Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Zebra balığı Larva kas fonksiyonu değerlendirmek için daralma sırasında Kuvvet Ölçümü

doi: 10.3791/50539 Published: July 23, 2013

Summary

Kuvvet ölçümleri geliştirme, yaralanma, hastalık, tedavi ya da kimyasal toksisite nedeniyle kas fonksiyonu değişiklikleri göstermek için kullanılabilir. Bu video, Zebra balığı larva gövde kas bir maksimal kasılma sırasında güç ölçmek için bir yöntem ortaya koymaktadır.

Abstract

Zebra balığı larvaları kas gelişimi, kas hastalığı ve kas ile ilgili kimyasal toksisite modeller sunmak, ancak ilgili çalışmalar genellikle kas sağlık işlevsel önlemler eksikliği. Bu video makalede, biz Zebra balığı larva gövde kas kasılması sırasında kuvvet oluşturma ölçmek için bir yöntem ortaya koymaktadır. Kuvvet ölçümleri, bir tuz çözeltisi ile doldurulmuş bir bölme içine bir anestezi larva yerleştirerek gerçekleştirilir. Larva ön sonunda bir güç dönüştürücü bağlıdır ve larva arka sonunda uzunluğu kontrol bağlıdır. Izometrik bir seğirme kasılma elektrik alanı stimülasyonu tarafından ortaya çıkarılan ve kuvvet tepki analizi için kaydedilir. Kasılma sırasında kuvvet oluşturma genel kas sağlık bir ölçü sağlar ve özellikle kas fonksiyonu bir ölçü sağlar. , Vahşi-tip larva ile kullanılmak için bu tekniğin tarif rağmen, bu yöntem, genetik olarak değiştirilmiş larvaları ile uyuşturucu ya da toksik maddeler ile tedavi larvaları ile kullanılabilirkas hastalık modelleri karakterize ve tedavileri değerlendirmek, ya da kas gelişimi, yaralanma veya kimyasal toksisite çalışma için.

Introduction

Genç Zebra balığı (Br.rerio) larvaları, 3-7 gün sonrası fertilizasyon (DPF), giderek iskelet kas araştırmalar için yararlı bir organizma olarak kabul edilmektedir. Genç larva modeli insan kas hastalığı 1-9 için kullanılır, ilaç ve tedavi stratejileri 10-11, çalışma kas yaralanması 12 değerlendirmek gelişimi 13-16 kas anlamak ve kas ile ilgili kimyasal toksisite 17-19 araştırmak. Bu alanlarda tipik çalışmalar sağlıklı kas genetik manipülasyon veya toksik maruz anormal hale olduğu derecesini incelemek ve bazı çalışmalar anormal kas tedaviye yanıt verir derecesi inceleyin. Bu çalışmaların başarısı için kritik doğru kas sağlığını değerlendirmek için yeteneğidir.

Zebra balığı larvaları kas sağlığını değerlendirmek için mevcut çeşitli yöntemler olmakla birlikte, birkaç kas fonksiyonu hakkında doğrudan bilgi sağlar. Kas sağlık genellikle appearanc tarafından değerlendirilirolarak 9,15,16,18 immün histolojik boyama 6,8,11,, ışık mikroskobu 3,13, elektron mikroskobu 3,4,14,16 veya çift kırılma 7,9,11 ile değerlendirilen e,, ancak bu teknikleri sağlamak morfolojik bilgiler sadece. Gövde ve kuyruk değiştirmeler ve hız 4,17 motor fonksiyon değerlendirmek, ama onlar da nöral giriş, enerji metabolizması, ve diğer işlemler yansıtan bu yana bu kas fonksiyonlarının doğrudan tedbirler değildir yüzme.

Buna karşılık, kasılma sırasında kuvvet oluşturma ölçüm kas fonksiyonu doğrudan bir değerlendirme sağlar ve genel kas sağlık iyi bir göstergesidir. Bu yaklaşımın da yarar basit veri analizi ve kantitatif sonuçlarını içerir. Bu video makalede, daha araştırmacı araştırmalarında kas sağlık mevcut önlemleri tamamlamak için bu yöntemi kullanacağı umuduyla, larva kaslar tarafından kuvvet oluşturma ölçmek için ayrıntılı bir prosedür sağlar.

Açık olmak gerekirse, bu teknik yüzme sırasında larva kasları tarafından oluşturulan kuvvetlerin ölçmez. Larva her iki ucunda ekipman bağlı ve larva anestezi kaldığından, bu test sırasında hareket başlatmak çünkü. Dahası, alan uyarımı bir bil sebep olmak için aynı anda tüm kas lifleri aktivedoğal olarak 20 ne olacağı değil ateral daralma,. Bu nedenle, daha çok yüzme sırasında oluşturulan gerçek kuvvetlerinin ölçülmesi yerine, bu teknik larva kaslarının kuvvetini üreten yeteneği belirler.

Biz kas nemaline miyopati 21 bir Zebra balığı modelinde zayıflık, hem de çok MiniCore hastalığı 22 bir Zebra balığı modelinde kas fonksiyonu üzerine antioksidan tedavinin etkisini değerlendirmek için göstermek için bu tekniği kullandık. Diğer kas fonksiyonu 19 bir çevre kirletici etkilerini incelemek için benzer bir teknik 23 kullandık.

Protocol

Not: Zebra balığı ile ilgili tüm işlemleri ilgili kurallar, düzenlemeler ve düzenleyici kurumlar uygun olarak yapılmalıdır. Bu makalede gösterilen tüm hayvan kullanım prosedürleri Hayvanlar Kullanımı ve Bakım Michigan Komitesi Üniversitesi (UCUCA) tarafından onaylanmıştır.

1. Dikiş Döngüler olun

  1. Üç teller içine steril olmayan dikiş (USP 10/0 monofilament naylon, 3 kat) ayırmak için forseps kullanın.
  2. Teller birinde bir çift yukarıdan aşağı düğüm başlar. Yerine bir düğüm küçük bir (~ 1 mm çapında) döngü yapmak için tamamen düğüm sıkmadan önce durdurun.
  3. Döngü kuyrukları aşırı dikiş kesmek için makas kullanın. Bitmiş bir döngünün bir örneği Şekil 1'de gösterilmiştir.
  4. Bu post-daha sonra kullanmak için not a yapışkan tarafı üzerinde döngü yerleştirin. Dikiş döngüler güç testi sırasında yerinde larva tutmak için kullanılacaktır.
  5. Tekrar gerektiğinde 1.1-1.4 adımları. Maktest edilecek her bir larva için e iki dikiş döngüler.

2. Test Çözüm olun

  1. 1.000 ml 7.977 g sodyum klorür, potasyum klorür, 0.373 g, 0.265 g kalsiyum klorür dihidrat, 0.102 gr magnezyum klorür hekzahidrat, 0.048 gr sodyum fosfat monobazik, 1.000 g sodyum bikarbonat ve 0.037 gr etilendiamintetraasetik asit disodyum tuzu dihidrat eklenerek Tyrodes solüsyonu yapmak arıtılmış su.
  2. Tuzlar tamamen eriyene kadar çözelti karıştırılır. Bu çözelti, 4 ° C de bir ay boyunca saklanabilir
  3. 47.9 ml Tyrodes solüsyonu ve karışım ila 4 mg / ml 'Tricaine 2.1 mi, balığı ayırt 24'e göre hazırlanmıştır, ekleyin. Karanlık bir cam şişe veya alüminyum folyo kaplı bir cam şişe içinde saklayarak ışıktan bu çözüm koruyun. Bu çözelti, oda sıcaklığında depolanır ve her gün taze olarak yapılmalıdır.

3. Deneysel Odası içine Aanesthetized Larva kravat

    <li> Yeri stereo mikroskop sahnede test cihazları (Şekil 2).
  1. Test cihazları için güç dönüştürücü ve süresini kontrol kablolarını bağlayın. Kuvvet dönüştürücü açın. Bu sert kalır, böylece uzunluğu kontrol açın. (Not:.. Uzunluğu kontrolör kasılması sırasında bir kas hazırlanması uzatmak ya da kısaltmak olanağı sağlar Ancak, uzunluğu, bu kontrolör özelliği, burada tarif edilen yöntem içinde kullanılan değildir Bu nedenle, uzunluğu kontrol katı bir eki olarak da düşünülebilir noktası) bir XYZ konumlandırma sistemi monte.
  2. Tek kullanımlık bir transfer pipeti ile, test çözeltisi ile deney bölmesine doldurun.
  3. Kuyrukları biri tarafından bir dikiş döngü almak ve kuvvet dönüştürücü tüp asmak için forseps kullanın. Uzunluğu denetleyiciye bağlı tüp ikinci bir dikiş döngü asın. (Not: kavisli parçası üzerinde dikiş döngü sürükleyici dikiş ve cau kıvırmayın olabilirbu) sonraki adımları sırasında kırmak için se.
  4. Bir tek transferi pipet ile, test çözümü ile dolu küçük bir Petri kabı bir Zebra balığı larva transferi. Etkisi (~ 1 dk) almak için test solüsyonu (tricaine) olarak anestezi bekleyin. Bir forseps ile yavaşça kuyruk dürtmek ve larva dokunmatik uyarılmış yüzme eksikliği ile anestezi olduğundan emin olun.
  5. Deney bölmesine larva transferi için bir cam pipet kullanın.
  6. Hafifçe kapalı forseps ile larva dürtmek tarafından, kuvvet dönüştürücü tüp dikiş döngü içinde larva ön kısmı yol. Tüp dikiş döngü içinde larva ön kısmı yol. Forseps ile dikiş döngü kuyrukları hem tutun ve yolk kesesi veya swimbladder (Şekil 3A) için arka dikiş döngü sıkmak için aynı anda onları çekin.
  7. Bir forseps ile bir dikiş döngü kuyruk tutun ve çekin, larva yüzün yan tarafında kadar tüp etrafında 90 ° döndürmek için larva nedens kadar (Şekil 3B). Döngü yeterince sıkılır ise, çekme bazı direnç olacak, larva kolayca döner olmamalıdır. Döngü çok fazla sıkılır ise, larva tüp etrafında döner olmayacaktır.
  8. Uzunluğu denetleyiciye bağlı XYZ konumlandırma cihazı kullanarak, X ekseni (Şekil 2A ekseni tanımlar) boyunca ve larva gövde ve kuyruk altında süresini kontrol tüpü hareket. Uzunluğu kontrol tüpün uçları ve kuvvet dönüştürücü tüp arasında boşluk bırakın.
  9. Larva kuyruğu üzerinde dikiş döngü kılavuzu ve daha önce (Şekil 3C) tarif edildiği gibi dikiş döngü sıkın. Sen yan tarafı yukarı bakacak şekilde larva arka kısmı döner gerekebilir. Dikiş döngü kuyrukları (Şekil 3D) kesin.

4. Deneysel Odası pozisyonu Larva

  1. Larva w sağlamak için oda alttan uygun bir mesafe için larva harekethasta sonraki adımları sırasında ters bir mikroskop amacı "çalışma mesafesi" içinde olması. Bunun için, tüpler sadece odasının alt dokunmak kadar yavaşça Z ekseni boyunca tüpleri (ekli larva ile) düşürmek için XYZ konumlandırma cihazları kullanın. Larva odasının alt (~ 100 mikron) uygun bir mesafe kadar sonra, tüpler yükseltmek.
  2. Uzunluğu kontrolöre bağlı XYZ yerleştirme cihazı kullanarak, kuvvet dönüştürücü borusunun uzun ekseni ile larva uzun eksenine hizalamak için Y ekseni boyunca uzunluğunu kontrol tüpü ayarlayın.

5. Bir Maksimum Twitch daralma sırasında kayıt Gücü

  1. Ters bir mikroskop aşamasına test cihazları taşıyın.
  2. Bir istenen değere oda sıcaklığını ayarlamak. Öncelikle, su banyosu sirkülatör, termometre, ve test cihazı için sıcaklık kontrol bağlanabilir. Gerekli bileşenleri açın ve sıcaklık Contr üzerinde Ayarıtermometre kadar oller istediğiniz değeri bildirir. Bu makalede bulunan veriler 25 ° C'de elde edilmiştir, fakat aynı zamanda ölçümler oda sıcaklığında ya da 28.5 yapılabilir ° C
  3. Test cihazları için stimülatörü kabloları bağlayın. Stimülatörü için güç açın ama adım 5.6 kadar larva teşvik etmemektedir.
  4. Larva odasına alt paralel olduğundan emin olun. 40X objektif ile, borular, bunların uçları arasında larva görürler. Dibine paralel olarak ise, larva her iki ucu odak noktası olacaktır. Gerekirse her iki odak kadar, Z ekseni boyunca kuvvet dönüştürücü tüp ayarlayın.
  5. Larva boyu en uygun daha kısa olduğundan emin olun. Video sarkomer uzunluğunu sistemi açın ve izlerse video karesinin kenarlarına paralel olduğu video kamera gibi döndürün. Bu sistem ilgi kullanıcı tanımlı bir bölge içinde her piksel yatay satır boyunca piksel yoğunluğu değişimleri analiz ederek çizgi çizgi boşluğu izler(ROI). ROI içindeki tüm satırlar için sonuçlar ortalama ve video kare hızı (≥ 80 sn -1) eşdeğer bir frekans ile rapor edilmiştir. Çizgi çizgi aralık sarkomer uzunlukta bir göstergesi olarak kullanılır.
  6. Mikroskop periferik lifler odaklanmak ve belirtilen sarkomer uzunluğunu not ayarlayın. Gerekirse, sarkomerinde uzunluğu (örneğin, 1.90 mm) daha az uygun olduğu kadar larva uzunluğunu ayarlamak için kontrol uzunluğu (X-ekseni) eklenmiş XYZ konumlandırma cihazı kullanın.
  7. Seğirme gücü optimize etmek için mevcut uyarı ayarlayın. Başlamak için, düşük büyüklüğü (örneğin 100 mA) stimülatörü üzerinde çıkış akımını ayarlayın. Uyarıcı el ile veya özel bir LabVIEW programı çalıştıran bir bilgisayar tarafından tetiklenebilir. Süresi 0.2 msn güncel bir darbe ile larva kasların bir seğirme ortaya çıkarmak.
  8. Kuvvet çıkış kayıt ve osiloskobun imleçler kullanarak zirve seğirme kuvvetini ölçmek için bir osiloskop kullanın. Mevcut artırın50 mA adımlarla ve her geçerli düzeyde tepe seğirme gücü ölçmek. Yorgunluğu önlemek için seyirmesi arasında 30 saniye bekleyin. Uyarım akımı arttıkça, en yüksek kasılma gücü tipik olarak en fazla artar ve daha sonra yavaş yavaş azalır. Larva en büyük gücü üretir hangi mevcut en uygun stimülasyon akımdır. Stimülasyonu akıma akım genliği ayarlayın.
  9. XYZ konumlandırma cihazı kullanarak, maksimum seğirme gücü ortaya çıkarmak için larva (ve dolayısıyla, sarkomer uzunluk) uzunluğunu ayarlayın. Yabani tip Zebra balığı larvaları (3-7 dpf) 2.10 mm veya 2.15 mikron sarkomer uzunlukları maksimum seğirme gücü oluşturmak. Ancak, sarkomer uzunluğu larva aşırı gerilimleri önlemek için 2.08 mikron olarak ayarlanabilir.
  10. Larva kas seğirme ortaya çıkarmak. Kuvvet yanıt kaydetmek ve sonraki analiz için kayıt kaydetmek için osiloskop kullanın.

6. Optimal Length Larva ile Kas sistemi Boyutlar ölçün

Stereo mikroskop geri test cihazları taşıyın.
  • Mercek ölçek kullanarak, yan bakıldığında kas yüksekliğini ölçmek. Daha sonra, larva uzunluğunu değiştirmek için özen, 90 larva döner ° alttan larva görmek için dikiş döngü kuyrukları kullanarak. Alttan bakıldığında kas genişliğini ölçmek. Anatomik bir dönüm noktası (örneğin ürogenital açılış) (Şekil 4) de ölçümler.
  • Test ekipmanları gelen larva serbest bırakmak için bir MicroBlade ile dikiş döngüler kesin.
  • Representative Results

    Sağlıklı Yabani tip Zebra balığı larvaları, kas lifleri bir aralarında büyük boşluklar olmadan başka paralel olmalı ve belirgin çizgiler (Şekil 5A) olmalıdır. Bu özellikler sergileyen, veya müstakil lifler (Şekil 5B), belirgin olarak hasar yok, vahşi tip zebrabalıkları larvaları atılmalıdır.

    Pik seğirme kuvvet karşısında tek zebrabalıkları larva için mevcut stimülasyon arasında temsili bir grafiği Şekil 6'da gösterilmektedir. 3-7 dpf'e arasında yabani tip Zebra balığı larvaları için en uygun stimülasyon mevcut 3 dpf'e larvalar genellikle 6-7 dpf'e larva daha güncel daha fazla uyarılması gerektiren, 400-600 mA arasında tipik olarak.

    Ham güç verileri (adım 5.8 sırasında toplanan) işlenmiş ve veri analiz yazılımı ile analiz edilmelidir. İlk olarak, güç kaydın temel sıfır olarak ayarlanır. İkinci olarak, kuvvet dönüştürücünün voltaj çıkışı (m zorlamak için dönüştürülürN) (kuvvet dönüştürücü için bir kalibrasyon eğrisi oluşturmak için üreticinin yönergelerine bakın). Tek bir larva bir maksimal seğirme kasılma sırasında toplanan bir temsilci gücü yanıt Şekil 7'de gösterilmiştir. Veri analizi yazılımı tepe kuvveti ve kuvvet yanıtın diğer özellikleri ölçmek için kullanılabilir.

    Maksimal seğirme kasılmaları tepe kuvveti verilerin temsil edici bir grubu Şekil 8A'da gösterilmiştir. Tipik tepe seğirme gücü yaşlı larva genç larvalar daha fazla güç üreten ile 0.9 'dan 1.7 mN için vahşi tip 3-7 dpf'e larva aralığı, değerleri. Pik seğirme yürürlükte farklar büyüme ve gelişme gibi normal süreçler (Şekil 8) ya da gen mutasyonu ile ilgili patoloji 21,22 olarak anormal süreçler nedeniyle olabilir.

    Kas kesit alanı (CSA) tarafından Normalleştirme tepe seğirme kuvvet farklılıklar Ayırıcı bağlı basitçe derecesini belirlemek için kullanılabilir kas 21,22 büyüklüğünde nces. Kas CSA formül kullanılarak tahmin edilebilir: CSA (B / 2) (A / 2) = π, bir taraftan bakıldığında kas yüksekliği olduğu, B, alttan bakıldığında kas genişliği ve kesiti eliptik varsayılır. 0.027 3-4 dpf'e larva genellikle 5-7 dpf'e larva daha küçük CSA değerleri gösteren 0.034 mm 2, vahşi tip 3-7 dpf'e larva aralığı için tipik CSA değerleri. Maksimal seğirme kasılmaları normalize maksimum kuvvet verinin temsili bir dizi Şekil 8B'de gösterilmiştir. 4-7 dpf'e larva genellikle 3 dpf'e larvaları daha büyük değerleri gösteren 34 51 mN / mm 2 vahşi tip 3-7 dpf'e larva aralığı, tipik normalize pik seğirme güç değerleri.

    Şekil 1
    Şekil 1. Dikiş döngü kuyrukları için dikiş döngü. Oklar noktası.

    ve_content "fo: keep-together.within-page =" her zaman "> Şekil 2,
    Şekil 2. Etiketli bileşenleri ile (A) Test cihazı. Deneysel odasının (B) Yakın çekim manzarası. Şeffaf alt ile (a) Deneysel odası. (B) Kuvvet dönüştürücü. (C) Uzunluk kontrol. (D) XYZ konumlandırma cihazları. X, Y ve Z eksenleri sağ üst köşesinde tanımlanır. Termoelektrik modülleri kullanan (e) Sıcaklık kontrol sistemi. Boru termoelektrik modüllerin soğutma için su akışı barındırır. (F) Paslanmaz çelik boru dönüştürücü zorlamak bağlı. (G) Paslanmaz çelik boru uzunluğunu denetleyiciye bağlı. (H) Termometre mikroprob. (I) Platinum paralel plaka elektrotlar, uzunluğu kapsayanodası. Platin levhalar yüksek 2.5 mm ve kalın 0,255 mm.

    Şekil 3,
    Şekil 3,. Deneysel odasına larva bağlama. (A) Larva ön sonunda bağlanmış ancak henüz 90 ° döndürülebilir değil. (B) Larva hareket ettirilebilr 90 ancak henüz döndürülebilir değil arka sonunda bağlanmış °. (C) Larva sonra. (D) Larva sonra hareket ettirilebilr ve dikiş döngü kuyrukları kesilmiş.

    Şekil 4,
    Şekil 4. Kesit alanı tahmini için ölçümler. Kas sistemi olarak (A), yandan bakıldığında, (B)

    Şekil 5,
    Şekil 5,. Zebra balığı larvaları gövde kas Yanal görünümü. Belirgin hasar ile (A) Sağlıklı doku. (B) Doku. Lif müfrezeleri kaynaklanan kontraktür yıldız ile işaretlenmiştir.

    Şekil 6,
    6 Şekil. Pik seğirme kuvvet karşı uyarılması Temsilcisi arsa mevcut. Stimülasyon akımı 500 mA.


    Şekil 7. Tek bir seğirme daralma Temsilcisi güç kaydı. Bu daralma 0 msn de bir uyarıcı darbe ile elde edilemedi. Maksimum kuvvet 1.56 mN olduğunu.

    Şekil 8,
    Şekil 8. 3-7 dpf'e larva. Temsilcisi kuvveti veri (A) maksimum seğirme kasılmaları gelen Maksimum kuvvet veri. (B) maksimum seğirme kasılmaları gelen Maksimum kuvvet veri CSA normalize. Eski larva (6-7 dpf) 5 dpf'e başlayan Spirulina ile beslenen Hatchfry Encapsulon Sınıf 0 (Argent Laboratories) idi. Araçlar + standart sapma her grupta N = 5 ile rapor edilir. 3 dpf larvaları (*) ve 4 dpf larvaları (#) önemli ölçüde farklı grupları (ANOVA, p <0.05 belirtilir.) 4 ve 6-7 dpf (A) arasında yürürlükte artış hiçbir dayalı büyüme atfedilir ise 3 ve 4 dpf (B) arasında normalize yürürlükte artış, bu dönemde içsel güç üreten yeteneği bir artış gösterir normalize yürürlükte 4 ila 7 dpf'e değiştirmek.

    Discussion

    Bu yöntem, Zebra balığı larvalarının gövde kaslarının kas fonksiyonunu değerlendirmek için bir seğirme sırasında kuvvet oluşturma ölçer. Tetanik kasılmaları (0.2 sn bir süre için 200 stimülasyon darbe / sn gibi) Zebra balığı larvaları ortaya çıkardı olmasına rağmen, en fazla tetanik gücü maksimum seğirme gücü göre sadece% 10-15 daha fazladır. Bu nedenle, bir seğirme sırasında üretilen kuvvet kuvvet üreten özelliği makul bir ölçüsüdür. Tiki programı ya da dikiş bağları da kayma neden daha az olasıdır çünkü seyirmesi tetanik kasılmaları tercih edilir.

    Bu teknik ile anlamlı veriler elde etmek için, en seğirme kuvvet her bir larva için elde edilmelidir ve deney grupları arasında değişkenliği en aza indirilmelidir. Akılda bu hedefleri ile, aşağıdaki önerileri sunuyoruz. Kuvvet dönüştürücü ve uzunluğu kontrol tüplerine larva bağlama zaman önce, dikkat edin. Dikiş döngüler çok sıkılırsaçok, dikiş kas dokusu ile kesecek. Dikiş döngüler yeterince sıkılır değilseniz, larva tarafından üretilen kuvvet tam kuvvet dönüştürücü iletilir olmayacaktır. Her iki durum da, ama özellikle ikinci, maksimum seğirme gücü hafife. Larva test döneminde geliştirmeye devam edecektir çünkü İkincisi, birden fazla deney grupları test yana gruplar arasında alternatif birkaç saat (20-30 dk / larva), alabilir.

    Bahsedilen ürün, bazı maksimum seğirme kuvveti ölçümü (örneğin güç dönüştürücü, akımlı uyarıcı) için gerekli olsa da, diğer öğeleri mutlaka gerekli değildir. Video sarkomer boyu sistemi arzu ancak gerekli değildir. Bir alternatif olarak, tikler bir dizi maksimum seğirme kuvveti elde edilene kadar larva uzunluğu ayarlanır sırasında optimal uzunlukta, bulmak için de kullanılabilir. Bir sıcaklık kontrol sistemi de zorunlu olarak gerekli değildir. Sıcaklık kontrolü zaman mea önemlidirmaksimum kuvvet seğirme az miktarda sıcaklık değişimlerine özellikle hassas değildir ve oda sıcaklığında ölçülen olabilir, oysa sıcaklığına kadar son derece duyarlı olan bilyenin seğirme kinetiği. Bağımsız olarak kuvvet test sırasında odasının sıcaklığı arasında, larvaların ° C'de 24 önceden zorlamaya 28.5 arasında optimum büyüme sıcaklıkta muhafaza edilmesi gerektiğine dikkat ediniz doğru evreleme için test.

    Larvalar tricaine içeren Tyrodes çözeltisi içinde test edilmiştir. Bu sinir sistemi tarafından uyarılan kasılmaları kendiliğinden ortadan kaldırmak ve böylece kuvvet test sırasında yorgunluğu önlemek için (w / v) tricaine, anestezi 24 için tavsiye edilen konsantrasyonu,% 0.02 kullanın. Tricaine de tie-adım kolaylaştırır ve genel test süresini azaltır. Bununla birlikte, test çözeltisi tricaine dahil olmak üzere sürekli olarak yaklaşık% 30 ile en fazla seğirme gücünü azalttığı görüyoruz. Benzer bir etki, aynı zamanda tricai burada, tetra kuyruk kas gözlenmiştirnöromüsküler iletim bloke sonra ne tricaine kas 25 üzerinde doğrudan etkisi olduğunu düşündüren, kuvvet oluşturma azalır. Bu sinir hücreleri 26'da olduğu gibi Tricaine, hücre zarından sodyum iletkenlik azaltarak kas hücre uyarılabilirliğinin azaltabilir. Motor nöronlar tarafından aktivasyonu bloke edilmesi için diğer seçenekler D-tübokurarin ve α-bungarotoxin ancak, tricaine farklı olarak, bu bileşikler, deri geçirgen değildir ve kafa, omurilik, kalp ya da 27 içine doğrudan enjekte edilmesi gerekir. Bireysel araştırmacılar tricaine kendi özel uygulama için arzu edilir olup olmadığını değerlendirmek gerekir. Tricaine test çözümü dahil edilirse tricaine etkisini deney grupları arasında farklılık olmadığını doğrulamanız gerekir, konsantrasyon deneyler ve araştırmacılar arasında tutarlı olmalıdır.

    Biz 3 dpf'e gibi genç ve 7 dpf kadar eski olarak larva için bu yöntem açıklanmaktadır. Kas lifleri fu gibi görünse de3 dpf'e test ekipmanları için larva bağlama engelleyen önce kendiliğinden kuyruk hareketleri 27, kuyruk kısa boy başlar 17 saat sonrası döllenme, gibi erken nctional. Birçok hastalık modelleri bu kez çok daha uzun hayatta olmadığı için biz genellikle 7 dpf'e sonra larva testi yok. 5 dpf ötesinde larva test durumunda, larvaların beslenmelidir. Biz beslenmemiş larva olasılıkla beslenen larvalar, azalan yolk kesesi nedeniyle daha küçük kasları ve daha az maksimum seğirme güç üreten gözlemledim. Bu nedenle, dış besleme ek değişken önlemek için, 3-5 dpf arasındaki larvaları test etmek için arzu edilebilir.

    Özet olarak, Zebra balığı larva gövde kas maksimal seğirme kasılma sırasında kuvvet oluşturma ölçmek için bir nicel ve güvenilir bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, Zebra balığı larva kas genel sağlık değerlendirmek için kullanılan ve özellikle kas fonksiyonu hakkında bilgi sağlar edilebilir. Hakkında bilgi vermenin yanı sırakuvvet kuşak büyüklüğü, bu teknik, kuvvet kuşak kinetiğini incelemek için 22 ya da kas yorgunluğu çalışmaya adapte edilebilir kullanılabilir. , Vahşi-tip larva ile kullanılmak için bu tekniğin tarif olmasına rağmen, bu yöntem, kas hastalık modelleri karakterize eden ve tedavilerini ya da kas gelişimi, kas yaralanma veya çalışma için, genetik olarak modifiye edilmiş ya da larvalar için ilaçlar veya toksik maddeler ile tedavi edilen larvalar için kullanılabilir kas ile ilgili kimyasal toksisite.

    Disclosures

    Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

    Acknowledgments

    Yazarlar Zebra balığı yetiştiriciliği ile yardım için Angela Busta teşekkür ederim. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (AG-020.591 için SVB ve JJD için 1K08AR054835) tarafından desteklenmiştir.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    REAGENTS
    Tricaine powder Sigma-Aldrich A5040
    Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653
    Potassium chloride Sigma-Aldrich P9541
    Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich 223506
    Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2670
    Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich S0751
    Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S6297
    Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate Sigma-Aldrich E5134
    EQUIPMENT
    Nonsterile-suture Ashaway Line Twine S30002 USP 10/0 monofilament nylon (3 ply)
    Forceps Fine Science Tools 11251-20 Dumont #5
    Spring scissors Fine Science Tools 15000-08 Vannas
    Stereo microscope Leica Microsystems MZ8 Illuminated with Fostec EKE ACE I light source
    Force transducer Aurora Scientific 400A
    Length controller Aurora Scientific 318B
    XYZ positioning devices Parker Hannifin 3936M
    Thermometer Physitemp BAT-12
    Disposable transfer pipette Fisher Scientific 13-711-9AM Cut end to widen opening and facilitate larva transfer
    Petri dish Fisher Scientific 08-757-11YZ
    Glass pipette Fisher Scientific 13-678-8B Cut end (and fire-polish) to widen opening and facilitate larva transfer
    Inverted microscope Carl Zeiss Microscopy Axiovert 100
    Water bath circulator Neslab Instruments RTE-111
    Temperature controller Alpha Omega Instruments Series 800
    Stimulator Aurora Scientific 701C High-power, follow stimulator
    Video sarcomere length system Aurora Scientific 900B-5A
    LabVIEW software National Instruments
    Oscilloscope Nicolet Technologies ACCURA 100
    Microblade Fine Science Tools 10050-00
    Microblade holder Fine Science Tools 10053-13
    Data analysis software (Signo) Alameda Applied Sciences

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Bassett, D. I., Bryson-Richardson, R. J., Daggett, D. F., Gautier, P., Keenan, D. G., Currie, P. D. Dystrophin is required for the formation of stable muscle attachments in the zebrafish embryo. Development. 130, (23), 5851-5860 (2003).
    2. Nixon, S. J., Wegner, J., et al. Zebrafish as a model for caveolin-associated muscle disease; caveolin-3 is required for myofibril organization and muscle cell patterning. Hum. Mol. Genet. 14, (13), 1727-1743 (2005).
    3. Hall, T. E., Bryson-Richardson, R. J., et al. The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin α2-deficient congenital muscular dystrophy. PNAS. 104, (17), 7092-7097 (2007).
    4. Hirata, H., Watanabe, T., et al. Zebrafish relatively relaxed mutants have a ryanodine receptor defect, show slow swimming and provide a model of multi-minicore disease. Development. 134, 2771-2781 (2007).
    5. Dowling, J. J., Vreede, A. P., et al. Loss of myotubularin function results in t-tubule disorganization in zebrafish and human myotubular myopathy. PLoS Genet. 5, (2), e1000372 (2009).
    6. Berger, J., Berger, S., Hall, T. E., Lieschke, G. J., Currie, P. D. Dystrophin-deficient zebrafish feature aspects of the Duchenne muscular dystrophy pathology. Neuromuscul. Disord. 20, (12), 826-832 (2010).
    7. Kawahara, G., Guyon, J. R., Nakamura, Y., Kunkel, L. M. Zebrafish models for human FKRP muscular dystrophies. Hum. Mol. Genet. 19, (4), 623-633 (2010).
    8. Wallace, L. M., Garwick, S. E., et al. DUX4, a candidate gene for facioscapulohumeral muscular dystrophy, causes p53-dependent myopathy in vivo. Ann. Neurol. 69, 540-552 (2011).
    9. Sztal, T. E., Sonntag, C., Hall, T. E., Currie, P. D. Epistatic dissection of laminin-receptor interactions in dystrophic zebrafish muscle. Hum. Mol. Genet. (1093).
    10. Kawahara, G., Karpf, J. A., Myers, J. A., Alexander, M. S., Guyon, J. R., Kunkel, L. M. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. PNAS. 108, (13), 5331-5336 (2011).
    11. Berger, J., Berger, S., Jacoby, A. S., Wilton, S. D., Currie, P. D. Evaluation of exon-skipping strategies for Duchenne muscular dystrophy utilizing dystrophin-deficient zebrafish. J. Cell Mol. Med. 15, (12), 2643-2651 (2011).
    12. Seger, C., Hargrave, M., Wang, X., Chai, R. J., Elworthy, S., Ingham, P. W. Analysis of Pax7 expressing myogenic cells in zebrafish muscle development, injury, and models of disease. Dev. Dyn. 240, 2440-2451 (2011).
    13. Postel, R., Vakeel, P., Topczewski, J., Knöll, R., Bakkers, J. Zebrafish integrin-linked kinase is required in skeletal muscles for strengthening the integrin-ECM adhesion complex. Dev. Biol. 318, (1), 92-101 (2008).
    14. Zoeller, J. J., McQuillan, A., Whitelock, J., Ho, S. Y., Iozzo, R. V. A central function for perlecan in skeletal muscle and cardiovascular development. J. Cell Biol. 181, (2), 381-394 (2008).
    15. Kim, H. R., Ingham, P. W. The extracellular matrix protein TGFBI promotes myofibril bundling and muscle fibre growth in the zebrafish embryo. Dev. Dyn. 238, 56-65 (2009).
    16. Beqqali, A., Monshouwer-Kloots, J., et al. CHAP is a newly identified Z-disc protein essential for heart and skeletal muscle function. J. Cell Sci. 123, (7), 1141-1150 (2010).
    17. Huang, H., Huang, C., et al. Toxicity, uptake kinetics and behavior assessment in zebrafish embryos following exposure to perfluorooctanesulphonicacid (PFOS). Aquat. Toxicol. 98, (2), 139-147 (2010).
    18. Sylvain, N. J., Brewster, D. L., Ali, D. W. Zebrafish embryos exposed to alcohol undergo abnormal development of motor neurons and muscle fibers. Neurotoxicol. Teratol. 32, (4), 472-480 (2010).
    19. Chandrasekar, G., Arner, A., Kitambi, S. S., Dahlman-Wright, K., Andersson-Lendahl, M. Developmental toxicity of the environmental pollutant 4-nonylphenol in zebrafish. Neurotoxicol. Teratol. 33, (6), 752-764 (2011).
    20. Buss, R. R., Drapeau, P. Activation of embryonic red and white muscle fibers during fictive swimming in the developing zebrafish. J. Neurophysiol. 87, (3), 1244-1251 (2002).
    21. Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation. Dis Model Mech. 5, 389-396 (2012).
    22. Dowling, J. J., Arbogast, S., et al. Oxidative stress and successful antioxidant treatment in models of RYR1-related myopathy. Brain. 135, (4), 1115-1127 (2012).
    23. Dou, Y., Andersson-Lendahl, M., Arner, A. Structure and function of skeletal muscle in zebrafish early larvae. J. Gen. Physiol. 131, 445-453 (2008).
    24. Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). Univ. of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2000).
    25. Herr, V. D., Sonnenburg, D. C., Courogen, P. M., Fiamengo, S. A., Downes, H. Muscle weakness during tricaine anesthesia. Comp Biochem Physiol Part C. 110, (3), 289-296 (1995).
    26. Frazier, D. T., Narahashi, T. Tricaine (MS-222): effects of ionic conductances of squid axon membranes. Eur. J. Pharmacol. 33, (2), 313-317 (1975).
    27. Saint-Amant, L., Drapeau, P. Time course of the development of motor behaviors in the zebrafish embryo. J. Neurobiol. 37, (4), 622-632 (1998).
    Zebra balığı Larva kas fonksiyonu değerlendirmek için daralma sırasında Kuvvet Ölçümü
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Sloboda, D. D., Claflin, D. R., Dowling, J. J., Brooks, S. V. Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (77), e50539, doi:10.3791/50539 (2013).More

    Sloboda, D. D., Claflin, D. R., Dowling, J. J., Brooks, S. V. Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (77), e50539, doi:10.3791/50539 (2013).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    simple hit counter