Summary
Abstract
Den däggdjur näsa är en multi-fungerande organ med intrikata inre strukturer. Näshålan är fodrad med olika epitel såsom lukt, andningsorganen och skivepitel som skiljer sig markant i anatomiska platser, morfologi, och funktioner. I vuxna möss, är näsan täckt med olika skallben, begränsar experimentell tillgång till interna strukturer, särskilt i den bakre som den viktigaste luktepitel (MOE). Här beskriver vi en effektiv metod för att erhålla nästan hela och intakta nasala vävnader med bevarade anatomiska organisation. Använda kirurgiska verktyg under ett dissekera mikroskop, tar vi sekventiellt skallben omger nasal vävnad. Denna procedur kan utföras på båda paraformaldehydfixerade och nyligen dissekeras, flådda mus huvuden. Hela urbening proceduren tar ca 20-30 min, vilket är betydligt kortare än den experimentella tid som krävs för konventionell kemisk-baserade deförkalkning. Dessutom presenterar vi en enkel metod för att avlägsna luftbubblor fastnar mellan turbinates, vilket är avgörande för att erhålla intakta tunna horisontella eller koronala eller sagittal avsnitt från nasal vävnad förberedelse. Nasal vävnad framställd med hjälp av vår metod kan användas för hela montera observation av hela epitelet, samt morfologisk, immuncytokemiska, RNA in situ hybridisering, och fysiologiska undersökningar, särskilt i studier där region-specifik undersökning och jämförelse är av intresse.
Introduction
Den däggdjur näshålan innehåller olika typer av vävnader och organ som tjänar olika funktioner. Den näshålan utgör ingångsdel av de övre luftvägarna, vilket tillåter luft att resa in i och ut ur lungorna. Inandningsluften passerar genom näshålan där det genomgår temperatur och luftfuktighet konditionering 1 samt rengöring eller filtrering för att ta bort irriterande och giftiga ämnen och infektiösa mikroorganismer 2. Båda behandlingarna utförs av näsepitelet och subepitelial vävnad, inklusive körtlar och fartyg och är avgörande för att skydda de nedre luftvägarna och lungorna. Förutom sin roll i andning och epitelial försvar, innehåller den nasala vävnaden också perifera sensoriska apparater av lukt och trigeminal system som detekterar ett brett spektrum av kemiska ämnen i den passerande luften. Beroende på vilken systemet är aktiverat, kan sensorisk upptäckt av kemikalier i näsan framkallar antingenen känsla av lukt, irritation eller smärta 3,4.
Den perifera Luktsinnet är komplext och består av flera anatomiskt åtskilda lukt sensoriska organ i näshålan. Bland dem är det viktigaste luktepitel (MOE) den största, vilket utgör cirka 45-52% av näsepitelet hos gnagare 5 och är belägen i den bakre regionen. I anteroventral regionen finns det ett par av rörformiga strukturer som kallas det vomeronasala organet 6, som sitter längs varje sida av nässkiljeväggen. Två ytterligare små grupperingar av lukt sensoriska neuroner, känd som septal organ Masera 7,8 och Grüneberg ganglion 9, bor längs den ventrala septum och den dorsala posten regionen av näshålan, respektive. Dessa perifera organ innehåller neuro-epitel med särdrag i morfologi, cellmarkör uttryck och fysiologisk funktion. Tillsammans upptäcker tusentals luktmolekyler med utsökt känslighet 10-12.
Förutom de lukt sensoriska organ, inrymmer näshålan även andra sensoriska system. Det är känt att peptiderga trigeminala nervfibrer är närvarande i det nasala epitelet, särskilt respiratoriska epitelet 13,14. Några av dessa fibrer upptäcker irriterande och giftiga kemikalier och är ansvarig för att initiera skyddsreflexer såsom hosta och nysningar 4,15. Irriterande luktande och bittra föreningar kan också påvisas genom en nyligen upptäckt population av solitära chemosensory celler (SCCs), av vilka många är innerveras av trigeminusnerven fibrer 16-19. Dessa SCCs ligger högre densitet i posten regionen av näshålan och vomeronasala kanaler inträde, antyda att de också kan tjäna en skyddande funktion 16-18. Således kan näsepitelet skiljer sig väsentligt i funktion, morfologi och cellkomposition beroende på derasanatomiska platser.
Även inom en enskild och specialiserad epitel, det finns regionala skillnader. MOE är ett sådant exempel. MOE linjerna olika turbinates, som är komplicerade och böjda konstruktioner. På grund av dem olika regioner av MOE uppleva olika luftflöden och därmed olika diffusion och clearance av luftburna doftmolekylerna 20. Dessutom är det känt att lukt sensoriska neuroner (OSN) uttrycker en given lukt receptor är belägna i en av fyra kringgås zoner av MOE 21,22. Hur denna plats skillnaden påverkar en OSN svar till odörer är till stor del okänt. Dessutom är vissa OSN populationer uppvisar regionala preferenser. Guanylylcyklas-D (GC-D)-uttryckande OSN har områdesprogram distributioner gynnar cul-de-sac regionerna i ectoturbinates 23,24. Mer nyligen, fann vi en delpopulation av kanoniska OSN som uttrycker transient receptor potential kanal M5 (trPM5) och är företrädesvis belägna i de laterala och ventrala regioner 25. Dessa resultat indikerar att MOE inte är enhetlig. Men, är hur dessa regionala skillnader påverkar lukt kodning inte förstått. Detta beror delvis på att noggrann fysiologisk undersökning av MOE och näsan har begränsats av svårigheten att få intakt näsepitelet med bevarade anatomiska organisation med dagens metoder.
Den näsepitelet är huvudsakligen omgiven av främre skallben, inklusive nasal, överkäke, palatine, zygomatic, och ethmoid ben. I vuxna möss och andra modeller gnagare, dessa ben är hårt och svårt att ta bort utan att skada närstående nasal vävnad, speciellt den känsliga näsmusslan. Ofta är kemisk-baserade dekalcifikation används för att mjuka upp benen så att cryosectioning av nasal vävnader för morfologisk, immunhistokemisk och in situ hybridisering studier, men beroende på djurets ålder, kan avkalkning processen pågå över natten upp till 7 dagar 24,26-28. Denna behandling är också begränsad eftersom det kräver vävnad vara fixativ bevarade. Dessutom kan kemisk avkalkning vara hårda och påverka immunomärkning av vissa känsliga antikroppar 29,30. För fysiologiska studier, är levande vävnad som krävs, och därmed är dessa experiment genomförs ofta på enstaka OSN eller MOE skivor erhållna från nyfödda vars skalle ben är tunna och mjuka 17,31,32. Fysiologiska studier kan också utnyttja hela berget förberedelser genom att huvudet delats 25,33,34, men oftast bara den mediala ytan av näsan är lättillgängligt, begränsande fysiologiska inspelningar på andra områden.
Här beskriver vi en effektiv, manuell styckning metod att framställa intakta nasala vävnader med bevarade ursprungliga anatomiska organisation och morfologi. Vi tar bort sekventiellt de stora benen i främreskalle under ett dissektionsmikroskop för att exponera en nästan helt intakt nässlemhinnan samtidigt hålla de tunna turbinata ben intakt såvida mössen är mycket gamla och cryosectioning behövs. Vi utökar också metoden att bevara sambandet mellan de nasala vävnader och lukt lökar, liksom resten av hjärnan, vilket underlättar samtidig behandling av både perifer och central kretsar. Vår metod kan användas för att framställa paraformaldehydfixerade, samt färska, levande nasal vävnad. Således är vår metod förväntas underlätta morfologiska, immunhistokemisk och fysiologiska studier av andning, luktsinne, och nasala skador och sjukdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ett. Mus Näsa Framställning
Vi använde vuxna C57BL / 6 bakgrund möss i denna studie. Alla djuromsorg och förfaranden som godkänts av Animal Care och kommittéer Använd (IACUC) i University of Maryland, Baltimore County.
1.1 Förvärva näsan från paraformaldahyde-fasta möss
Figur 1. Ben från en mus skallen A:. Dorsal syn på skallen B:. Ventrala utsikt över skallen med den borttagna underkäken. Skallen framställdes från en 40-dagars gammal mus. Enskilda ben är färgade för bättre visualisering. Klicka här för att visa en större bild .
- BEGJUTA transcardially att åtgärda enskilda möss efter the-protokollet av Lin et al., (2008) 16. Kortfattat var möss djupt sövda med tribromoethanol (Avertin 250 ug / g kroppsvikt), perfuserades transkardiellt med 0,1 M fosfatbuffert (PB, 30-50 ml), följt av en fosfatbuffrad fixativ innehållande 3% paraformaldehyd, 19 mM L-lysin monohydroklorid, och 0,23% natrium m-perjodat (ca 35-50 ml). Man kan också följa stegen i JUPITER artikeln för djurens perfusion 35.
- Använd en sax för att skära av underkäke (eller underkäken) och ta bort huden på huvudet.
- Separera hela huvudet från resten av kroppen.
- Ta gommen. Också, rengöra och avlägsna kvarvarande bindväv och muskler på ytan av skallen för att erhålla provet som visas i figurerna 1A och 1B.
- Enligt en dissektion mikroskop, ta bort skallbenet som täcker hjärnan och lukt glödlampor. Klipp bort överflödig vävnad och ben. Ingente, för det förlängda vävnad förberedelse där hjärnan och näsan vara ansluten, är det bara de skallben avlägsnades. För immunohistokemiska experiment, var vävnaden efterfixerades i 1,5 h och överfördes till 0,1 M fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med 25% sackaros över natten. Nasal vävnad bör hållas fuktig hela dissektion genom att doppa det i buffrad sackaros lösningen flera gånger.
1.2 Förvärva näsan från nyligen euthanized möss
- Individuella möss överfördes till en ren bur och exponerades för CO 2 gas, som följdes genom cervikal dislokation 5 min efter den sista andetaget. För att minska blod i näsan vävnad, använder en sax för att öppna bröstkorgen och skär hjärtat att medge blod att rinna.
- Upprepa steg 1.1.2 till 1.1.5, utom efter fixering och kryoskydd med 25% sackaros. Exemplaret bör hållas fuktig och underhållas med Tyrodes saltlösning innehållande (i mM): 140 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl2, 1 CaCl2, 10 Na pyruvat, 10 D-glukos, och 10 N-2-hydroxietylpiperazin-N'-2-etansulfonsyrabuffert (HEPES, inställes på pH 7,4). Alternativt, vika en bit Kimwipes, blöt den med Tyrodes lösning, och plats under provet medan dissekera och ibland doppa provet i Tyrodes lösning eller släppa några lösning på vävnaden för att hålla den fuktig för att upprätthålla lönsamheten för de celler och vävnader .
2. Framtand, Anterior Vomer och Maxilla benborttagning
- Utgå från en ventral synvinkel. Lokalisera vomer ben och bryta vomer benet längs dess längd med en rongeur eller tång med tänder för att bryta den ventrala mesta delen av benet.
- Använda tandade pincett, ta bort trasiga delar av vomer benet genom att försiktigt kryssade benfragment från Vomeronasalorganet (VNO). Obs, för möss mindre än en månad gamla, eller om det bara är intresserade av MOE, dessa två steps kan hoppas över.
- Håll fast huvudet med pincett. Använd rongeur att bryta det främre partiet av både hörntänderna och den ledade regionen av främre överkäke mellan de två framtänder och vomer ben.
- Bryt ventrala delen av höger överkäke vid området precis främre till zygomatic båge upp till nivån för den dorsala zygomatic plattan.
- Vänd över näsan för en dorsal synvinkel. Använd rongeur att bryta höger överkäke anterior av ryggens zygomatic plattan. Hela höger överkäke anterior av zygomatic plattan bör vara löst. Använd fin pincett för att försiktigt separera någon nasal vävnad bakom överkäken, och lyft sedan försiktigt bort benfragment.
- Upprepa steg 2.4 och 2.5 för att lossa den vänstra framtand och vänster främre överkäke och ta bort dem efter att näsbenet har tagits bort.
Tre. Nasal Bone and Dorsal Zygomatic plåtborttagning
- Använd tandade pincett eller rongeur att återflytta resten av pannben precis kaudalt om näsbenen. Efter avlägsnande denna bit av ben, kan den kaudala delen av näsbenet gripas med hjälp av pincett.
- Använd rongeur att bryta den främre delen av zygomatic båge, som är ansluten till den zygomatic plattan.
- Ta fin pincett vid den laterala kanten av den dorsala ände zygomatic plattan och försiktigt vända benet och ta bort den. Om benet inte är löst, använd rongeur att klämma den försiktigt för att lossa det för borttagning.
- Använd fin pincett eller ett rakblad för att lossa den mediala suturen mellan höger och vänster näsbenen.
- Använd tandad pincett för att gripa den kaudala änden av den högra nasal ben. Rör försiktigt benet från sida till sida för att skilja den från underliggande vävnad. Det är nyttigt att förflytta tången längs den kaudala tredjedel av näsans ben för förflyttning av benet sida till sida. Som den nasala ben separerar, sakta lyfta benet från kaudala änden.
- Medan tHan näsben något lyfts, luta benet i sidled för att avslöja en lateral outcropping av benet som är fodrad med tunt luftvägarna epitelial vävnad. Använd fin pincett för att försiktigt släppa denna vävnad från näsben. Fortsätt att lyfta näsben. När benet helt separeras från underliggande vävnad, en sax för att skära av den nasala benet vid den rostrala änden.
- Upprepa steg 3.1, 3.5 och 3.6 för att avlägsna vänster näsben.
- Upprepa stegen 3.2 och 3.3 för den vänstra sidan av näsan.
4. Lateral Zygomatic Plate Borttagning
- Avlägsna zygomatic plattan en sida i taget. Antingen zygomatic plattan kan tas bort först.
- Ur en ventral synvinkel, bryta överkäken underlägsen den zygomatic bågen tills paus når zygomatic bågen.
- Ur en dorsal synvinkel, försiktigt tag i zygomatic bågen och lyft framåt och i sidled. Om zygomatic plattan sitter fortfarande någon vävnad, ta böternapincett och försiktigt bryta anslutningarna mellan vävnaden och benet.
- Upprepa för den zygomatic plattan på den andra sidan av näsan.
Fem. Orbit benborttagning
- Ur en ventral synvinkel, bryta Palantine benet mellan kindtänderna i näsan.
- Använd rongeur att bryta de tre molarer och överkäken på vardera sidan av näsan.
- Bryt och ta bort eventuella återstående tjocka benbitar ventrala och posteriort näsmusslan på vardera sidan av näsan.
6. SILBEN benborttagning
- Bryt någon del av SILBEN ben utskjutande kaudalt näsmusslan. Detta är nödvändigt för att undvika förlust av turbinate vävnad vid borttagning av tunna bitar av SILBEN benet täcker turbinates.
- För den högra sidan av näsan, placera fin pincett vid den främre kanten av den ethmoid ben och försiktigt bort det. Om en del av benet kvar, upprepa proceduren tills alladen tunna ben som täcker näsmusslan har avlägsnats. De turbinata ben behöver inte tas bort i de flesta av preparaten. I äldre möss blir cribrosa plattan spröd. Om cryosectioning av nasal vävnad behövs, ta bort små bitar av plattan med fin pincett för att minska den potentiella skada som orsakas av benet.
- Upprepa steg 6.2) för den vänstra sidan av näsan.
- Ta bort eventuella kvarvarande benfragment före snittning. Obs: hos djur mer än ett år gamla, det posterodorsal regionen av septum ben är något tjock och hård. Man kan ta bort denna del med fin pincett. In spetsen av tången in i både sidan av benet för att separera den dorsala delen av septum ben och fodret epitelvävnad. Använd en pincett för att ta tag i benet och håller provet. Använd en annan pincett för att bryta den övre beniga delen från den undre brosk delen av septum och försiktigt bort det.
- Ställ in pumpen sugvakuum.
- Placera näsan i en inbäddning mögel. Sänk näsan i oktober media.
- Använd vakuum för att avlägsna luftbubblor fastnar inuti näsan vävnaden. Denna process tar upp till 5 min.
- Efter avlägsnande luftbubblor, ställa vävnaden i den önskade orienteringen.
- Frysa ULT och vävnaden i formen med torris. Den inbäddade vävnaden kan sedan cryosectioned omedelbart eller förvaras vid -80 ° C för framtida användning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med denna metod, kan vi få tillförlitligt nästan helt intakt nasal vävnad. Figur 2A visar en bild av vuxen nasal prov från en paraformaldehyd-fast huvud. I detta prov, alla fyra sub-lukt sensoriska organ, inklusive MOE, septal orgel, den Grüneberg ganglion, och VNO, är intakta. Dessutom är det respiratoriskt epitel och subepitelial vävnader såsom körtlar och fartyg, bevaras. Vi har framgångsrikt använt denna metod i ett antal studier där vi undersökte morfologi, distribution, nerv innervation, och cellmarkör uttryck i olika specialiserade sensoriska cellpopulationer 16,17,36-38.
Figur 2B visar ett prov med hjärnan, olfactory kulorna, och näsa tillsammans. Denna utökade förberedelser är särskilt användbart i studier som kräver nerv samband mellan det perifera och centrala lukt system. Vi förberedde detta prov genom att ta bort skallen ben Surrounding hjärnan före avlägsnandet av ansiktet ben. Vår utökade metoden tillåter utredare att göra experiment på både perifer och central Luktsinnet i ett enda preparat.
Den nasala vävnad som visas i figur 2 kan användas för hela montera observation, liksom för beredning av vävnadssnitt. Fig 3A visar en horisontell sektion skuren genom både MOE och respiratoriska regioner. Figur 3B visar en koronalt sektion skära genom mitten hos MOE-enheten. Vi färgas avsnitten med neutralt rött för en bättre överblick över olika typer av epiteliala och submukös strukturer på olika anatomiska ställen. Dessa resultat visar att vår teknik bevarar även den känsliga MOE turbinata struktur och anatomiska organisation av näsan, som medge detaljerade och jämförande undersökning av nasala morfologiska och funktionella förändringar under normala och patologiska tillstånd.
Figur 2. Isolerade nasal och hjärnvävnad A:.. Dorsal tanke intakt näsa vävnad dissekeras använda vår urbening metod B:. Rygg syn på en näsa och hjärna med neurala kopplingar mellan centrala och perifera lukt system intakta Klicka här för att visa en större bild .
Figur 3. Sektioner av nasal vävnader A:.. En horisontell sektion som visar lukt och respiratoriskt epitel samt andra nasala strukturer B: Coronal snitt genom turbinates of MOE i den bakre delen av näsan. Båda sektionerna var 14 um tjock och färgades med neutralt rött MOE:. Huvudsakliga luktepitel RE:.. Respiratoriskt epitel Klicka här för att visa en större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här visade vi en steg-för-steg förfarande för att isolera intakt lukt och respiratorisk vävnad från musen näsan genom att sekventiellt avlägsna de omgivande ben utan att skada vävnaden nedan. Vi visar att noggrann benborttagning kan bevara även de mest känsliga vävnader i sin helhet. Vi delar också insikt i de eventuella modifieringar av denna teknik, där vi isolerar både hjärnan och näsan vävnad tillsammans för att bevara nerv-anslutningen. Denna nya metod ger ett medel för att isolera hela olfactory och respiratoriska vävnader i ett enda prov för vidare behandling i immunohistokemisk, RNA in situ hybridisering, och fysiologiska experiment.
Fördelar med benborttagning
Innan vår metod, var avkalkningsmedel vanligtvis används för att mjuka upp benen för mjukpapper sektionering och immunohistokemi. Men beroende på storleken på benet och djurens ålder, avkalkningkan vara en långdragen process som kräver vävnad inkubation i ben avkalkningsmedel i timmar eller flera dagar 29,30. De medel som vanligen används innehåller också syror, som kan ha effekter på vävnaden som kan förändra eller hindra immunomärkning 29,30. För att bekämpa detta vissa forskare använder etylendiamintetraättiksyra (EDTA)-lösning för att sekvestrera kalciumjoner från benet 24,26-28. Denna metod för avkalkning krävs också dagar. Den dissektion visas här kan utföras i ca 20-30 min och kräver inte tillämpningen av några kemiska lösningar som kan ändra stainability av vävnad.
Vår metod kan också användas för att erhålla intakt nasal vävnad från nyligen dissekerade näsor, vilket ger en fördel för att erhålla levande vävnad för fysiologiska inspelningar. Till exempel är näsa skivor som vanligen används för Ca 2 + avbildning av OSN och stödjande celler i luktepitel 31,32. Dessa skivor måste varaframställd från neonatala möss innan benen omger härdat vävnader. Men neonatala exemplar är inte identiska med vuxna eftersom luktepitel fortsätter utveckling och mognad efter födelsen. Med vår metod kan forskarna få intakt lukt vävnad från möss äldre än neonatala åldrar. Detta utgör en betydande fördel, särskilt i studier av åldersberoende förändringar.
Modifieringar och felsökning
Vi visade en effektiv sekvens för att avlägsna omgivande ben. Men det finns andra sekvenser av benborttagning att få intakta nasala vävnader, och steg för steg kan modifieras beroende på de individuella behoven hos forskare och vävnader av störst intresse. Till exempel, om Vomeronasalorganet behövs, bör vomer benet tas bort tidigt i förfarandet eftersom det finns fler ben täckta områden att förstå att hålla vävnaden i önskad plats under avlägsnandet. Genom anpassningting proceduren på varje ansökan, vävnader av intresse är mer sannolikt att förbli intakt för vidare bearbetning. Näsbenen tenderar också att vara svåra att ta bort, eftersom vävnaden nedan klänger sig fast vid benen och kommer ofta riva eftersom benen lyfts bort. Förutom att vicka näsbenen som visas i videon, kan små pincett försiktigt in mellan näsbenet och den underliggande vävnaden för att flytta vävnad ner och bort från benen vid borttagning.
Den dissektion varierar också något beroende på åldern hos mössen. Hos unga möss, benen tenderar att vara mjukare, medan benen av äldre möss är skörare och starkt smält till angränsande ben i vissa regioner. Mjukt ben är lättare att separera och ta bort i små bitar än hårdare ben. Denna skillnad kan lätt övervinnas genom att använda pincett för att poäng eller skrapa vid anslutningar mellan benen till stöd i deras separation och ren borttagning. I äldre djur, det posterodorsal region av septum är något tjockare och hårt och bör tas bort före cryosectioning. Den beniga delen av septum kan avlägsnas såsom beskrivs i förfarande 6.4. Även om det finns små skillnader i dissektion för äldre och yngre möss, är ålder inte en begränsande faktor. I våra studier har vi förberett framgångsrikt intakta nasala vävnader från möss som sträcker sig från 14 dagar till två år gamla.
Det finns ingen signifikant skillnad mellan de dissekera steg som för fixativ-fast näsa och för färskt näsan även den friska vävnaden är mjukare och kräver mer noggrann manipulation. I båda preparaten, hålla vävnaden fuktig under dissektion är viktigt. Det är inte nödvändigt att utföra färsk vävnad dissektion i buffrad saltlösning, dock periodiskt doppa vävnaden i Tyrodes lösning eller droppning av lösningen på vävnaden medan dissekera är viktigt eftersom det kommer att hålla vävnaden fuktig och näringsämnen tillförs till behålla sin viability.
Det förfarande som presenteras här kan modifieras ytterligare att innefatta benborttagning som lämnar både hjärnan och näsa intakt i ett enda prov (Figur 2B). Denna modifikation skonar nervförbindelser mellan hjärnan och näsa som passerar genom cribrosa plattan. Mer teknisk skicklighet och tid krävs för denna dissektion än näsan ensam. Emellertid, bevara anslutningarna från periferin till hjärnan möjliggör mer olikartade tillämpningar av denna metod.
Begränsningar
Vi har använt denna metod för att förbereda nasala vävnader för ett antal studier, inklusive immunhistokemisk märkning och mRNA in situ hybridisering analys, och har framgångsrikt märkt många proteiner i signalvägar, färgad cell markörer i olika cellpopulationer, och undersökte morfologiska egenskaper och cellfördelning genom näshålan 16,17,36-39. Vi gjorde inte experience begränsningar cryosectioning och immunomärkning. För studier som kräver cryosectioning av den förlängda förberedelse som håller hjärnan och nasal vävnad ansluten i ett enda exemplar, rekommenderar vi att använda möss yngre än 4 månader sedan i äldre möss den spröda cribriform plattan kan skapa vävnadsskada vid snittning. Men för färsk vävnad avsedd för elektrofysiologiska inspelningar, de mediala vävnaderna mellan turbinates inte är lättillgängliga i hela montera beredning. Avlägsnande av små bitar av vävnad eller delning i diskreta regioner kan övervinna problemet. Eftersom konventionell elektro-olfactogram görs på den mediala ytan av endo-näsmusslan 25,33,34, kan vår vävnadsberedning tillåta inspelningar från andra regioner med lite manipulation.
Applikationer utöver Immunohistokemi
Många tillämpningar av förfarandet finns för dem som behärskar tekniken. Möjlig applicatjoner inkluderar zoner studier på lukt och respiratoriska vävnader som, med hjälp av andra metoder, har varit svårt att få intakta och på sina ursprungliga anatomiska konfiguration. Program finns också för elektrofysiologi genom att tillåta flera samtidiga-inspelningar på hela, färska vävnader. Några av dessa program, som var svåra att utföra med hjälp av befintliga metoder, görs möjligt genom vår urbening metod. Vidare kan detta protokoll också anpassas till biokemiska, genomiska och proteomik studier som kräver konsekvent provtagning vid olika regioner för kritisk jämförelse.
Sammanfattningsvis har vi utvecklat ett förfarande för att snabbt och tillförlitligt komma olfactory och respiratoriska vävnader i mus näsa genom att ta bort de omgivande ben. Denna metod har väsentliga fördelar jämfört med vanligen använda tekniker såsom avkalkning. Vidare kräver vår metod ingen kemisk behandling, och därför är vävnader inte begränsad för användning i immunohistochemistry experiment, men kan även vara tillämpliga för in situ hybridisering och fysiologiska studier. Således är vår metod en snabbare, mer direkt sätt att förbereda musen näsa för vidare bearbetning. Vi förväntar oss att vår metod kommer att underlätta lukt och respiratoriska studier i nasala regioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av forskningsbidrag (NIH / NIDCD 009.269, 012.831 och Arra administrativa komplettera NIH bidrag) till Weihong Lin. Vi tackar särskilt Mr Tim Ford på UMBC för hans tekniskt bistånd i videofilmning och bearbetning. Vi vill också tacka Dr Daphne Blumberg, Ms Chere Petty på UMBC och Mr Nicholas McCollum från Olympus America Inc. för deras utrustning stöd i videofilmning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection | |||
| Rongeur, 1.0 mm Jaw width | World Precision Instruments (WPI) | 501333 | |
| Fine forceps, Dumont 3 | WPI | 503235 | |
| Fine forceps, Dumont 55 | WPI | 14099 | |
| Fine forceps, Dumont AA | Fine Science Tools (FST) | 11210-20 | |
| Specimen forceps, Serrated | VWR | 82027-440 | |
| Operating scissors | WPI | 501753 | |
| Iris scissors, Straight | Miltex | V95-304 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZ40 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue embedding | |||
| Optimum cutting temperature (OCT) compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Plastic embedding mold | VWR | 15160-215 | |
| Aspirator vacuum pump | Fisher Scientific | 09-960-2 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Section staining | |||
| Neutral red | ACROS Organic | CAS 553-24-2 | Nuclei staining |
References
- Naclerio, R. M., Pinto, J., Assanasen, P., Baroody, F. M. Observations on the ability of the nose to warm and humidify inspired air. Rhinology. 45, 102-111 (2007).
- Bjermer, L. The nose as an air conditioner for the lower airways. Allergy. 54, Suppl 57. 26-30 (1999).
- Firestein, S. How the olfactory system makes sense of scents. Nature. 413, 211-218 (2001).
- Bryant, B., Silver, W. L. Chemisthesis: The common chemical sense. , 2nd, Wiley-Liss. (2000).
- Gross, E. A., Swenberg, J. A., Fields, S., Popp, J. A. Comparative morphometry of the nasal cavity in rats and mice. J. Anat. 135, 83-88 (1982).
- Halpern, M. The organization and function of the vomeronasal system. Annu. Rev. Neurosci. 10, 325-362 (1987).
- Rodolfo-Masera, T. Su l'esquoestizenza di un particulare organo olfacttivo nel setto nasale della cavia e di altri roditori. Arch. Ital. Anat. Embryol. 48, 157-212 (1943).
- Levai, O., Strotmann, J. Projection pattern of nerve fibers from the septal organ: DiI-tracing studies with transgenic OMP mice. Histochemistry and Cell biology. 120, 483-492 (2003).
- Storan, M. J., Key, B. Septal organ of Gruneberg is part of the olfactory system. J. Comp. Neurol. 494, 834-844 (2006).
- Restrepo, D., Arellano, J., Oliva, A. M., Schaefer, M. L., Lin, W. Emerging views on the distinct but related roles of the main and accessory olfactory systems in responsiveness to chemosensory signals in mice. Horm. Behav. 46, 247-256 (2004).
- Breer, H., Fleischer, J., Strotmann, J. The sense of smell: multiple olfactory subsystems. Cell Mol. Life Sci. 63, 1465-1475 (2006).
- Munger, S. D., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. Subsystem organization of the mammalian sense of smell. Annu. Rev. Physiol. 71, 115-140 (2009).
- Finger, T. E., St Jeor, V. L., Kinnamon, J. C., Silver, W. L. Ultrastructure of substance P- and CGRP-immunoreactive nerve fibers in the nasal epithelium of rodents. J. Comp. Neurol. 294, 293-305 (1990).
- Papka, R. E., Matulionis, D. H. Association of substance-P-immunoreactive nerves with the murine olfactory mucosa. Cell Tissue Res. 230, 517-525 (1983).
- Baraniuk, J. N., Kim, D. Nasonasal reflexes, the nasal cycle, and sneeze. Curr. Allergy Asthma Rep. 7, 105-111 (2007).
- Lin, W., Ogura, T., Margolskee, R. F., Finger, T. E., Restrepo, D. TRPM5-expressing solitary chemosensory cells respond to odorous irritants. J. Neurophysiol. 99, 1451-1460 (2008).
- Ogura, T., et al. Cholinergic microvillous cells in the mouse main olfactory epithelium and effect of acetylcholine on olfactory sensory neurons and supporting cells. J. Neurophysiol. 106, 1274-1287 (2011).
- Finger, T. E., et al. Solitary chemoreceptor cells in the nasal cavity serve as sentinels of respiration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 8981-8986 (2003).
- Gulbransen, B. D., Clapp, T. R., Finger, T. E., Kinnamon, S. C. Nasal solitary chemoreceptor cell responses to bitter and trigeminal stimulants in vitro. J. Neurophysiol. 99, 2929-2937 (2008).
- Zhao, K., Dalton, P., Yang, G. C., Scherer, P. W. Numerical modeling of turbulent and laminar airflow and odorant transport during sniffing in the human and rat nose. Chemical Senses. 31, 107-118 (2006).
- Ressler, K. J., Sullivan, S. L., Buck, L. B. A zonal organization of odorant receptor gene expression in the olfactory epithelium. Cell. 73, 597-609 (1993).
- Vassar, R., Ngai, J., Axel, R. Spatial segregation of odorant receptor expression in the mammalian olfactory epithelium. Cell. 74, 309-318 (1993).
- Fulle, H. J., et al. A receptor guanylyl cyclase expressed specifically in olfactory sensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 3571-3575 (1995).
- Juilfs, D. M., et al. A subset of olfactory neurons that selectively express cGMP-stimulated phosphodiesterase (PDE2) and guanylyl cyclase-D define a unique olfactory signal transduction pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 3388-3395 (1997).
- Lin, W., Arellano, J., Slotnick, B., Restrepo, D. Odors detected by mice deficient in cyclic nucleotide-gated channel subunit A2 stimulate the main olfactory system. The Journal of Neuroscience: The Official journal of the Society for Neuroscience. 24, 3703-3710 (2004).
- Ishii, T., Omura, M., Mombaerts, P. Protocols for two- and three-color fluorescent RNA in situ hybridization of the main and accessory olfactory epithelia in mouse. J. Neurocyt. 33, 657-669 (2004).
- Lee, A. C., Tian, H., Grosmaitre, X., Ma, M. Expression patterns of odorant receptors and response properties of olfactory sensory neurons in aged mice. Chemical Senses. 34, 695-703 (2009).
- Packard, A., Schnittke, N., Romano, R. A., Sinha, S., Schwob, J. E. DeltaNp63 regulates stem cell dynamics in the mammalian olfactory epithelium. The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 8748-8759 (2011).
- Matthews, J. B., Mason, G. I. Influence of decalcifying agents on immunoreactivity of formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Histochem J. 16, 771-787 (1984).
- Athanasou, N. A., Quinn, J., Heryet, A., Woods, C. G., McGee, J. O. Effect of decalcification agents on immunoreactivity of cellular antigens. J. Clin. Pathol. 40, 874-878 (1987).
- Hegg, C. C., Irwin, M., Lucero, M. T. Calcium store-mediated signaling in sustentacular cells of the mouse olfactory epithelium. Glia. 57, 634-644 (2009).
- Spehr, M., et al. Essential role of the main olfactory system in social recognition of major histocompatibility complex peptide ligands. The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 1961-1970 (2006).
- Ma, M., Chen, W. R., Shepherd, G. M. Electrophysiological characterization of rat and mouse olfactory receptor neurons from an intact epithelial preparation. J. Neurosci. Methods. 92, 31-40 (1999).
- Cygnar, K. D., Stephan, A. B., Zhao, H. Analyzing responses of mouse olfactory sensory neurons using the air-phase electroolfactogram recording. J. Vis. Exp. (37), e1850 (2010).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).
- Lin, W., Margolskee, R., Donnert, G., Hell, S. W., Restrepo, D. Olfactory neurons expressing transient receptor potential channel M5 (TRPM5) are involved in sensing semiochemicals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 2471-2476 (2007).
- Lin, W., Ezekwe, E. A., Zhao, Z., Liman, E. R., Restrepo, D. TRPM5-expressing microvillous cells in the main olfactory epithelium. BMC Neurosci. 9, 114 (2008).
- Ogura, T., Krosnowski, K., Zhang, L., Bekkerman, M., Lin, W. Chemoreception regulates chemical access to mouse vomeronasal organ: role of solitary chemosensory cells. PLoS One. 5, e11924 (2010).
- Sathyanesan, A., Feijoo, A. A., Mehta, S. T., Nimarko, A. F., Lin, W. Expression profile of G-protein βγ subunit gene transcripts in the mouse olfactory sensory epithelia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 84 (2013).
