Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Force Measurement under kontraktion att bedöma muskelfunktion i zebrafisk larver

doi: 10.3791/50539 Published: July 23, 2013

Summary

Force mätningar kan användas för att påvisa förändringar i muskelfunktion grund för utveckling, skada, sjukdom, behandling eller kemisk toxicitet. I denna video visar vi en metod för att mäta kraft under en maximal kontraktion av zebrafisk larver bålen muskeln.

Abstract

Zebrafisk larver ger modeller av muskel utveckling, muskelsjukdom och muskel-relaterad kemisk toxicitet, men liknande studier ofta saknar funktionella åtgärder för muskel hälsa. I denna video artikeln visar vi en metod för att mäta kraft generation under kontraktion av zebrafisk larver bålen muskeln. Force mätningar åstadkommes genom att placera en sövd larv in i en kammare fylld med en saltlösning. Den främre änden av larven är bunden till en kraftomvandlare och den bakre änden av larven är knutet till en längd controller. En isometrisk rycka kontraktion framkallas av elektriska fältet stimulering och kraften svaret registreras för analys. Force generation under kontraktion ger ett mått på total muskel hälsa och specifikt ger ett mått på muskelfunktion. Även om vi beskriva denna teknik för användning med vildtyp larver, kan denna metod användas med genetiskt modifierat larverna eller med larver behandlas med läkemedel eller gifter,att karaktärisera modeller muskelsjukdom och utvärdera behandlingar, eller att studera muskel utveckling, skada, eller kemisk toxicitet.

Introduction

Young zebrafisk (Danio rerio) larver, 3-7 dagar efter befruktning (DPF), erkänns alltmer som en användbar organism för skelettmuskulaturen forskning. Unga larver används för att modellera människans muskelsjukdom 1-9, utvärdera läkemedel och terapeutiska strategier 10-11, studera muskelskada 12, förstår muskelutveckling 13-16, och undersöka muskel-relaterad kemisk toxicitet 17-19. Typiska studier i dessa områden att undersöka i vilken grad friska muskler görs onormal genom genetisk manipulation eller exponering för toxiska ämnen, och vissa studier undersöker i vilken grad onormal muskel svarar på behandlingen. Kritisk till framgång för dessa studier är förmågan att korrekt bedöma muskel hälsa.

Medan det finns en mängd olika metoder som finns för att bedöma muskel hälsa i zebrafisk larver, få ge direkt information om muskelfunktion. Muscle hälsa brukar utvärderas av appearance, som bedömt av histologisk färgning 6,8,11, immunfärgning 9,15,16,18, ljusmikroskop 3,13, elektronmikroskopi 3,4,14,16 eller dubbelbrytning 7,9,11, men dessa tekniker ger morfologisk information. Trunk och förskjutningar svans och simning hastighet 4,17 utvärderar motoriken, men dessa är inte direkta åtgärder av muskelfunktion eftersom de också avspeglar neural input, energiomsättning, och andra processer.

Däremot mäter kraft generation under kontraktion ger en direkt bedömning av muskelfunktion och utgör ett mått på total muskel hälsa. Ytterligare fördelar med detta tillvägagångssätt är enkla dataanalys och kvantitativa resultat. I denna video artikeln ger vi ett detaljerat förfarande för mätning av kraft generering av larver muskler, i hopp om att fler forskare kommer att använda denna metod för att komplettera befintliga åtgärder för muskel hälsa i sin forskning.

För att vara tydlig, mäter denna teknik inte krafter som genereras av larver musklerna under simning. Eftersom båda ändarna av larven är bundna till utrustning och eftersom larven förblir sövda, kan det inte initiera rörelse under testningen. Vidare aktiverar fältstimulering alla muskelfibrer samtidigt att inducera en miljarderateral kontraktion, vilket inte är vad naturligt förekommer 20. Därför, snarare än att mäta de faktiska krafter som alstras under simning, bestämmer denna teknik förmågan kraftgenererande av de larver muskler.

Vi har använt denna teknik för att demonstrera muskelsvaghet i en zebrafisk modell av nemaline myopati 21, såväl som för att utvärdera effekten av antioxidantbehandling på muskelfunktion i en zebrafisk modell av multi-MiniCore sjukdom 22. Andra har använt en liknande teknik 23 för att undersöka effekterna av en miljöförorening på muskelfunktion 19.

Protocol

Obs: alla förfaranden som rör zebrafisk bör utföras i enlighet med gällande riktlinjer, förordningar och tillsynsmyndigheter. Alla animaliska använder förfaranden som anges i denna artikel godkändes av University of Michigan kommitté om användning och skötsel av djur (UCUCA).

Ett. Gör Suture Loops

  1. Använd pincett för att separera icke-steril sutur (USP 10/0 monofilament nylon, 3 skikt) i tre delar.
  2. Börja att knyta en dubbel överhandsknop i en av strängarna. Stanna innan du drar åt knuten helt för att göra en liten (~ 1 mm diameter) slinga istället för en knut.
  3. Använd en sax för att klippa överskott sutur från slingan svansar. Ett exempel på en färdig slinga visas i figur 1.
  4. Placera öglan på den klibbiga sidan av en post-it lapp för senare användning. Suturen slingor kommer att användas för att hålla larver på plats under kraft testning.
  5. Upprepa steg från 1,1 till 1,4 vid behov. Make två sutur slingor för varje larv som ska testas.

2. Gör Testing Solution

  1. Gör Tyrodes lösning genom att tillsätta 7,977 g natriumklorid, 0,373 g kaliumklorid, 0,265 g kalciumkloriddihydrat, 0,102 g magnesiumkloridhexahydrat, 0,048 g natriumfosfat monobasisk, 1,000 g natriumbikarbonat och 0,037 g etylendiamintetraättiksyra dinatriumsaltdihydrat till 1000 ml renat vatten.
  2. Rör om lösningen tills salterna är fullständigt upplöst. Denna lösning kan lagras under en månad vid 4 ° C.
  3. Lägg 2,1 ml av 4 mg / ml tricaine, framställd enligt zebrafisk Bok 24, till 47,9 ml Tyrodes lösning och blanda. Skydda denna lösning från ljus genom att förvara den i en mörk glasflaska eller i en glasflaska täckt med aluminiumfolie. Denna lösning ska förvaras i rumstemperatur och gjort färskt varje dag.

Tre. Tie Aanesthetized Larva in Experimental avdelningen

    <li> Placera testa apparaten (figur 2) på scenen av en stereolupp.
  1. Anslut kraftgivare och längd kablarna controller till testapparaturen. Slå på kraftgivare. Slå på längden kontrollenheten så att det förblir stel. (Notera:.. Längden styrenheten ger möjlighet att sträcka ut eller förkorta en muskel preparat under en kontraktion Dock är denna funktion av längden regulatorn inte används i metoden som beskrivs häri Därför kan längden controller ses som en styv infästning led monterad på en XYZ positioneringssystem).
  2. Med en disponibel överföringspipett, fyll den experimentella kammare med testlösning.
  3. Använd pincett för att plocka upp en suturslinga av en av svansarna och hänga den på kraftgivare röret. Häng en andra suturslinga på rör fäst till längden styrenheten. (Obs: gripa en suturslinga på den böjda delen kan vikas suturen och CauSE den att brytas under efterföljande steg).
  4. Med en disponibel överföring pipett en zebrafisk larv till en liten petriskål fylld med testlösning. Vänta på bedövningsmedel i test lösningen (tricaine) att träda i kraft (~ 1 min). Med en pincett försiktigt knuffa svansen och verifiera att larven är bedövades genom en brist av beröring frammanade-simning.
  5. Använd en glaspipett att överföra larven till den experimentella kammaren.
  6. Genom att försiktigt nudging larven med slutna pincett, styra den främre delen av larven genom suturslinga på kraftomvandlare röret. Guide den främre delen av larven genom suturslinga på röret. Ta tag i båda svansar suturslinga med pincett och dra dem samtidigt att dra åt suturslingans posteriort gulesäcken eller simblåsan (Figur 3A).
  7. Med en pincett, håll en svans suturslinga och dra, vilket gör att larven att svänga 90 ° runt röret tills den laterala sidan av larven ansiktes upp (Figur 3B). Om slingan har dragits åt tillräckligt, kommer det att finnas ett visst motstånd till pull, larven bör inte vridas lätt. Om slingan skärptes för mycket, kommer larven svänga inte runt röret.
  8. Använda XYZ positionering enhet ansluten till längden controller, flytta rörlängden controller längs X-axeln (axel definitionerna i figur 2A) och under bålen och svansen av larven. Lämna utrymme mellan ändarna av längden controller röret och kraftgivare röret.
  9. Guide suturslinga över svansen av larven och dra åt suturslinga som tidigare beskrivits (figur 3C). Du kan behöva vrida den bakre delen av larven så att den laterala sidan är vänd uppåt. Trimma svansar suturslinga (Figur 3D).

4. Position Larv i experimentell kammare

  1. Flytta larv till ett lämpligt avstånd från kammarens botten för att säkerställa larven will vara inom "arbetsavstånd" av ett inverterat mikroskop mål under efterföljande steg. För att åstadkomma detta använder XYZ positioneringsanordningar att sakta sänka rören (med bifogad larv) längs Z-axeln tills rören bara röra vid botten av kammaren. Höj sen rören tills larven är ett lämpligt avstånd från kammaren botten (~ 100 mikrometer).
  2. Använda XYZ positioneringsanordningen fäst till längden controller, justera rörlängden styrenheten längs Y-axeln för att rikta den långa axeln av larven med den långa axeln av kraftomvandlare röret.

Fem. Record kraft under en maximal Twitch kontraktion

  1. Flytta testapparaten till stadiet för ett inverterat mikroskop.
  2. Justera kammartemperaturen till ett önskat värde. Till att börja, anslut cirkulatorn vattenbad, termometer och temperaturregulator till testapparaten. Slå på nödvändiga komponenter och justera inställningen på temperaturen kontroller tills termometern rapporterar det önskade värdet. Uppgifter som ingår i den här artikeln samlades vid 25 ° C, men mätningar kan också göras vid RT eller vid 28,5 ° C.
  3. Anslut kablarna från stimulatorn till testapparaturen. Slå på strömmen till stimulatorn men inte stimulera larven tills steg 5.6.
  4. Se till larven är parallell med kammarens botten. Genom ett 40X objektiv, visa den del av larven mellan ändarna på rören. Om parallellt med botten, kommer båda ändarna av larven vara i fokus. Om det behövs, justera röret kraftgivare längs Z-axeln tills båda ändarna är i fokus.
  5. Kontrollera att larven längd är kortare än optimal. Slå på videon sarcomeren längd systemet och rotera videokamera så att strimmor är parallella med sidorna av videobildruta. Detta system övervakar striation avstånd genom att analysera variationer i pixelintensiteten längs varje horisontell rad av bildpunkter inom en användardefinierad region av intresse(ROI). Resultaten för alla rader inom ROI i medeltal och rapporterades med en frekvens som motsvarar video frame-rate (≥ 80 sek -1). Den striation avståndet används som en indikator på sarcomere längd.
  6. Justera mikroskopet för att fokusera på perifera fibrer och notera den angivna sarcomeren längd. Om det behövs, använd XYZ positionering enhet ansluten till längden för att justera längden på larven (X-axel) tills sarcomere längd är mindre än optimalt (t.ex. 1.90 pm).
  7. Justera stimuleringsströmmen att optimera rycka kraft. Till att börja ställa in produktionen strömmen på stimulatorn till en låg magnitud (t.ex. 100 mA). Stimulatorn kan utlösas manuellt eller med en dator som kör en anpassad LabVIEW program. Framkalla en ryckning av larver musklerna med en aktuell puls på 0,2 ms i varaktighet.
  8. Använd ett oscilloskop för att spela in kraften ut och mäta toppen rycka kraft med oscilloskopet s markörer. Öka den nuvarandemed 50 mA steg och mäta toppen rycka kraft vid varje aktuell nivå. Vänta 30 sekunder mellan ryckningar att förhindra trötthet. Som stimulans strömmen ökar, ökar peak rycka kraft typiskt till ett maximum och sedan gradvis minskar. Strömmen vid vilken larven alstrar den största kraften är den optimala stimuleringsströmmen. Ställ in aktuell amplitud till optimal stimuleringsströmmen.
  9. Använda XYZ positioneringsanordning, justera längden av larven (och därmed, sarcomere längd) för att framkalla maximal rycka kraft. Vild-typ zebrafisk larver (3-7 DPF) generera maximal rycka kraft vid sarcomere längder på 2.10 pm eller 2.15 pm. Emellertid kan sarcomere längd ställas in på 2,08 ^ m för att undvika överbelastade vid larven.
  10. Framkalla en ryckning av larver muskler. Använd oscilloskopet att notera den kraft respons och sparar posten för efterföljande analys.

6. Mät Muskulatur Mått med Larva vid optimal längd

Flytta testa apparaten tillbaka till stereolupp.
  • Använda okularet skala, mäta höjden av muskulaturen, sett från sidan. Sedan, noga med att inte ändra längden på larven, svänga larven med 90 ° med svansarna suturslinga för att se larven från botten. Mät bredden på muskulaturen sedd från botten. Ta mätningarna vid en anatomisk landmärke (t.ex. urogenital öppning) (Figur 4).
  • Skär sutur slingor med en mikroblad att frigöra larven från testutrustning.
  • Representative Results

    Hos friska vildtyp zebrafisk larver, bör muskelfibrerna vara parallella med varandra utan stora mellanrum mellan dem och har tydliga strimmor (figur 5A). Vild-typ zebrafisk larver som inte uppvisar dessa egenskaper, eller med uppenbara skador såsom fristående fibrer (Figur 5B), ska kasseras.

    En representativ kurva av topp ryckning kraft relativt stimuleringsström för en enda zebrafisk larv visas i figur 6. För vildtyp zebrafisk larver mellan 3-7 DPF, är den optimala stimuleringsströmmen vanligtvis mellan 400-600 mA, med 3 DPF larver i allmänhet kräver större stimulans ström än 6-7 DPF larver.

    De råa kraftdata (samlas in under steg 5.8) måste bearbetas och analyseras med dataanalys programvara. Det första är baslinjen för den kraft som sattes till noll. Det andra är spänningen utsignalen från kraftomvandlaren omvandlas för att tvinga (mN) (se tillverkarens instruktioner för att generera en kalibreringskurva för kraftomvandlare). En representativ kraft respons som samlas in under en maximal ryckning sammandragning av en enstaka larv visas i figur 7. Dataanalys programvara kan användas för att mäta maximal kraft och andra funktioner i kraft svaret.

    Ett representativt urval av toppkraft data från maximal rycka sammandragningar visas i figur 8A. Typiska topp rycka kraftvärdena för vild-typ 3-7 DPF larver intervallet 0,9-1,7 mN, med äldre larver generera mer kraft än yngre larver. Skillnader i topp rycka kraft kan bero på normala processer som tillväxt och utveckling (Figur 8) eller onormala processer såsom genmutation-relaterad patologi 21,22.

    Normalisering genom muskel tvärsnittsarea (CSA) kan användas för att bestämma i vilken grad skillnader i topp twitch kraft är helt enkelt beror på differe NCES i storlek av muskulaturen 21,22. Muscle CSA kan uppskattas med användning av formeln: CSA = π (A / 2) (B / 2), där A är höjden av muskulaturen som sett från sidan, B är bredden av muskulaturen sedd från botten, och ett elliptiskt tvärsnitt antas. Typiska CSA värden för vild-typ 3-7 DPF larver intervallet 0,027-0,034 mm 2, med 3-4 DPF larver i allmänhet visar mindre CSA värden än 5-7 DPF larver. En representativ uppsättning normaliserade toppkraft data från maximal rycka sammandragningar visas i figur 8B. Typiska normaliserade topp rycka kraftvärdena för vild-typ 3-7 DPF larver intervallet 34-51 mN / mm 2, med 4-7 dpf larver generellt visar högre värden än 3 DPF larver.

    Figur 1
    Figur 1. Suture loop. Pilarna pekar på svansar suturslinga.

    ve_content "fo: keep-together.within-sida =" alltid "> Figur 2
    Figur 2. (A) Provning apparat med märkta komponenter. (B) närbilder av den experimentella kammaren. (A) Experimentell kammare med transparent botten. (B) kraftgivare. (C) Längd controller. (D) XYZ anordningar för positionering. X, Y, och Z-axeln definieras i det övre högra hörnet. (E) System för temperaturkontroll använder termoelektriska moduler. Slangar rymmer vattenflödet för nedkylning av termoelektriska moduler. (F) Rostfria rör fäst kraftgivare. (G) Rostfria rör fäst längd controller. (H) Termometer mikrosond. (I) Platinum parallella plattelektroder, spänner längden denkammaren. Platina plattorna är 2,5 mm höga och 0,255 mm tjock.

    Figur 3
    Figur 3. Binda larv i experimentell kammare. (A) Larva bundna på i framändan men ännu inte vridas 90 °. (B) Larva efter vridna 90 °. (C) Larva bundna på i bakre änden men ännu inte vridas. (D) Larv efter vridna och suturslinga svansar klippta.

    Figur 4
    Figur 4. Mätningar för tvärsnittsarea uppskattning. Muskulatur ses som från (A) sida och (B)

    Figur 5
    Figur 5. Lateral vy av zebrafisk larver trunk muskulatur. (A) frisk vävnad. (B) Tissue med uppenbara skador. Kontrakturer följd av fiber avdelningar är markerade med asterisker.

    Figur 6
    Figur 6. Representant tomt på topp rycka kraft kontra stimulans ström. Optimal stimulering ström är 500 mA.


    Figur 7. Representativ kraft rekord för en enda ryckning kontraktion. Denna kontraktion framkallades med en stimulans puls på 0 ms. Den maximala kraften är 1,56 mN.

    Figur 8
    Figur 8. Representativa kraftdata den 3-7 DPF larver. (A) toppkraft data från maximal rycka sammandragningar. (B) toppkraft data från maximal rycka sammandragningar normaliserats till CSA. Äldre larver (6-7 DPF) matades Hatchfry Encapsulon Grade 0 med Spirulina (Argent Laboratories) börjar på 5 DPF. Medel + är standardavvikelser redovisas med N = 5 i varje grupp. Grupper signifikant olika från 3 DPF larver (*) och 4 dpf larver (#) indikeras (ANOVA, p <0,05). Den betydande ökningen i normaliserad kraft mellan 3 och 4 dpf (B) visar en ökning av den inneboende kraften genererar kapacitet under denna tidsperiod, medan ökningen i kraft mellan 4 och 6-7 dpf (A) tillskrivs tillväxt baserad på någon ändra alltifrån 4 till 7 DPF i normaliserad kraft.

    Discussion

    Denna metod mäter kraft generation under en ryckning att bedöma muskelfunktion i bålmusklerna av zebrafisk larver. Även tetanic sammandragningar kan framkallas i zebrafisk larver (t.ex. genom 200 stimuleringspulser / sek under en period av 0,2 sek), är den maximala tetanic kraft endast 10-15% större än den maximala rycka kraft. Därför är den kraft som genereras under en ryckning ett rimligt mått av kraftgenererande kapacitet. Ryckningar är att föredra framför tetanic sammandragningar eftersom ryckningar är mindre benägna att orsaka rippning eller halka på suturen banden.

    För att generera meningsfulla data med denna teknik, bör maximal rycka kraft uppnås för varje larv och variationen mellan experimentella grupper bör minimeras. Med dessa mål i åtanke, erbjuder vi följande förslag. Först, ta hand när kopplingsförbehållet larven till kraftgivare och längden rören controller. Om sutur slingor dras åt alltförmycket, kommer suturen skär genom muskelvävnad. Om suturen slingorna inte dras åt tillräckligt, kommer den kraft som genereras av larven inte helt överföras till kraftomvandlare. Båda situationerna, men i synnerhet det sistnämnda, underskatta maximal rycka kraft. Andra kan sedan testa flera experimentella grupper ta flera timmar (20-30 min / larv), växlar mellan grupper eftersom larverna kommer att fortsätta att utvecklas under testperioden.

    Medan vissa av de nämnda utrustning är avgörande för mätning av maximal rycka kraft (t.ex. kraftgivare, aktuell stimulator), andra objekt är inte absolut nödvändigt. Videon sarcomeren längd systemet är önskvärt men inget krav. Som ett alternativ, kan en serie av ryckningar användas för att hitta optimal längd, under vilken längden av larven justeras tills maximal rycka kraft uppnås. En temperatur styrsystem är inte heller absolut nödvändigt. Temperaturreglering är kritisk när MEASuring twitch kinetik, som är mycket känsliga för temperatur, medan maximal twitch kraft inte är särskilt känslig för små förändringar i temperatur och kunde mätas vid rumstemperatur. Notera att oberoende av temperaturen i kammaren under force testning, bör larverna hållas vid optimal tillväxt temperatur på 28,5 ° C 24 före tvinga testning för exakt stadieindelning.

    Larverna testas i en Tyrodes lösning innehållande tricaine. Vi använder 0,02% (vikt / volym) tricaine, den koncentration som rekommenderas för anestesi 24, för att eliminera spontana kontraktioner framkallade av nervsystemet och sålunda förhindra trötthet under kraft testning. Tricaine underlättar också tie-på steg och minskar den totala testtiden. Dock kan vi konstatera att även tricaine i test lösningen konsekvent minskar den maximala rycka kraft med cirka 30%. En liknande effekt har också observerats i grodyngel svans muskel, där tricaiNE reducerad kraft generationen efter neuromuskulär transmission blockerades, vilket tyder på att tricaine har en direkt effekt på muskeln 25. Tricaine kan minska retbarhet muskelcell genom att minska natrium konduktans över cellmembranet, som den gör i nervceller 26. Andra alternativ för att blockera aktivering av motoneuroner är d-tubokurarin och α-bungarotoxin men till skillnad tricaine är dessa föreningar inte hud-genomsläpplig och måste injiceras direkt in i huvudet, ryggmärg, eller hjärta 27. Enskilda utredare kommer att behöva bedöma huruvida tricaine är önskvärd för sin specifika applikation. Om tricaine ingår i testningen lösningen bör koncentrationen vara konsekvent mellan experiment och forskare bör kontrollera att effekten av tricaine inte varierar mellan experimentella grupper.

    Vi beskriver denna metod för larver så unga som 3 DPF och lika gammal som 7 DPF. Även muskelfibrer verkar vara functional så tidigt som 17 timmar efter befruktningen, när spontana svans rörelser börjar 27, den korta längden på svansen före 3 DPF hindrar knyta larven till testutrustning. Vi brukar testa inte larv efter 7 DPF eftersom många sjukdomstillstånd modeller inte överlever mycket längre än denna tid. Om testning larver bortom 5 DPF, bör larverna matas. Vi har observerat att unfed larver har mindre muskler och generera mindre maximal rycka kraft än Fed larver, sannolikt på grund av den minskande gulesäcken. Således kan det vara önskvärt att testa larver mellan 3-5 DPF, för att undvika ytterligare rörlig av extern matning.

    Sammanfattningsvis beskriver vi en kvantitativ och tillförlitlig metod för att mäta kraft generering under en maximal ryckning sammandragning av zebrafisk larver bålen muskeln. Denna metod kan användas för att bedöma den allmänna hälsan hos zebrafisk larver muskler och specifikt ger information om muskelfunktion. Förutom att ge information omstorleken av kraft generation, kan denna teknik användas för att studera kinetiken av force generation eller anpassas för att studera muskeltrötthet 22. Även om vi beskriver denna teknik för användning med vildtyp larver, kan denna metod användas för att genetiskt modifierade larver eller larver behandlas med läkemedel eller gifter, för att karakterisera modeller muskelsjukdom och utvärdera behandlingar, eller att studera muskel utveckling, muskel skada, eller muskel-relaterad kemisk toxicitet.

    Disclosures

    Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

    Acknowledgments

    Författarna tackar Angela Busta för hjälp med zebrafisk djurhållning. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (AG-020.591 till SVB och 1K08AR054835 till JJD).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    REAGENTS
    Tricaine powder Sigma-Aldrich A5040
    Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653
    Potassium chloride Sigma-Aldrich P9541
    Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich 223506
    Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2670
    Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich S0751
    Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S6297
    Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate Sigma-Aldrich E5134
    EQUIPMENT
    Nonsterile-suture Ashaway Line Twine S30002 USP 10/0 monofilament nylon (3 ply)
    Forceps Fine Science Tools 11251-20 Dumont #5
    Spring scissors Fine Science Tools 15000-08 Vannas
    Stereo microscope Leica Microsystems MZ8 Illuminated with Fostec EKE ACE I light source
    Force transducer Aurora Scientific 400A
    Length controller Aurora Scientific 318B
    XYZ positioning devices Parker Hannifin 3936M
    Thermometer Physitemp BAT-12
    Disposable transfer pipette Fisher Scientific 13-711-9AM Cut end to widen opening and facilitate larva transfer
    Petri dish Fisher Scientific 08-757-11YZ
    Glass pipette Fisher Scientific 13-678-8B Cut end (and fire-polish) to widen opening and facilitate larva transfer
    Inverted microscope Carl Zeiss Microscopy Axiovert 100
    Water bath circulator Neslab Instruments RTE-111
    Temperature controller Alpha Omega Instruments Series 800
    Stimulator Aurora Scientific 701C High-power, follow stimulator
    Video sarcomere length system Aurora Scientific 900B-5A
    LabVIEW software National Instruments
    Oscilloscope Nicolet Technologies ACCURA 100
    Microblade Fine Science Tools 10050-00
    Microblade holder Fine Science Tools 10053-13
    Data analysis software (Signo) Alameda Applied Sciences

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Bassett, D. I., Bryson-Richardson, R. J., Daggett, D. F., Gautier, P., Keenan, D. G., Currie, P. D. Dystrophin is required for the formation of stable muscle attachments in the zebrafish embryo. Development. 130, (23), 5851-5860 (2003).
    2. Nixon, S. J., Wegner, J., et al. Zebrafish as a model for caveolin-associated muscle disease; caveolin-3 is required for myofibril organization and muscle cell patterning. Hum. Mol. Genet. 14, (13), 1727-1743 (2005).
    3. Hall, T. E., Bryson-Richardson, R. J., et al. The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin α2-deficient congenital muscular dystrophy. PNAS. 104, (17), 7092-7097 (2007).
    4. Hirata, H., Watanabe, T., et al. Zebrafish relatively relaxed mutants have a ryanodine receptor defect, show slow swimming and provide a model of multi-minicore disease. Development. 134, 2771-2781 (2007).
    5. Dowling, J. J., Vreede, A. P., et al. Loss of myotubularin function results in t-tubule disorganization in zebrafish and human myotubular myopathy. PLoS Genet. 5, (2), e1000372 (2009).
    6. Berger, J., Berger, S., Hall, T. E., Lieschke, G. J., Currie, P. D. Dystrophin-deficient zebrafish feature aspects of the Duchenne muscular dystrophy pathology. Neuromuscul. Disord. 20, (12), 826-832 (2010).
    7. Kawahara, G., Guyon, J. R., Nakamura, Y., Kunkel, L. M. Zebrafish models for human FKRP muscular dystrophies. Hum. Mol. Genet. 19, (4), 623-633 (2010).
    8. Wallace, L. M., Garwick, S. E., et al. DUX4, a candidate gene for facioscapulohumeral muscular dystrophy, causes p53-dependent myopathy in vivo. Ann. Neurol. 69, 540-552 (2011).
    9. Sztal, T. E., Sonntag, C., Hall, T. E., Currie, P. D. Epistatic dissection of laminin-receptor interactions in dystrophic zebrafish muscle. Hum. Mol. Genet. (1093).
    10. Kawahara, G., Karpf, J. A., Myers, J. A., Alexander, M. S., Guyon, J. R., Kunkel, L. M. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. PNAS. 108, (13), 5331-5336 (2011).
    11. Berger, J., Berger, S., Jacoby, A. S., Wilton, S. D., Currie, P. D. Evaluation of exon-skipping strategies for Duchenne muscular dystrophy utilizing dystrophin-deficient zebrafish. J. Cell Mol. Med. 15, (12), 2643-2651 (2011).
    12. Seger, C., Hargrave, M., Wang, X., Chai, R. J., Elworthy, S., Ingham, P. W. Analysis of Pax7 expressing myogenic cells in zebrafish muscle development, injury, and models of disease. Dev. Dyn. 240, 2440-2451 (2011).
    13. Postel, R., Vakeel, P., Topczewski, J., Knöll, R., Bakkers, J. Zebrafish integrin-linked kinase is required in skeletal muscles for strengthening the integrin-ECM adhesion complex. Dev. Biol. 318, (1), 92-101 (2008).
    14. Zoeller, J. J., McQuillan, A., Whitelock, J., Ho, S. Y., Iozzo, R. V. A central function for perlecan in skeletal muscle and cardiovascular development. J. Cell Biol. 181, (2), 381-394 (2008).
    15. Kim, H. R., Ingham, P. W. The extracellular matrix protein TGFBI promotes myofibril bundling and muscle fibre growth in the zebrafish embryo. Dev. Dyn. 238, 56-65 (2009).
    16. Beqqali, A., Monshouwer-Kloots, J., et al. CHAP is a newly identified Z-disc protein essential for heart and skeletal muscle function. J. Cell Sci. 123, (7), 1141-1150 (2010).
    17. Huang, H., Huang, C., et al. Toxicity, uptake kinetics and behavior assessment in zebrafish embryos following exposure to perfluorooctanesulphonicacid (PFOS). Aquat. Toxicol. 98, (2), 139-147 (2010).
    18. Sylvain, N. J., Brewster, D. L., Ali, D. W. Zebrafish embryos exposed to alcohol undergo abnormal development of motor neurons and muscle fibers. Neurotoxicol. Teratol. 32, (4), 472-480 (2010).
    19. Chandrasekar, G., Arner, A., Kitambi, S. S., Dahlman-Wright, K., Andersson-Lendahl, M. Developmental toxicity of the environmental pollutant 4-nonylphenol in zebrafish. Neurotoxicol. Teratol. 33, (6), 752-764 (2011).
    20. Buss, R. R., Drapeau, P. Activation of embryonic red and white muscle fibers during fictive swimming in the developing zebrafish. J. Neurophysiol. 87, (3), 1244-1251 (2002).
    21. Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation. Dis Model Mech. 5, 389-396 (2012).
    22. Dowling, J. J., Arbogast, S., et al. Oxidative stress and successful antioxidant treatment in models of RYR1-related myopathy. Brain. 135, (4), 1115-1127 (2012).
    23. Dou, Y., Andersson-Lendahl, M., Arner, A. Structure and function of skeletal muscle in zebrafish early larvae. J. Gen. Physiol. 131, 445-453 (2008).
    24. Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). Univ. of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2000).
    25. Herr, V. D., Sonnenburg, D. C., Courogen, P. M., Fiamengo, S. A., Downes, H. Muscle weakness during tricaine anesthesia. Comp Biochem Physiol Part C. 110, (3), 289-296 (1995).
    26. Frazier, D. T., Narahashi, T. Tricaine (MS-222): effects of ionic conductances of squid axon membranes. Eur. J. Pharmacol. 33, (2), 313-317 (1975).
    27. Saint-Amant, L., Drapeau, P. Time course of the development of motor behaviors in the zebrafish embryo. J. Neurobiol. 37, (4), 622-632 (1998).
    Force Measurement under kontraktion att bedöma muskelfunktion i zebrafisk larver
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Sloboda, D. D., Claflin, D. R., Dowling, J. J., Brooks, S. V. Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (77), e50539, doi:10.3791/50539 (2013).More

    Sloboda, D. D., Claflin, D. R., Dowling, J. J., Brooks, S. V. Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (77), e50539, doi:10.3791/50539 (2013).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    simple hit counter