 H2O
- 0,15 uM KJ
- 0,03 uM Na 2 MoO 4 x 2 H2O
- 3 nM CoCl2 x 6 H2O
- 3 nM CuSO4 x 5 H2O
- 0,9 mM CaCl2 x 2 H2O
- 0,5 mM MgSO4 x 7 H2O
- 0,5 uM FeSO4 x 7 H2O
- 0,5 uM Na2EDTA x 2 H2O
- 0,12 uM thiamin HCI
- 0,16 uM nikotinsyre
- 0,097 pM pyridoxin HCI
- 0,107 pM NAA
- 0,375 mM KH 2PO 4
- 0.061 mM NaH2 PO 4 x 2 H2O
- 0,039 mM Na 2 HPO 4
- 0,027 mM glycin
- 0,56 mM myoinositol
- 1,5% saccharose
- 10 mM K 14 NO 3 eller 10 mM K 15 NO 3
BEMÆRK: pH JPL medium bør justeres til 5,7 med KOH. Mediet steriliseres ved filtrering eller autoklavering før brug.
- Buffer H
- 100 mM HEPES-KOH (pH 7,5)
- 250 mM saccharose
- 10% (w / v) glycerol
- 5 mM EDTA
- 5 mM ascorbinsyre
- 0,6% (w / v) PVP K-25 eller K-30
- 5 mM DTT (tilføje friske)
- 1 mM PMSF (tilføj friske)
- protease og phosphataseinhibitorer (tilføj friske)
- 50 mM NaF
- 1 mM Na 3 VO 4
- 1 mM benzamidin
- 0,3 uM mikrocystin
- 4 uM leupeptin
- protease inhibitor cocktail
- Buffer R
- 5 mM kaliumphosphat
- 0,33 M saccharose
- 3 mM KCI
- 0,1 mM EDTA
- 1 mM DTT (tilføje friske)
- Buffer TNE
- 25 mM Tris-HCI, pH 7,5
- 150 mM NaCI
- 5 mM EDTA
- To-fase-system (6 g-systemet er velegnet til op til 15 g prøve frisk vægt) fremstillingsmetode
I 15 ml Falcon rør mix ingredienser angivet nedenfor og bland grundigt:- 20% (vægt / vægt) dextran T500 - 2,6 g
- 40% (vægt / vægt) poly (ethylenglycol) (PEG 3350) - 1,3 g
- sucrose - 0,678 g
- 0,2 M kaliumphosphat, pH 7,8 til 0,15 ml
- 2 M KCI - 0.014 ml
- tilsættes vand, indtil den samlede masse af to-fase-system er 6 g.
- Saccharose løsninger i TNE buffer
- 2,4 M, 1,6 M, 1,4 M, 0,15 M
- Reagenser til trypsinfordøjelse
- UTU: 6 M urinstof, 2 M thiourinstof (pH 8,0 med 10 mM Tris-HCI) Reduktion puffer (1 pg / pl DTT i vand, 6,5 mM)
- Alkylering buffer (5 pg / pl iodacetamid i vand, 27 mM)
- LysC endopeptidase (0,5 pg / pl)
- Trypsin, modificeret sekventering bedømmelse (0,4 ug / ul)
- Reagenser til peptid afsaltning end C18
- resuspension opløsning: 2% trifluoreddikesyre (TFA), 5% acetonitril i vand
- opløsning A: 0,5% eddikesyre
- opløsning B: 80% acetonitril, 0,5% eddikesyre
- Reagenser til phosphopeptid berigelse
- Opløsning A: 0,1% TFA, 5% acetonitril
- Opløsning B: 0,1% TFA, 80% acetonitril
- TiO2 10 um
- Ammoniak (lager 25% opløsning)
- Piperidin (lager 100%)
PROTOKOLLER
1.. Metabolisk mærkning af Arabidopsis thaliana cellesuspensionskulturer
- Grow Arabidopsis Col-0 cellesuspension kulturer afledt fra blade 17 i fuld 14 N-JPL medium (18, se "Common reagenser og buffere" afsnit), og et sæt af kulturer i 15 N-JPL medium i steril kolbe ved konstant lys tilstand på 80 til 100 umol / m 2 s, 23 ° C under konstant omrystning ved 120 rpm.
- For at opretholde den cellekulturer pode 400 ml frisk JPL medium med 40 ml syv dage gammel cellekultur i en L kolber.
- Høst af cellekulturer sker via vakuumsugning gennem en bred glastragt med en rustfri stål mesh. Celler akkumuleres på mesh pladen og i tragten og kan nemt indsamles derfra. Celler anbefales der skal fryses ved -80 ° C eller i flydende nitrogen inden formaling.
BEMÆRK: 15 N metabolisk mærkede cellekulturer bruger K 15 NO 3 som den eneste kilde til kvælstof i mindst to passager over to uger 19. I erfariments til sammenlignende proteomics bruge en 15 N mærket cellekultur og som også har en umærket kultur i normal medium. Biologisk behandling vil derefter blive anvendt til enten mærket eller umærket kultur, mens den anden tjener som kontrol (figur 1). Til fremstilling protein, vil begge kulturer kombineres 20. Når man planlægger forsøgsopstillingen, anbefaler vi overvejer en gensidig mærkning setup 4, hvor samme behandling er anvendt en gang til de 15 N-mærkede celler og en gang til de umærkede celler og de respektive umærkede eller 15 N-mærkede celler fungerer som kontrol. I dette tilfælde er behov for de dobbelte mængder af cellekulturer.
2. Plasma Membrane Oprensning
BEMÆRK: Alle yderligere skridt udføres i det kolde rum og / eller på is, medmindre det er anført på anden måde.
- Homogenisere celler fra omkring 1 L 7 dage gamle cellesuspensionskulturer i flydende nitrogen.Materialet kan opbevares ved -80 ° C indtil yderligere anvendelse.
- Bland de samme mængder af mærkede og umærkede frosne cellekulturer baseret på frisk vægt i et bæger og tilsæt 2 volumener puffer H straks. I tilfælde af membran microdomain forberedelse er det foreslået at anvende mindst 7 g frisk vægt af både mærkede og umærkede celler.
- Bægerglasset anbringes på et rysteapparat og omrystes indtil materialet er smeltet, og opløsningen er flydende og uden iskrystaller.
- Foretage homogenatet gennem et lag af Miracloth i 50 ml centrifugerør.
- Balance prøver med buffer H og centrifuger ved 10.000 xg i 8 min.
- Load supernatanten i forkølede ultra-centrifugerør (f.eks rotor Beckman Coulter SW31Ti), med volumen på omkring 32 ml
- Balance prøver med puffer H og pelletere mikrosomer ved centrifugering ved 100.000 xg ved 4 ° C i 30 minutter under anvendelse af Beckman SW32Ti rotor.
- Fjern supernatanten efter centrifugering.
BEMÆRK: Supernatant indeholder opløselige proteiner. En lille mængde af denne fraktion kan gemmes til yderligere proteinudfældning og efterfølgende analyse også af opløselige proteiner.
- Resuspender membranpellet af hver prøve i de respektive mængde puffer R og indlæse på toppen af U1 tofasesystem (figur 2). Hvis der anvendes 6 g tofasesystem, indlæse nøjagtigt 2 g resuspenderet membranpellet.
BEMÆRK: Det endelige volumen buffer R afhænger af størrelsen af de to fase-system, der skal bruges (~ 1,6 ml buffer R er nødvendig ved brug af 6 g system). Det anbefales at bruge mindre buffer til resuspension så ren buffer kan tilføjes på to-fase system for at opnå den krævede vægt, snarere end at bruge for meget buffer til solubilisering og ikke være i stand til at indlæse hele prøven på de to fase system.
- Læg den samme mængde af ren buffer R som bruges til the prøve resuspension på U2.
- Langsomt blande U1 og U2-rør ved at vende dem 30x (ca. 1 inversion / sek).
BEMÆRK: Du må ikke rystes kraftigt tofasesystemet. Det kan forårsage en mangel på adskillelse af faserne i ultracentrifugering trin.
- Centrifuger prøverne ved 1500 xg ved 4 ° C i 10 min.
- Fjern supernatanten efter centrifugering.
- Den øverste fase overføres fra U1 på U2 og gentag centrifugering ved 1.500 x g ved 4 ° C i 10 min.
- Flyt den øverste fase fra U2 ind i SW41Ti ultracentrifugerør og fortynde det med fem volumener buffer R og bland grundigt.
BEMÆRK: Den endelige øvre fase kan have være opdelt i separate ultracentrifugerør før det kan fortyndes fem gange.
- Centrifuger prøverne ved 200.000 xg ved 4 ° C i en time med SW41Ti rotor.
- Resuspender membranpellet i small mængde TNE puffer (typisk 200 pi puffer anvendes) til isolering af vaskemiddel resistente membraner.
BEMÆRK: En lille mængde af denne fraktion kan gemmes til analyse af ufraktioneret plasmamembranen.
BEMÆRK: Plasmafraktionen membran kan opbevares ved 4 ° C natten over før fraktionering i detergent-resistente membraner og detergent-opløselige fraktioner.
3. Vaskemiddel Resistant Membranfremstilling
- Kontroller koncentrationen af plasma membranfraktion ved Bradford-assay.
- Tilføj Triton X-100 til fraktionen plasmamembranen. Den endelige koncentration af rengøringsmiddel skal bo mellem 0,5-1%. Vaskemidlet til protein vægt i forhold til vægten skal bo mellem 13-15.
- Shake prøver ved omkring 100 rpm ved 4 ° C i 30 min.
- Tilsæt tre volumener af 2,4 M saccharose til et volumen af den behandlede plasmamembranen for at opnå 1,8 M endelig koncentration af saccharose. </ Li>
- Forbered saccharosegradient i SW41Ti ultracentrifugerør ved at indlæse de respektive saccharoseopløsninger på toppen af 1,8 M-fraktionen, som illustreret i figur 3..
- Centrifuger prøverne ved 250.000 xg ved 4 ° C i 18 timer under anvendelse af Beckman SW41Ti rotor.
- Fjern forsigtigt ultracentrifugerør fra rotoren for at undgå forstyrrende af lav densitet bånd, som kan være synlig som en mælkeagtig ring på grænsefladen mellem 0,15 M/1.4 M saccharose. Sommetider intet kan ses, men indeholder fraktionen stadig rengøringsmiddelresistent proteinfraktion.
- Fjern brøkdel af 0,75 ml volumen fra toppen af gradienten. Fraktioner 2 og 3, som dækker volumen på omkring 1,5 ml over interfase ringen og 0,5 ml nedenfor angiver fraktionen detergent resistent membran. Saml disse fraktioner i 15 ml Falcon rør. Brøker 9 og 10 indeholder fraktionen vaskemiddel opløselige membran og kan også blive indsamlet til sammenligning. For yderligere analyse, pool fractioner 2 og 3 samt fraktioner 9 og 10.
4.. Udvinding af proteiner fra Vaskemiddel Resistant Fraktion af methanol / chloroform
BEMÆRK: Alle trin udføres i stuetemperatur.
- Tilføj 4 volumener methanol til de indsamlede fraktioner og vortex grundigt.
- Tilsæt 1 volumen chloroform, vortex grundigt.
- Tilføj 3 rumfang vand, vortex grundigt.
- Centrifuger prøverne ved 2.000 xg i 5 min ved hjælp af en bordcentrifuge (f.eks Eppendorf 5417R).
- Den vandige fase over protein lag i mellemfasen fjerne.
- Tilsæt 3 rumfang methanol, vortex grundigt.
- Centrifuger prøverne ved 4000 xg i 10 min.
- Fjern supernatanten og tørre bundfaldet. Den tørrede pellets er klar til i opløsning fordøjelse.
5.. I opløsning trypsinfordøjelse
BEMÆRK: I denne procedure er udført alle trin istuetemperatur for at reducere uønsket derivatisering af aminosyre-sidekæder af denatureringsmidler.
- Prøven opløses i et lille volumen af 6 M urea, 2 M thiurea, pH 8 (UTU). Brug så lav volumen som er foreneligt med prøven (som regel omkring 40 ul).
- Spin prøver opløst i UTU ved 5.000 xg i en bordcentrifuge (f.eks Eppendorf 5417R) i 10 min til pellet eventuelt uopløseligt materiale.
- PH af den endelige opløsning skal være i nærheden af 8,0 til optimal trypsinfordøjelse. Check med pH-strips.
- Tilsæt 1 pi reduktion buffer for hver 50 ug prøveprotein og inkuberes 30 minutter ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Kun et groft skøn over proteinindholdet er nødvendig. Når prøvemængde er begrænset er det bedre at ofre nøjagtighed stedet for at spilde prøven på en proteinanalyse.
- Tilsæt 1 pi alkylering buffer for hver 50 ug prøveprotein og inkuberes 20 minutter ved stuetemperatur i mørke.
- Tilsæt 0,5 pi LysC per 50 ug prøveprotein og inkuberes i tre timer ved stuetemperatur med konstant omrystning ved 700 rpm. Hvis det er nødvendigt, kan det fordøjede også udføres natten over. Dog er forlænget tid ved varme temperaturer ikke anbefales, da det kan øge peptid tab som følge af adsorption til plastrør materiale under vandige pH 8 forhold.
- Fortynd prøve med fire volumener 10 mM Tris-HCI, pH 8.
BEMÆRK: Dette trin er absolut nødvendigt for at fortynde koncentrationen urinstof som trypsin er meget følsom over for høj saltkoncentration.
- Tilsæt 1 pi trypsin per 50 ug prøveprotein og inkuberes natten over ved stuetemperatur med konstant omrystning ved 700 rpm.
- Forsure prøverne til 0,2% TFA slutkoncentration at nå pH 2 (tilsættes ca 1/10 volumen 2% trifluoreddikesyre).
BEMÆRK: Prøver kan opbevares ved - 20 ° C, indtil der anvendes yderligere, men det er bedre at gemmedem på StageTips ved 4 ° C, hvis det er for en kort tid (en uge) eller gemme dem efter StageTips afsaltning.
6.. Fremstilling af C 18-StageTips
- Placer en Empore Disk C18 på en flad, ren overflade, såsom en plastikflaske petriskål.
- Punch et lille disk med en stump spids kanyle med en diameter på 1,5 mm. Disken stikker i nålen og kan overføres til en pipettespids.
- Skub disken ud af nålen og fastgør det i formning af en pipettespids af et stykke af kvartsglas eller slange montering på indersiden af nålen.
BEMÆRK: StageTips kan opbevares tørt ved stuetemperatur 21.
7.. Brug af C 18-StageTips for peptid Afsaltning og koncentration
- Betingelse en C 18-StageTip ved at placere 50 ul opløsning B på den forberedte StageTip. Spin spidsen i centrifugen ved 2.000 rpm i 2 min i en bordplade centrifuge (fx Eppendorf 5417R).
BEMÆRK: Brug adaptere til spin StageTips i en Eppendorf centrifuge, vil blive indsamlet væske i et 2 ml reagensglas. For præparater større skala, kan fase tips også placeres i en spids rack med 96 tips de 200 ul og kan opsamles væske i en mikrotiterplade.
BEMÆRK: Brug aldrig højere hastigheder end 3.000 xg i en bordcentrifuge (f.eks Eppendorf 5417R) på grund af risikoen for at spinde ud C18 disken fra spidsen.
- Ækvilibrere StageTip hjælp 100 ul løsning A. Spin spidsen i centrifugen ved 5.000 xg i en bordcentrifuge (f.eks Eppendorf 5417R).
- Gentag trin 2.
- Load prøve på disken ved omhyggeligt pipettering prøven i pipettespidsen med disken indeni.
BEMÆRK: En disk kan binde ca. 100 ug protein.
- Spin tips i centrifuge indtil hele mængden af prøven passerer gennem C18 disk.
- Vask StageTips to gange med 100 ul løsning A. Spin spidserne i centrifugen.
BEMÆRK: De vaskede og loaded StageTips kan opbevares ved 4 ° C i op til en uge.
- Eluer prøve med 40 ul af opløsning B. Eluatet opsamles i en frisk 1,5 ml reagensglas.
- Koncentrer prøven i hastighed vac. Under ideelle forhold stoppe dehydrering proces, da der er lige omkring 1 eller 2 pi væske venstre.
NOTE: Tørrede prøver kan opbevares i -80 ° C i årevis.
- Tilføj et slutvolumen på 9 pi resuspension opløsning til prøven og overføre den til mikrotiterpladen for massespektroskopi analyse.
BEMÆRK: Det endelige volumen af den anvendte resuspensionsbuffer er afhængig af de behov forsøgslederen og følsomheden af massespektrometretanvendes.
8.. Alternativ Protokol for phosphopeptidsøjlen berigelse
BEMÆRK: phosphopeptidet berigelse, protein udvinding i trin 2 skal ske i overværelse af phosphataseinhibitorer.
BEMÆRK: Præcis proteinkoncentration behøver ikke skal bestemmes for følgende trin. Det er nok at have et groft skøn over proteinindholdet at undgå unødvendige tab prøve
- Forbered C 8-StageTips (følg den samme protokol til fremstilling af C 18-StageTips ved trin 6).
- Overfør 1 mg TiO 2-perler til toppen af tilberedt C8-StageTips (brug 1 mg TiO 2 per 100 ug protein).
- Ækvilibrere TiO2-tips med 100 ul opløsning C, centrifugering ved 2.000 xg i 5 minutter i en bordcentrifuge (f.eks Eppendorf 5417R).
- Bland 100 ug fordøjet og afsaltet peptider fra trin 7.7 (det skal være i 100 ml af opløsningenB) med 100 ul opløsning A.
- Load blandede prøve på den ækvilibrerede TiO 2 kolonner, centrifugering ved 1.000 xg, 5 min.
- Saml gennemstrømning og indlæse det på samme spids igen (holde flow igennem efter andet gennemløb).
- Vask spidsen med 100 pi af opløsning A, centrifugering ved 2.000 xg, 5 min i en bordcentrifuge (f.eks Eppendorf 5417R).
- Elueres prøven med 50 pi 5% ammoniak.
- Elueres prøven med 50 pi 5% piperidin (begge eluater kan kombineres).
- Umiddelbart syrne prøve ved anvendelse af 50 pi af 20% phosphorsyre. pH skal være omkring 2.
BEMÆRK: Gem TiO 2 tips og hente pulveret. Det kan vaskes med opløsning B og bruges igen til en eller to flere runder.
- Igen afsalte forsurede prøver i løbet C 18 tips (se trin 8).
9.. LC-MS/MS Analyse af peptidblandinger
- Resuspender afsaltet Phosphopeptides i resuspensionsbuffer.
- Load resuspenderet prøve på LC-MS/MS foretrukne system og erhverve spektre i data afhængig tilstand ved foreslået opløsning på 60.000 fulde bredder ved halv maksimum.
BEMÆRK: For at opnå optimal fragmentering bør enten neutral-tab scanning påføres 22, eller hvis de findes flertrins aktivering 23. Hvis ETD er tilgængelig det vil give peptidrygrad fragmentering uden tab af fosforsyre 24.
BEMÆRK: Peak lister fra rådata skal udvindes og indsendes til databasen såvel identifikation som for kvantificering. Her beskriver vi indstillinger for brug af Mascot og MSQuant, som arbejder for rå datafiler fra LTQ, LTQ-Orbitrap og LTQ-FT instrumenter (Thermo Scientific).
- Uddrag peak listen ved hjælp DTAsupercharge inden for "Hjælper" Menu i MSQuant. Brug standardindstillinger.
- Indsend resulterende peak liste fil til Mascot søgemaskine. Critical indstillinger: prækursor-ion masse tolerance 10 ppm, MS / MS masse tolerance 0,5 Da. Faste modifikationer: carbamidomethylation cysteiner variable modifikationer: oxidation af methionin, phosphorylering af serin, threonin, tyrosin. Kvantificering metode: 15 N metabolisk mærkning.
- Gem Mascot resultat som webside fil.
- Load Mascot resultat fil og rå fil i MSQuant. Vælg alle proteiner af interesse og køre "Automatisk kvantificering". Programmet vil læse full scan-spektre fra den rå fil og gøre peak integration for mærkede og umærkede partnere i hvert peptid.
- Eksport for mængden resultaterne til et regneark program eller til en tabulatorsepareret tekstfil. Dataene kan derefter underkastes videre statistisk analyse i Excel eller ved hjælp af yderligere softwarepakker såsom Statquant 25 eller krakker 26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med den præsenterede protokol hjælp metabolisk mærkede Arabidopsis cellekulturer er det muligt at isolere plasmamembraner fra plantevæv (trin 2, figur 2 og 4), og berige for vaskemiddel resistent membranfraktioner i plasmamembranen (trin 3, figur 3 og 5). Efterfølgende protokollen tillader udvinding af proteiner fra disse vaskemidler resistent membranfraktioner (trin 4) og fordøjelse af proteinet til sammenlignende proteom analyse (trin 5). Endelig valgfri berigelse af phosphopeptider (trin 8) er særligt interessant at studere cellulære signalprocesser. Det sidste trin er da kvantitativ analyse (trin 9, figur 6) af protein isotopforholdet i membranfraktioner fra mærket og umærket cellekultur.
Typiske resultater efter blanding af 2-fase-system (trin 2) og efterfølgende centrifugering, er et klart farvet øvre fase og engrøn farvet nedre fase (figur 2). Plasma membranvesikler fortrinsvis associere med den øvre PEG fase, mens membranvesikler fra grønne chloroplaster og andre indvendige membraner er inkorporeret i den nederste dextran fase. Hvis der ikke kan observeres farveseparationen blev trin 2 ikke udføres korrekt og plasma membraner vil blive forurenet med betydelige mængder af interne membraner. Berigelse af plasmamembranproteiner kan vises ved proteom analyse af små prøver af plasma membranfraktioner og proteiner i den nedre fase af tofasesystemet. Den nedre fase indeholder de indre membraner i cellen. For eksempel, især typiske kendte plasmamembran-proteiner, såsom receptor kinase proteinerne viste høj overflod i fraktion plasmamembranen (PM) og lav overflod i den nedre fase fraktion (figur 4A), som indeholder interne membraner (IM). Til gengæld kendte proteiner af det endoplasmatiske reticulum show højoverflod i fraktionen den indre membran og blev ikke observeret i plasmamembranen fraktion (figur 4b).
Den efterfølgende tilsætning af detergent resistente membranfraktioner (trin 3) vil i ideelle tilfælde resultere i dannelse af en mælkeagtig ring med lav massefylde membranvesikler ved ca 1/5 th af højden røret (figur 3). Hvis justeringen af Triton X-100 koncentrationer eller vaskemiddel til protein-forhold (trin 3.2) er optimal for separation i vaskemiddel resistente og detergentopløselige fraktioner, kan yderligere ringe observeres i nederste del af gradient og der vil også være membran klumper i den lave densitet båndet. I disse tilfælde detergent til protein-forhold eller total doseringsmængde er forskellig fra den kritiske micellekoncentration er nødvendige for reproducerbar adskillelse af de to membrandomæne fraktioner. Brug af den endelige detergentkoncentration og detergent til protein-forhold, der er beskrevet her, Enrichment af typiske microdomain proteiner, såsom remorin (AT3G61260) 27 kunne bekræftes af en sammenlignende massespektrometrisk analyse af DRM fraktion detergent opløselig fraktion (trin 3.8) samt ufraktioneret plasmamembranen og interne membraner. Højeste overflod af remorin protein blev fundet i DRM fraktioner som forventet (figur 6A). Proteiner ikke er til stede i membranen mikrodomæner, såsom ABC-transportør AT1G59870 (figur 6B), ikke viser en øget forekomst i DRM fraktion. Også typiske forurenende stoffer, såsom en mitokondrie-protein (AT2G07707) fra ATPase F0 komplekset (figur 6C) og ribosomalt protein (At1G001100) fra 60S ribosom (figur 6D) ikke viser en beriget overflod i DRM fraktion, selv minimale mængder kan stadig identificeres.
Efter massespektrometrisk analyse, protein mængderne nøgletal proteinphosphorylering status i plasmamembranfraktioner af mærkede og umærkede cellekulturer kan måles kvantitativt skelnes (figur 6). Typiske resultater fra MSQuant ( msquant.alwaysdata.net ) kvantificering vinduet skal vise et ion intensitet i forholdet en til en for de fleste af de identificerede peptider (figur 6A). Disse peptider med ion intensitet forholdet væsentligt afviger fra 1:1 betragtes som forskellen reguleres mellem mærkede og umærkede cellekultur og er kandidater til at matche til proteiner, der berøres af den anvendte behandling (figur 6C). En god kvalitetskontrol af succesfulde metabolisk mærkning er co-eluering af både mærkede og umærkede peptid-versioner som en enkelt top i nano-HPLC separation (trin 9), som vist i figur 6B og D.
Figur 1. Metabolisk mærkning eksperimentel strategi. Skematisk fremstilling af to varianter af eksperimentelle design, når du bruger fuldt metabolisk mærkede og umærkede A. thaliana cellekulturer. Forsøgslederen kan enten beslutte at anvende 14 N celler (uden mærkning) som en kontrol og 15 N celler (metabolisk mærkede), der undergår biologisk behandling eller omvendt. I en gensidig eksperimentelle design begge varianter udføres parallelt.
Figur 2. Arbejdsgang for adskillelse af plante membranvesikler af en vandig tofase-system baseret på polyethylenglycol (PEG) og dextran. Plasmamembranvesikler adskilt i øvre PEG fase mens chloroplast og andre indvendige membraner er forbundet med Bottabout dextran fase efter centrifugering. Med ekstra vask af øvre fase bedre rensning kan opnås, men også materielle tab øges.
Figur 3. Berigelse af low-density membranfraktionerne. Repræsentation saccharosegradient til berigelse af low-density vaskemiddel resistent membran fraktioner. Den forventede placering efter overnight centrifugering af lav densitet membranvesikel bånd er angivet.
Figur 4.. Berigelse af plasmamembranproteiner efter oprensning i to-fase system. Normalizedprotein ionintensiteter for proteiner målt i plasmamembranen (PM) og interne membraner (IM) fraktion. (A) Typisk kendte bestanddele af plasmamembranen viser meget højere overflod i PM fraktion end i IM fraktion. (B) Natural kendte komponenter af interne membraner viser den modsatte opførsel. For normalisering blev ion intensitet beløb for hvert protein udtrykt som en brøkdel af den samlede ion intensitet per prøve, og derefter i gennemsnit mellem gentagelser. Fraktion af de samlede ionintensiteter blev derefter udtrykt i forhold til gennemsnittet mellem de to behandlinger. Fejllinjer repræsenterer standardafvigelsen af tre præparater fra uafhængigt dyrkede cellekulturer. Klik her for at se større figur .
Figur 5. . Overflod af standard proteinmarkører inden målte fraktioner Plots repræsenterer fordelingen af normaliserede protein ionintensiteter af udvalgte proteinmarkører til bestemte subcellulære afsnit (DRM - sterol-rige mikrodomæner, PM - plasma membran, IM - interne membraner, SP - opløselige proteiner). Abundance mønstre af (A) remorin som en markør for sterol-rige membran mikrodomæner, (B) ABC-typen transportør familie protein som en repræsentant for en ikke sterol-afhængig protein (C) underenhed af mitokondrie F0 kompleks, (D) 60S underenhed af ribosomer som typisk co-oprensning af forurenende stof. For normalisering blev ion intensitet beløb for hvert protein udtrykt som en brøkdel af den samlede ion intensitet per prøve, og derefter i gennemsnit mellem gentagelser. Fraktion af de samlede ionintensiteter blev derefter udtrykt i forhold til gennemsnittet mellem de to treatments. Fejllinjer repræsenterer standardafvigelsen af tre præparater fra uafhængigt dyrkede cellekulturer. Klik her for at se større figur .
Figur 6. Forventede resultater af kvantitative protein massespektrometri. Skærmbillede fra MSQuant viser den forventede 01:01 ion intensitet forholdet mellem et peptid fra en 1:1 blanding af proteinekstrakter fra mærkede og umærkede Arabidopsis celler. (A) Fuld scanning spektrum af peptid DNNLLGK klart adskille mærket (højre top) og umærket (venstre spids) version af peptiderne på m / z-aksen. Den monoisotopic masse og den første isotop er angivet med blå mærker. (B) mærket (blå) end umærkede (røde) versioner af peptid co-elueres som en enkelt top under nano-HPLC-kromatografi. (C) Fuld scanning spektrum af et peptid med ion intensitet 1:5 som en kandidat til en differentielt reguleret protein. (D ) Også proteiner med nøgletal forskellig fra 1:1 co-elueres i modfasekromatografi. Klik her for at se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen præsenteres i dette papir indeholder mange trin, og alle af dem er afgørende for at opnå ren og repræsentativ fraktionering af anlægget plasmamembranen i vaskemidler resistente membraner og detergentopløselige fraktioner. Derfor er det vigtigt at følge hvert trin som anvist.
Behandling af membranen plasmafraktionen med ikke-ionisk detergent (trin 3.2) har den stærkeste indflydelse på kvaliteten af membranen microdomain fraktionering. For at opnå reproducerbare resultater mellem forskellige præparater, og være i stand til at sammenligne forskellige prøver fra det samme forsøg, er det meget vigtigt præcist at vurdere koncentrationen af proteiner i plasmamembranen og anvende detergent altid i samme forhold med hensyn til proteinindhold og altid den samme slutkoncentration. Praktisk betyder det, at nogle gange er det nødvendigt at fortynde prøver med høj proteinkoncentration eller at bruge forskellige koncentrations lagreTriton X-100.
I biokemiske undersøgelser, for nylig har der været en tendens blandt forskere til at bruge et vaskemiddel-fri metode til isolering af membran mikrodomæner 28-30. Disse metoder er baseret på et mekanisk sprængning af plasmamembranen ved forskydning gennem en meget lille nål i analogi med den franske trykcelle presse. Disse procedurer blev anvendt med succes til pattedyrcellekulturer rige på membran mikrodomæner, men ansøgning til cellevæg indeholder organismer (gær-, plante-celler) er ikke blevet rapporteret. Ved hjælp af kvantitative proteomics sammen med sterol forstyrrelser midler, såsom methyl-beta-cyclodextrin, blev det vist, at DRM fraktioner fremstillet ud fra plante plasmamembran indeholder proteiner, som er markører for membran mikrodomæner 11.
Med hensyn til de endelige resultater af massespektrometrisk kvantificering de typiske resultater vist i figur 6 repræsenterer den ideelle situation isom for størstedelen af mærkede og umærkede peptider ion intensitet er tæt på ens. Dog kan i nogle tilfælde observeres en vis biologisk variation mellem sæt af mærkede og umærkede cellekulturer. Således, før biologisk behandling af enten mærket eller umærket cellekultur udføres analyse af en blanding af mærkede og umærkede kontrolceller, begge uden nogen behandling, mulighed for at identificere peptider med et nøgletal afvigende fra den ideelle 00:59 situationer. Disse proteiner med forskellige nøgletal er indikationer for biologisk variation. For at overvinde den udfordring at skelne behandling effekter fra biologisk variation, vi foreslår derfor at anvende den gensidige mærkning parrede eksperimenter 20. I den gensidige forsøgsopstilling er begge varianter af forsøg udført som foreslået i figur 1, og trinene protokollen følges som beskrevet. Derefter sammenligne ion intensitetsforholdene af proteins fra både de gensidige eksperimenter, kan man skelne mellem om forskellene mellem ion intensitetsforholdene skyldes biologisk variation eller som en virkning af den anvendte behandling.
En anden metode til at løse problemet at skelne mellem behandling og biologiske variation er brugen af en intern mærket standard som en reference for alle de behandlinger 31. I denne tilgang er umærket kontrol og umærkede celler, der undergår biologisk behandling blandet med den samme mængde af tunge mærkede kontrol celler, der kommer fra samme parti. Det gør det muligt at eliminere indflydelsen af biologisk variation på peptid-forholdet, fordi proteiner betragtes som væsentlig, hvis ion intensitetsforholdene af 14 N-kontrol / 15 N-kontrol og 14 N-behandling / 15 N-kontrol er væsentligt anderledes. Dette er muligt, da det mærkede standard er nøjagtig den samme i alle tilfælde.
En af drawbacks i proceduren DRM berigelse er beskrevet her, er co-rensende proteiner, der kan identificeres i fraktionen vaskemidlet modstandsdygtig membran. På listen over identificerede proteiner fra fraktion med lav densitet detergent-resistente membran, kan vi løbende observere et stort antal af ribosomale proteiner. På grund af den relativt lave massefylde af de ribosomale proteiner, de vandrer i samme fraktion som sterol afhængige membranproteiner i saccharosegradienten. Det blev vist uden nogen tvivl, at de ribosomale proteiner helt klart ikke er bestanddele af membran mikrodomæner 11. At udelukke disse og andre co-oprensning af proteiner faktisk ikke forbundet med detergent resistente lav massefylde membranfraktioner foreslår vi også analysere proteom sammensætning af intracellulære membraner (IM), der kan udvindes fra den nederste dextran fase fra den to- fase system og sammenligne isotopforholdet af formodede forureninger mellem den indre membran og DRMfraktion (se eksempler i figur 5). DRM-co-oprensning af proteiner bør have tilsvarende forekomster i begge fraktioner (IM og DRM).
Fraktionering af celleekstrakter og membran mikrodomæner er en fælles strategi for at reducere kompleksiteten i en prøve for proteom analyse 32. Derfor protokollen beskrevet her er nyttig til alle undersøgelser af signalering processer på plasmamembranen af planteceller. Biologiske anvendelser er i at studere stress reaktioner samt patogene infektioner, som alle i høj grad inducerer ændringer i plasma sammensætning og ændring af membranproteiner 14,15 membran. Udover at studere stress reaktioner kan kvantificering af protein overflod i forskellige membranfraktioner høj grad støtte annotation af endnu ukendte proteiner 33 34,35.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Forfatteren, Witold Szymanski, er ansat i Max Planck Institut for Molekylær Plantefysiologi. Forfatteren, Waltraud Schulze er medarbejder ved universitetet i Hohenheim, Tyskland.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Chemicals were ordered from Sigma-Aldrich unless noted otherwise | |||
| Ammonia (stock 25 % solution) | WAKO | 010-03166 | |
| TiO2 10 μm | GL-Science | 5020-75010 | |
| Empore Disk C18 | Varian | 12145004 | |
| Polyethylene glycol(PEG 3350) | Sigma | 88276 | |
| Dextran T500 | Roth | 9219.2 | |
| Trypsin | Promega | V5113 | |
| Protease inhibitor cocktail (PIC) | Sigma | P9599 | |
| K15NO3 | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-765-PK | |
| EQUIPMENT | |||
| Optima L-80 XP Ultracentrifuge | Beckman | ||
| Plate reader | BioTek | ||
| EASY-nLC II nano-Liquid Chromatograph | Thermo Scientific | ||
| LTQ-Orbitrap mass spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| Centrifuge 5417R | Eppendorf | ||
| Thermomixer | Eppendorf | ||
| Speed Vac RVC 2-25 | Christ | ||
| Shaker Unimax 2010 | Heidolph | ||
References
- Alexandersson, E., Saalbach, G., Larsson, C., Kjellbom, P. Arabidopsis plasma membrane proteomics identifies components of transport, signal transduction and membrane trafficking. Plant Cell Physiol. 45, 1543-1556 (2004).
- Brown, D. A., Rose, J. K. Sorting of GPI-anchored proteins to glycolipid-enriched membrane subdomains during transport to the apical cell surface. Cell. 68, 533-544 (1992).
- Lanquar, V., et al. 15N-metabolic labeling for comparative plasma membrane proteomics in Arabidopsis cells. Proteomics. 7, 750-754 (2007).
- Kierszniowska, S., Walther, D., Schulze, W. X. Ratio-dependent significance thresholds in reciprocal 15N-labeling experiments as a robust tool in detection candidate proteins responding to biological treatment. Proteomics. 9, 1916-1924 (2009).
- Singer, S. J., Nicolson, G. L. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science. 175, 720-731 (1972).
- Simons, K., Ikonen, E. Functional rafts in cell membranes. Nature. 387, 569-5672 (1997).
- Baumgart, T., et al. Large-scale fluid/fluid phase separation of proteins and lipids in giant plasma membrane vesicles. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 3165-3170 (2007).
- Silvius, J. R. Partitioning of membrane molecules between raft-and non raft-domains: insights from model membrane studies. Biochim. Biophys. Acta. 1746, 193-202 (2005).
- Tanner, W., Malinsky, J., Opekarova, M. In plant and animal cells, detergent-resistant membranes do not define functional membrane rafts. Plant Cell. , (2011).
- Lauwers, E., Andre, B. Association of yeast transporters with detergent-resistant membranes correlates with their cell-surface location. Traffic. 7, 1-15 (2006).
- Kierszniowska, S., Seiwert, B., Schulze, W. X. Definition of Arabidopsis sterol-rich membrane microdomains by differential treatment with methyl-ß-cyclodextrin and quantitative proteomics. Mol. Cell. Proteomics. 8, 612-623 (2009).
- Simons, K., Toomre, D. Lipid rafts and signal transduction. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, 31-39 (2000).
- Maeda, Y., Kinoshita, T. Structural remodeling, trafficking and functions of glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins. Prog. Lipid Res. 50, (2011).
- Keinath, N. F., et al. PAMP-induced changes in plasma membrane compartmentalization reveal novel components of plant immunity. J. Biol. Chem. 285, 39140-39149 (2010).
- Stanislas, T., et al. Quantitative proteomics reveals a dynamic association of proteins to detergent resistant membranes upon elicitor signaling in tobacco. Mol. Cell. Proteomics. 8, 2186-2198 (2009).
- Minami, A., et al. Alterations in detergent-resistant plasma membrane microdomains in Arabidopsis thaliana during cold acclimation. Plant Cell Physiol. 50, 341-359 (2008).
- Pauly, M., Eberhard, S., Albersheim, P., Darvill, A., York, W. S. Effects of the mur1 mutation on xyloglucans produced by suspension-cultured Arabidopsis thaliana cells. Planta. 214, 67-74 (2001).
- Jouanneau, J. P., Peaud-Lenoel, C. Growth and synthesis of proteins in cell suspensions of a kinetin dependent tobacco. Physiol. Plant. 20, 834-850 (1967).
- Engelsberger, W. R., Erban, A., Kopka, J., Schulze, W. X. Metabolic labeling of plant cell cultures with K15NO3 as a tool for quantitative analysis of proteins and metabolites. Plant Methods. 2, 1-11 (2006).
- Arsova, B., Kierszniowska, S., Schulze, W. X. The use of heavy nitrogen in quantitative proteomics experiments in plants. Trends Plant Sci. 17, 102-112 (2012).
- Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. Stop And Go Extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics. Anal. Chem. 75, 663-670 (2003).
- Olsen, J. V., Macek, B. High accuracy mass spectrometry in large-scale analysis of protein phosphorylation. Methods Mol. Biol. 492, 131-142 (2009).
- Schroeder, M. J., Shabanowitz, J., Schwartz, J. C., Hunt, D. F., Coon, J. J. A neutral loss activation method for improved phosphopeptide sequence analysis by quadrupole ion trap mass spectrometry. Anal. Chem. 76, 3590-3598 (2004).
- Frese, C. K., et al. Improved peptide identification by targeted fragmentation using CID, HCD and ETD on an LTQ-Orbitrap Velos. Journal of Protrome Research. 10, 2377-2388 (2011).
- van Breukelen, B., vanden Toorn, H. W., Drugan, M. M., Heck, A. J. StatQuant: a post-quantification analysis toolbox for improving quantitative mass spectrometry. Bioinformatics. 25, 1472-1473 (2009).
- Zauber, H., Schulze, W. X. Proteomics wants cRacker: Automated standardized data analysis of LC/MS derived proteomic data. J. Proteome Res. 11, 5548-5555 (2012).
- Raffaele, S., Mongrand, S., Gamas, P., Niebel, A., Ott, T. Genome-wide annotation of remorins, a plant-specific protein family: Evolutionary and functional perspectives. Plant Physiol. 145, 593-600 (2007).
- Shah, M. B., Sehgal, P. B. Nondetergent isolation of rafts. Methods Mol. Biol. 398, 21-28 (2007).
- Persaud-Sawin, D. -A., Lightcap, S., Harry, G. J. Isolation of rafts from mouse brain tissue by a detergent-free method. Journal of Lipid Research. 50, 759-767 (2009).
- Macdonald, L. J., Pike, L. J. A simplified method for the preparation of detergent-free lipid rafts. Journal of Lipid Research. 46, 1061-1067 (2005).
- Mühlhaus, T., Weiss, J., Hemme, D., Sommer, F., Schroda, M. Quantitative shotgun proteomics using a uniform 15N-labeled standard to monitor proteome dynamics in time course experiments reveals new insights into the heat stress response of Chlamydomonas reinhardtii. Mol. Cell. Proteomics. 10, M110.004739 (2011).
- Schulze, W., Usadel, B. Quantitation in mass-spectrometry-based proteomics. Annu. Rev. Plant Biol. 61, 491-516 (2010).
- Foster, L. J., de Hoog, C., Mann, M. Unbiased quantiative proteomics of lipid rafts reveales high specificity for signaling factors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 5813-5818 (2003).
- Lilley, K. S., Dupree, P. Plant organelle proteomics. Curr. Opin. Plant Biol. 10, 594-599 (2007).
- Sadowski, P. G., Groen, A. J., Dupree, P., Lilley, K. S. Sub-cellular localization of membrane proteins. Proteomics. 8, 3991-4011 (2008).
