Summary
מדידות כוח ניתן להשתמש כדי להדגים שינויים בתפקוד שרירים עקב פיתוח, פציעה, מחלה, טיפול או רעילות כימית. בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את שיטה למדידת כוח בכיווץ מקסימאלי של שריר תא מטען הזחל דג הזברה.
Abstract
זחלי דג הזברה לספק מודלים של פיתוח שרירים, מחלות שריר ורעילות כימית שריר בנושא, אך מחקרים הקשורים לעתים קרובות חוסר אמצעים פונקציונליים של בריאות שריר. במאמר זה וידאו, אנו מדגימים שיטה למדידת דור כוח במהלך ההתכווצות של שריר תא מטען הזחל דג הזברה. מדידות כוח הם השיגו על ידי הצבת זחל מורדם לחדר מלא בתמיסת מלח. הקצה הקדמי של הזחל קשור למתמר כוח ואת הקצה האחורי של הזחל קשור לאורך הבקר. התכווצות עווית איזומטרי היא שהושרו על ידי גירוי שדה חשמלי וכוח התגובה היא רשמה לניתוח. דור חיל במהלך ההתכווצות מספק מדד של בריאות שרירים כללית ובאופן ספציפי מספק מדד לתפקוד שרירים. למרות שאנו מתארים טכניקה זו לשימוש עם פראי סוג זחלים, ניתן להשתמש בשיטה זו עם זחלים מהונדסים גנטיים או עם זחלים שטופלו בתרופות או toxicants,כדי לאפיין מודלים מחלת שריר ולהעריך את הטיפולים, או ללמוד פיתוח שריר, פציעה, או רעילות כימית.
Introduction
זחלים צעירים דג הזברה (Danio rerio), 3-7 ימים לאחר ההפריה (DPF), מוכרים יותר ויותר כאורגניזם שימושי למחקר שרירי שלד. זחלים צעירים משמשים למחלת שריר 1-9 האנושית מודל, להעריך תרופות ואסטרטגיות טיפוליות 10-11, מחקר פגיעה בשרירים 12, מבין שריר פיתוח 13-16, ולחקור את הרעילות כימית שרירים הקשורים 17-19. מחקרים אופייניים באזורים אלה לבחון את המידה שבה שריר בריא הוא שניתנו על ידי מניפולציה גנטית חריג או חשיפה לרעלים, וכמה מחקרים לבחון את המידה שבה שריר נורמלי מגיב לטיפול. קריטי להצלחה של מחקרים אלה הוא היכולת להעריך את בריאות שריר בצורה מדויקת.
אמנם יש מגוון של שיטות זמינות כדי להעריך את בריאות שרירים בזחלי דג הזברה, מעטים לספק מידע ישיר על תפקוד שרירים. בריאות שריר בדרך כלל מוערכת על ידי appearancדואר, כפי שהוערך על ידי צביעת היסטולוגית 6,8,11, immunostaining 9,15,16,18, מיקרוסקופ אור 3,13, מיקרוסקופית אלקטרונים 3,4,14,16, או שבירה כפולה 7,9,11, אבל טכניקות אלה מספקים מידע מורפולוגי בלבד. תא מטען והתקות זנב ושחייה מהיר 4,17 להעריך תפקוד מוטורי, אבל אלה אינם אמצעים ישירים של תפקוד שרירים שכן הם משקפים גם קלט עצבי, חילוף החומרים של אנרגיה, ותהליכים אחרים.
בניגוד לכך, מדידת דור כוח במהלך ההתכווצות מספקת הערכה ישירה של תפקוד שרירים ומייצג מדד לבריאות שרירים כללי. יתרונות נוסף של גישה זו כוללים ניתוח נתונים פשוט, ותוצאות כמותיות. במאמר זה וידאו, אנו מספקים נוהל מפורט למדידת כוח על ידי דור שרירי זחל, בתקווה שחוקרים יותר יהיו להשתמש בשיטה זו כדי להשלים את האמצעים קיימים של בריאות שריר במחקר שלהם.
כדי להיות ברור, טכניקה זו אינה מודדת כוחות שנוצרו על ידי שרירי זחל במהלך השחייה. כי שני הקצוות של הזחל קשורים לציוד ובגלל הזחל נותר מורדם, זה לא יכול ליזום תנועה במהלך בדיקה. יתר על כן, גירוי תחום מפעיל את כל סיבי השריר באותו הזמן כדי לגרום למליארדהתכווצות ateral, וזה לא מה שמתרחש באופן טבעי 20. לכן, במקום למדוד כוחות בפועל נוצרו במהלך חייה, טכניקה זו קובעת את יכולת הפקת כוח של שרירי הזחל.
יש לנו להשתמש בטכניקה זו כדי להפגין חולשה בשרירים במודל דג הזברה של nemaline מיופתיה 21, כמו גם להעריך את ההשפעה של טיפול נוגד חמצון בתפקוד שרירים במודל דג הזברה של מחלה רבת MiniCore 22. אחרים השתמשו בטכניקה דומה 23 כדי לבחון את ההשפעות של מזהמים סביבתיים על תפקוד שרירים 19.
Protocol
הערה: כל ההליכים כרוכים בדג זברה צריכה להתבצע בהתאם להנחיות רלוונטיות, תקנות וגופים הרגולטוריים. כל נהלי השימוש בבעלי החיים המוצגים במאמר זה אושרו על ידי אוניברסיטת מישיגן הוועדה על השימוש וטיפול של בעלי חיים (UCUCA).
1. הפוך לולאות תפר
- שימוש במלקחיים כדי להפריד תפר הלא סטרילית (USP 10 / ניילון monofilament 0, 3 רובדי) לשלושה גדילים.
- מתחיל לקשור קשר בוהן כפול באחד מהגדילים. לעצור לפני הידוק הקשר לחלוטין כדי להפוך את לולאה (~ קוטר 1 מ"מ) קטנה במקום קשר.
- השתמש במספריים כדי לחתוך תפר עודף מזנבות הלולאה. דוגמה ללולאה סיימה מוצגת באיור 1.
- הנח את הלולאה בצד הדביק של פוסט זה הערה לשימוש מאוחר יותר. לולאות התפר תהיה בשימוש כדי להחזיק את הזחלים במקום במהלך בדיקת כוח.
- חזור על שלבי 1.1-1.4 בהתאם לצורך. מאקדואר שתי לולאות תפר לכל זחל שייבחן.
2. הפוך פתרון בדיקה
- בצע פתרון Tyrodes ידי הוספת 7.977 גרם נתרן כלורי, אשלגן כלורי 0.373 גרם, 0.265 dihydrate סידן כלוריד גרם, 0.102 hexahydrate מגנזיום כלוריד גרם, 0.048 גרם נתרן פוספט monobasic, סודיום ביקרבונט 1.000 גרם, ו0.037 dihydrate מלח חומצת ethylenediaminetetraacetic disodium גרם ל1,000 מ"ל של מים מטוהרים.
- מערבבים את הפתרון עד שהמלחים מתמוססים לחלוטין. פתרון זה יכול להיות מאוחסן במשך חודש ב 4 ° C.
- הוסף 2.1 מ"ל של 4 מ"ג / מיליליטר tricaine, שהוכן על פי ספר דג הזברה 24, לפתרון Tyrodes מ"ל 47.9 ומערבבים. הגן על פתרון זה מאור על ידי אחסונו בבקבוק זכוכית כהה או בבקבוק זכוכית מכוסה ברדיד אלומיניום. פתרון זה צריך להיות מאוחסן בטמפרטורת חדר ועשה טרי בכל יום.
3. לקשור את זחל Aanesthetized לתוך תא ניסוי
- <li> מקום מנגנון הבדיקה (איור 2) על הבמה של מיקרוסקופ סטריאו.
- חברו את מתמר כוח וכבלים באורך הבקר למנגנון הבדיקה. הפעל את מתמר כוח. הפעל את הבקר האורך כך שהוא נשאר נוקשה. (הערה:.. בקר האורך מספק את היכולת למתוח או לקצר את שריר במהלך הכנת התכווצות עם זאת, תכונה זו של הבקר האורך לא נעשתה שימוש בשיטה שתוארה לעיל על כן, ניתן לחשוב על הבקר האורך של כקובץ מצורף נוקשה נקודה רכוב על מערכת מיקום XYZ).
- עם טפטפת העברה חד פעמי, למלא את תא הניסוי עם פתרון בדיקה.
- שימוש במלקחיים כדי להרים את לולאת תפר על ידי אחד מהזנבות ולתלות אותו על הצינור מתמר כוח. לתלות לולאת תפר שנייה בצינור המחובר לאורך הבקר. (הערה: לופת לולאת תפר בחלק המעוקל יכול שגעון התפר וCAUse זה לשבור בשלבים הבאים).
- עם טפטפת העברה חד פעמי, להעביר זחל דג הזברה לצלחת פטרי קטן מלאות בפתרון בחינה. חכה להרדמה בפתרון הבדיקה (tricaine) ייכנס לתוקף (~ 1 דקות). עם מלקחיים, בעדינות לדחוף את הזנב ולוודא שהוא הרדים את הזחל בחוסר עורר מגע שחייה.
- השתמש פיפטה זכוכית להעביר את הזחל לתא הניסוי.
- על ידי נגע בעדינות את הזחל עם מלקחיים סגורים, להנחות את החלק הקדמי של הזחל דרך לולאת התפר על הצינור מתמר כוח. להנחות את החלק הקדמי של הזחל דרך לולאת התפר על הצינור. אחוז בשני זנבות לולאת תפר עם מלקחיים ולמשוך אותם בו זמנית להדק את לולאת התפר האחורית לצק החלמון או swimbladder (איור 3 א).
- עם מלקחיים, להחזיק את זנב לולאת תפר אחד ומושך, גורם זחל למסתובב 90 מעלות מסביב לצינור עד לצד הלטרלי של הפנים הזחלשל מעלה (איור 3). אם הלולאה הודקה מספיק, לא יהיה התנגדות מסוימת למשיכה; הזחל לא צריך להסתובב בקלות. אם הלולאה הייתה להדק יותר מדי, את הזחל לא מסתובב סביב הצינור.
- שימוש במכשיר מיצוב XYZ המצורף לאורך הבקר, להעביר את צינור בקר האורך לאורך ציר ה-X (הגדרות ציר באיור 2 א) ומתחת לתא המטען והזנב של הזחל. השאר רווח בין קצות צינור הבקר ואורך הצינור מתמר כוח.
- להנחות את לולאת התפר על הזנב של הזחל ולהדק את לולאת התפר כפי שתואר לעיל (איור 3 ג). ייתכן שיהיה צורך לסובב את החלק האחורי של זחל הצד לרוחב, כך שפונה כלפי מעלה. לקצץ את זנבות לולאת התפר (איור 3D).
4. זחל עמדה בתא ניסוי
- הזז את הזחל למרחק מתאים מתחתית התא כדי להבטיח w הזחלחולה להיות בתוך "מרחק עבודה" של מטרת מיקרוסקופ הפוכה במהלך השלבים הבאים. כדי להשיג זאת, להשתמש במכשירי מיצוב XYZ להנמיך את הצינורות (עם זחל מצורף) באיטיות לאורך ציר ה-Z ועד הצינורות פשוט לגעת בחלק התחתון של החדר. לאחר מכן, להעלות את הצינורות עד שהזחל הוא מרחק מתאים מתחתית התא (~ 100 מיקרומטר).
- שימוש במכשיר מיצוב XYZ המצורף הבקר האורך, להתאים את אורך צינור הבקר לאורך ציר Y כדי ליישר את ציר הזמן של הזחל עם ציר האורך של הצינור מתמר כוח.
5. חיל שיא במהלך התכווצות עווית מקסימלי
- הזז את מנגנון הבדיקה לבמה של מיקרוסקופ הפוכה.
- כוון את טמפרטורת החדר לערך רצוי. כדי להתחיל, להתחבר סירקולטור המים באמבטיה, מדחום, ובקר טמפרטורה למנגנון הבדיקה. הפעל את כל מרכיבים הדרושים ולשנות את ההגדרה בטמפרטורה contrOller עד המדחום מדווח את הערך הרצוי. הנתונים הכלולים במאמר זה נאספו של 25 מעלות צלזיוס, אבל גם מדידות עשויות להתבצע על RT או על 28.5 ° C.
- לחבר את הכבלים מהממריץ למנגנון הבדיקה. הפעל את כוח ממריץ, אבל לא לעורר את הזחל עד שלב 5.6.
- ודא את הזחל הוא מקביל לתחתית התא. דרך אובייקטיבי 40X, להציג את החלק של הזחל בין קצוות של הצינורות. אם במקביל לתחתון, בשני הקצוות של הזחל יהיו בפוקוס. במידת צורך, להתאים את הצינור מתמר כוח לאורך ציר ה-Z עד ששני קצותיו נמצאים בפוקוס.
- ודא שאורך הזחל הוא קצר יותר מלהיות אופטימלי. הפעל את מערכת אורך sarcomere וידאו ולסובב את מצלמת וידאו כך שהפסים מקבילים לצדדים של מסגרת וידאו. מערכת זו מנטרת את מרווח striation על ידי ניתוח שינויים בעוצמת פיקסל לאורך כל שורה אופקית של פיקסלים בתוך אזור מוגדר משתמש של עניין(החזר על השקעה). את התוצאות עבור כל השורות בתוך את ההחזר על ההשקעה הן ממוצעים ודיווחו בתדירות שווה ערך לקצב פריימים (≥ 80 שניות -1) וידאו. מרווח striation משמש כמדד לאורך sarcomere.
- התאם מיקרוסקופ כדי להתמקד בסיבים היקפיים ולציין את אורך sarcomere המצוין. אם יש צורך, להשתמש במכשיר מיצוב XYZ המצורף הבקר האורך להתאים אורך של הזחל (ציר ה-X) עד שאורך sarcomere הוא פחות מאופטימלי (1.90 מיקרומטר לדוגמה).
- התאם את הגירוי הנוכחי כדי לייעל את כוח העווית. כדי להתחיל, להגדיר את התפוקה הנוכחית על ממריץ לעצמה נמוכה (למשל 100 MA). ממריץ יכול להיות מופעל באופן ידני או על ידי מחשב בו פועל תכנית LabVIEW מותאמת אישית. לעורר עווית של שרירי הזחל עם דופק נוכחי של 0.2 אלפיות שני בזמן.
- השתמש אוסצילוסקופ כדי להקליט את תפוקת כוח ולמדוד את כוח עווית השיא באמצעות הסמנים של אוסצילוסקופ. להגביר את הזרםעל ידי 50 במרווחים תואר שני ולמדוד את כוח עווית השיא בכל רמה נוכחית. לחכות 30 שניות בין פרכוסים כדי למנוע עייפות. כתוצאת מגדילה הנוכחית גירוי, כוח עווית שיא בדרך כלל מגביר למקסימום ולאחר מכן יורד בהדרגה. הנוכחי שבו הזחל מייצר כוח הגדול ביותר הוא גירוי האופטימלי הנוכחי. קבע את משרעת הנוכחית לגירוי האופטימלי הנוכחי.
- שימוש במכשיר מיצוב XYZ, להתאים את האורך של הזחל (ובכך, אורך sarcomere) כדי לעורר כוח עווית מרבי. זחלי דג הזברה פראי סוג (3-7 DPF) לייצר כוח מרבי עווית באורכי sarcomere של 2.10 מיקרומטר או מיקרומטר 2.15. עם זאת, אורך sarcomere ניתן להגדיר 2.08 מיקרומטר, כדי למנוע עומס יתר על הזחל.
- לעורר עווית של שרירי הזחל. השתמש אוסצילוסקופ כדי להקליט את תגובת כוח ולשמור את הרשומה לניתוח שלאחר מכן.
6. למדוד ממדים שרירים עם זחל באורך אופטימלי
Representative Results
בזחלי דג הזברה פראי סוג בריאים, סיבי השריר צריכים להיות מקבילים אחד לשני בלי פערים גדולים ביניהם ויש להם פסים מאליו (איור 5 א). זחלי דג הזברה פראי מסוג שאינו מציגים תכונות אלה, או עם נזק ניכר כגון סיבים מנותקים (איור 5), אמורים להיות מושלכים.
עלילת נציג של כוח עווית שיא לעומת גירוי נוכחי לזחל דג הזברה אחת מוצגת באיור 6. לזחלי דג הזברה פראי מסוג שבין 3-7 DPF, הגירוי האופטימלי הנוכחי היא בדרך כלל בין 400-600 מיליאמפר, עם זחלי DPF 3 בדרך כלל דורשים גירוי יותר מאשר נוכחי זחלי DPF 6-7.
נתוני כוח הגלם (נאסף במהלך שלב 5.8) יש להיות מעובד ומנותח עם תוכנה לניתוח נתונים. ראשית, נקודת ההתחלה של שיא כוח מוגדרת כאפס. שנית, מתח היציאה של מתמר כוח מומרת לתוקף (מ 'N) (ראה הוראות יצרן כדי ליצור עקומת כיול למתמר כוח). תגובת כוח נציג נאספה במהלך התכווצות עווית מקסימלי של זחל אחד מוצגת באיור 7. תוכנת ניתוח הנתונים ניתן להשתמש כדי למדוד את שיא כוח ותכונות אחרות של כוח התגובה.
סט נציג נתוני שיא כוח מהתכווצויות עווית מקסימלי מוצג באיור 8 א. ערכים אופייניים שיא עווית כוח למגוון פראי סוג 3-7 DPF זחלי 0.9-1.7 Mn, עם זחלים מבוגרים יותר לייצר יותר כוח מאשר זחלים צעירים. הבדלים בכוח עווית שיא יכולים להיות בגלל תהליכים נורמלים כמו גדילה והתפתחות (איור 8) או תהליכים חריגים כגון גן הפתולוגיה הקשורה למוטציה 21,22.
נורמליזציה בשטח חתך שריר (CSA) יכולה לשמש כדי לקבוע את המידה שבה הבדלים בכוח עווית שיא הם פשוט בגלל differe nces בגודל של 21,22 שרירים. ניתן להעריך CSA השריר תוך שימוש בנוסחה: CSA = π (/ 2) (ב / 2), שבו הוא הגובה של השרירים כמו במבט מהצד, B הוא הרוחב של השרירים כפי שנצפה מחלקו התחתון, וחתך אליפטי הנחה. ערכי CSA אופייניים עבור מגוון זחלי DPF 3-7 פראי סוג 0.027-0.034 2 מ"מ, עם זחלי DPF 3-4 בדרך כלל מראים ערכי CSA קטנים יותר מאשר זחלי DPF 5-7. סט נציג נתוני שיא כוח מנורמל מהתכווצויות עווית מקסימליים מוצג בתרשים 8. ערכים אופייניים מנורמלים שיא עווית כוח למגוון פראי סוג 3-7 DPF זחלי 34-51 MN / 2 מ"מ, עם זחלי DPF 4-7 בדרך כלל מראים ערכים גדולים מזחלי DPF 3.
איור 1. לולאת תפר. חיצים מצביעים על זנבות לולאת התפר.
איור 2. () מנגנון בדיקה עם רכיבים שכותרתו. (B) תקריב נוף של תא הניסוי. (א) תא ניסוי עם תחתית שקופה. (ב) מתמר כוח. מיצוב התקנים (ג) הבקר אורך. (ד) XYZ. X, Y, Z והצירים מוגדרים בפינה הימנית העליונה. (ה) מערכת בקרת טמפרטורת ניצול מודולים תרמואלקטרי. צינורות להכיל זרימת מים לקירור של מודולים תרמואלקטרי. (ו) צינור נירוסטה מחובר לכפות מתמר. (ז) צינור נירוסטה מחובר לאורך הבקר. אלקטרודות צלחת מקבילות (ח) microprobe המדחום. (I) Platinum, פורש את אורכו שלקאמרי. צלחות פלטינה הן 2.5 מ"מ גבוה ו0.255 מ"מ עובי.
איור 3. קשירת זחל לתא ניסוי. () זחל קשור בסוף קדמי אבל עדיין לא סובב 90 מעלות. (ב ') לאחר שזחל 90 סובב °. (ג) הזחל קשור בקצה אחורי אך עדיין לא הסתובב. (ד') לאחר שהזחל זנבות לולאה הסתובבו ותפר הם גזומים.
איור 4. מדידות להערכת שטח חתך. שרירים כפי שנצפו מ() והצד (ב ') תחתון> גרם. מיקום של הקווים האדומים מציין את מיקומו של הפתח ואברי המין. אורך הקווים האדומים מציין את הגובה והרוחב של השרירים כמו במבט מהצד והתחתון בהתאמה.
איור 5. תצוגה לרוחב של שרירי תא מטען זחלי דג הזברה. () רקמה בריאה. (ב ') עם רקמות נזק ניכר. Contractures נובע מפלוגות סיבים מסומנים בכוכביות.
איור 6. עלילת נציג של כוח עווית שיא לעומת גירוי נוכחי. הנוכחית הגירוי האופטימלי היא 500 אמפר.
e = "תמיד"> 
איור 7. שיא כוח נציג להתכווצות עווית אחת. התכווצות זו שהושרו עם דופק גירוי ב0 אלפיות שני. שיא כוח הוא 1.56 Mn.
איור 8. נתוני כוח נציג 3-7 זחלי DPF. () נתוני שיא כוח מהתכווצויות עווית מקסימליים. (ב ') נתונים שיא כוח מהתכווצויות עווית מקסימליים מנורמל CSA. זחלים בוגרים (6-7 DPF) הואכלו Hatchfry Encapsulon כיתה 0 עם ספירולינה (Argent מעבדות) החלו ב -5 בDPF. אמצעי + סטיות תקן מדווחים עם N = 5 בכל קבוצה. קבוצות שונות באופן משמעותי מזחלי DPF 3 (*) ו4 זחלי DPF (#) מצוינות (ANOVA, p <0.05). העלייה המשמעותית בכוח מנורמל בין 3 ל -4 DPF (ב ') מצביעה על גידול ביכולת הפקת כוח הפנימית במהלך פרק זמן זה, ואילו העלייה בכח בין 4 ל 6-7 DPF () מיוחסת לצמיחה מבוססת על שום לשנות 4 עד 7 DPF בכוח מנורמל.
Discussion
שיטה זו מודדת דור תוקף במהלך עווית כדי להעריך את תפקוד שריר בשרירי תא מטען של זחלי דג הזברה. למרות התכווצויות tetanic יכולות להיות שהושרו בזחלי דג הזברה (למשל על ידי 200 פעימות גירוי / שני לתקופה של 0.2 שניות), כוח tetanic המרבי הוא רק 10-15% יותר מאשר כוח העווית המרבי. לכן, כוח שנוצר במהלך עווית הוא מידה סבירה של יכולת ייצור כוח. עוויתות עדיפות על התכווצויות tetanic בגלל פרכוסים נוטים פחות לגרום לקריעה או החלקה בקשרי התפר.
כדי להפיק נתונים משמעותיים עם טכניקה זו, עווית כוח מרבי צריך להיות מושגת לכל זחל והשונות בין קבוצות ניסוי צריכים להיות ממוזערים. עם מטרות אלה בחשבון, אנו מציעים את ההצעות הבאות. ראשית, לטפל בעת קשירת הזחל למתמר כוח ואת הצינורות באורך הבקר. אם לולאות התפר הם הידק מדיהרבה, התפר יהיה לחתוך את רקמת השריר. אם לולאות התפר לא הידק מספיק, כוח שנוצר על ידי הזחל לא יועבר במלואו למתמר כוח. שני מצבים, אבל בעיקר באפשרות השנייה, אל תזלזלו בכוח העווית מרבי. שנית, מאז בדיקת קבוצות ניסוי מרובות יכול לקחת כמה שעות (20-30 דקות / זחל), חלופיות בין קבוצות בגלל זחלים ימשיכו לפתח במהלך תקופת הבדיקה.
בעוד שחלק מהציוד שהוזכר הוא חיוני למדידת כוח העווית המרבית (מתמר כוח למשל, ממריץ נוכחי), פריטים אחרים הם לא הכרחיים. מערכת אורך sarcomere וידאו רצויה אבל לא חובה. כחלופה, ניתן להשתמש בסדרה של פרכוסים למצוא אורך אופטימלי, שבמהלכו אורכו של הזחל מותאם עד עווית כוח מרבי מושגת. מערכת בקרת טמפרטורה היא גם לא הכרחית. בקרת טמפרטורה היא קריטית כאשר מאהקינטיקה עווית Suring, שהם רגישים מאוד לטמפרטורה, ואילו כוח העווית מרבי הוא לא רגיש במיוחד לשינויים קטנים בטמפרטורה ובניתן היה למדוד בטמפרטורת חדר. שים לב שללא קשר לטמפרטורה בתא במהלך בדיקת כוח, יש לשמור את הזחלים בטמפרטורת הצמיחה האופטימלית של 28.5 מעלות צלזיוס 24 לפני לכפות בדיקה להיערכות מדויקת.
הזחלים נבדקים בתמיסה המכילה Tyrodes tricaine. אנו משתמשים 0.02% (w / v) tricaine, הריכוז מומלץ להרדמה 24, כדי לחסל את ההתכווצויות ספונטניות עוררו על ידי מערכת עצבים ובכך למנוע עייפות במהלך בדיקת כוח. Tricaine גם מאפשר לקשור על הצעד ומצמצם את זמן בדיקה כולל. עם זאת, אנו צופים שכוללים tricaine בפתרון בדיקת עקביות מפחית את כוח המרבי העווית בכ -30%. השפעה דומה גם נצפתה בשריר זנב ראשן, שם tricaine מצטמצם דור תוקף לאחר שידור התוקפת היה חסום, מה שמרמז שיש tricaine השפעה ישירה על שרירים 25. Tricaine עשוי להפחית את רגישות תאי שריר על ידי הפחתת מוליכות נתרן על פני קרום התא, כפי שהיא עושה בתאי עצב 26. אפשרויות אחרות לחסימת הפעלה על ידי motoneurons הן D-tubocurarine וα-bungarotoxin אבל, שלא כמו tricaine, תרכובות אלה אינן עור חדירה וחייבים להיות מוזרקים ישירות לתוך הראש, בעמוד השדרה, או לב 27. חוקרים בודדים יצטרכו להעריך האם או לא tricaine רצוי עבור היישום הספציפי שלהם. אם tricaine כלול בפתרון הבדיקה, הריכוז צריך להיות עקבי בין ניסויים וחוקרים צריכים לוודא שההשפעה של tricaine אינו משתנה בין קבוצות ניסוי.
אנו מתארים שיטה זו לזחלים צעירים כ3 DPF ועתיק כמו 7 DPF כ. אמנם מופיעים סיבי שריר להיות פוnctional מוקדם ככל 17 שעות לאחר הפריה, כאשר תנועות זנב ספונטניות בגין 27, אורכו של הזנב הקצר לפני 3 DPF מעכב קשירת הזחל לציוד הבדיקה. אנחנו בדרך כלל לא לבדוק זחל לאחר 7 DPF מאז מודלים מחלה רבים לא שורדים זמן רב יותר מהזמן הזה. אם בדיקת זחלים מעבר 5 DPF, צריכים להיות מוזנים הזחלים. ראינו כי יש לי זחלים יאכילו שרירים קטנים יותר וליצור כוח עווית פחות ממקסימום הזחלים נמאס, כנראה עקב צמצום השק החלמון. ולכן זה עשוי להיות רצוי לבדוק זחלים בין 3-5 DPF, כדי למנוע את המשתנה הנוסף של האכלה חיצונית.
לסיכום, אנו מתארים שיטה כמותית ואמינה למדידת דור תוקף במהלך התכווצות עווית שריר מקסימלי של תא מטען הזחל דג הזברה. בשיטה זו ניתן להשתמש כדי להעריך את בריאותו הכללית של שריר הזחל דג הזברה ובאופן ספציפי מספקת מידע על תפקוד שרירים. בנוסף לאספקת מידע עלסדר גודל של דור כוח, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי ללמוד את הקינטיקה של דור כוח או להיות מותאם ללמוד שריר עייפות 22. למרות שאנו מתארים טכניקה זו לשימוש עם פראי סוג זחלים, שיטה זו יכולה לשמש לזחלים מהונדסים גנטיים או לזחלים שטופלו בתרופות או toxicants, לאפיין מודלים מחלת שריר ולהעריך את הטיפולים, או ללמוד פיתוח שרירים, פגיעה בשרירים, או רעילות כימית שריר בנושא.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
המחברים מודים אנג'לה Busta לקבלת סיוע בדג זברת בעלי. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומי לבריאות (AG-020,591 לSVB ו1K08AR054835 לJJD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Tricaine powder | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| EQUIPMENT | |||
| Nonsterile-suture | Ashaway Line Twine | S30002 | USP 10/0 monofilament nylon (3 ply) |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | Vannas |
| Stereo microscope | Leica Microsystems | MZ8 | Illuminated with Fostec EKE ACE I light source |
| Force transducer |  Aurora Scientific |
400A | |
| Length controller | Aurora Scientific |
318B | |
| XYZ positioning devices | Parker Hannifin | 3936M | |
| Thermometer | Physitemp | BAT-12 | |
| Disposable transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-9AM | Cut end to widen opening and facilitate larva transfer |
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-11YZ | |
| Glass pipette | Fisher Scientific | 13-678-8B | Cut end (and fire-polish) to widen opening and facilitate larva transfer |
| Inverted microscope | Carl Zeiss Microscopy | Axiovert 100 | |
| Water bath circulator | Neslab Instruments | RTE-111 | |
| Temperature controller | Alpha Omega Instruments | Series 800 | |
| Stimulator | Aurora Scientific |
701C | High-power, follow stimulator |
| Video sarcomere length system | Aurora Scientific |
900B-5A | |
| LabVIEW software | National Instruments | ||
| Oscilloscope | Nicolet Technologies | ACCURA 100 | |
| Microblade | Fine Science Tools | 10050-00 | |
| Microblade holder | Fine Science Tools | 10053-13 | |
| Data analysis software (Signo) | Alameda Applied Sciences | ||
References
- Bassett, D. I., Bryson-Richardson, R. J., Daggett, D. F., Gautier, P., Keenan, D. G., Currie, P. D. Dystrophin is required for the formation of stable muscle attachments in the zebrafish embryo. Development. 130 (23), 5851-5860 (2003).
- Nixon, S. J., Wegner, J., et al. Zebrafish as a model for caveolin-associated muscle disease; caveolin-3 is required for myofibril organization and muscle cell patterning. Hum. Mol. Genet. 14 (13), 1727-1743 (2005).
- Hall, T. E., Bryson-Richardson, R. J., et al. The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin α2-deficient congenital muscular dystrophy. PNAS. 104 (17), 7092-7097 (2007).
- Hirata, H., Watanabe, T., et al. Zebrafish relatively relaxed mutants have a ryanodine receptor defect, show slow swimming and provide a model of multi-minicore disease. Development. 134, 2771-2781 (2007).
- Dowling, J. J., Vreede, A. P., et al. Loss of myotubularin function results in t-tubule disorganization in zebrafish and human myotubular myopathy. PLoS Genet. 5 (2), e1000372 (2009).
- Berger, J., Berger, S., Hall, T. E., Lieschke, G. J., Currie, P. D. Dystrophin-deficient zebrafish feature aspects of the Duchenne muscular dystrophy pathology. Neuromuscul. Disord. 20 (12), 826-832 (2010).
- Kawahara, G., Guyon, J. R., Nakamura, Y., Kunkel, L. M. Zebrafish models for human FKRP muscular dystrophies. Hum. Mol. Genet. 19 (4), 623-633 (2010).
- Wallace, L. M., Garwick, S. E., et al. DUX4, a candidate gene for facioscapulohumeral muscular dystrophy, causes p53-dependent myopathy in vivo. Ann. Neurol. 69, 540-552 (2011).
- Sztal, T. E., Sonntag, C., Hall, T. E., Currie, P. D. Epistatic dissection of laminin-receptor interactions in dystrophic zebrafish muscle. Hum. Mol. Genet. , (1093).
- Kawahara, G., Karpf, J. A., Myers, J. A., Alexander, M. S., Guyon, J. R., Kunkel, L. M. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. PNAS. 108 (13), 5331-5336 (2011).
- Berger, J., Berger, S., Jacoby, A. S., Wilton, S. D., Currie, P. D. Evaluation of exon-skipping strategies for Duchenne muscular dystrophy utilizing dystrophin-deficient zebrafish. J. Cell Mol. Med. 15 (12), 2643-2651 (2011).
- Seger, C., Hargrave, M., Wang, X., Chai, R. J., Elworthy, S., Ingham, P. W. Analysis of Pax7 expressing myogenic cells in zebrafish muscle development, injury, and models of disease. Dev. Dyn. 240, 2440-2451 (2011).
- Postel, R., Vakeel, P., Topczewski, J., Knöll, R., Bakkers, J. Zebrafish integrin-linked kinase is required in skeletal muscles for strengthening the integrin-ECM adhesion complex. Dev. Biol. 318 (1), 92-101 (2008).
- Zoeller, J. J., McQuillan, A., Whitelock, J., Ho, S. Y., Iozzo, R. V. A central function for perlecan in skeletal muscle and cardiovascular development. J. Cell Biol. 181 (2), 381-394 (2008).
- Kim, H. R., Ingham, P. W. The extracellular matrix protein TGFBI promotes myofibril bundling and muscle fibre growth in the zebrafish embryo. Dev. Dyn. 238, 56-65 (2009).
- Beqqali, A., Monshouwer-Kloots, J., et al. CHAP is a newly identified Z-disc protein essential for heart and skeletal muscle function. J. Cell Sci. 123 (7), 1141-1150 (2010).
- Huang, H., Huang, C., et al. Toxicity, uptake kinetics and behavior assessment in zebrafish embryos following exposure to perfluorooctanesulphonicacid (PFOS). Aquat. Toxicol. 98 (2), 139-147 (2010).
- Sylvain, N. J., Brewster, D. L., Ali, D. W. Zebrafish embryos exposed to alcohol undergo abnormal development of motor neurons and muscle fibers. Neurotoxicol. Teratol. 32 (4), 472-480 (2010).
- Chandrasekar, G., Arner, A., Kitambi, S. S., Dahlman-Wright, K., Andersson-Lendahl, M. Developmental toxicity of the environmental pollutant 4-nonylphenol in zebrafish. Neurotoxicol. Teratol. 33 (6), 752-764 (2011).
- Buss, R. R., Drapeau, P. Activation of embryonic red and white muscle fibers during fictive swimming in the developing zebrafish. J. Neurophysiol. 87 (3), 1244-1251 (2002).
- Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation. Dis Model Mech. 5, 389-396 (2012).
- Dowling, J. J., Arbogast, S., et al. Oxidative stress and successful antioxidant treatment in models of RYR1-related myopathy. Brain. 135 (4), 1115-1127 (2012).
- Dou, Y., Andersson-Lendahl, M., Arner, A. Structure and function of skeletal muscle in zebrafish early larvae. J. Gen. Physiol. 131, 445-453 (2008).
- Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , Univ. of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2000).
- Herr, V. D., Sonnenburg, D. C., Courogen, P. M., Fiamengo, S. A., Downes, H. Muscle weakness during tricaine anesthesia. Comp Biochem Physiol Part C. 110 (3), 289-296 (1995).
- Frazier, D. T., Narahashi, T. Tricaine (MS-222): effects of ionic conductances of squid axon membranes. Eur. J. Pharmacol. 33 (2), 313-317 (1975).
- Saint-Amant, L., Drapeau, P. Time course of the development of motor behaviors in the zebrafish embryo. J. Neurobiol. 37 (4), 622-632 (1998).
