צמיחת מדידה וDynamics ביטוי גנים של גידול ממוקד Published: July 6, 2013 doi: 10.3791/50540

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Tal Danino*¹, Arthur Prindle*², Jeff Hasty^2,3,4, Sangeeta Bhatia^1,5,6,7,8

¹Health Sciences and Technology, Massachusetts Institute of Technology, ²Department of Bioengineering, University of California, San Diego, ³Biocircuits Institute, University of California, San Diego, ⁴Molecular Biology Section, Division of Biological Science, University of California, San Diego, ⁵Broad Institute of Harvard and MIT, ⁶Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, ⁷Electrical Engineering and Computer Science and David H. Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology, ⁸Howard Hughes Medical Institute

* These authors contributed equally

Summary

המטרה של ניסויים אלה היא להפיק נתונים בזמן קורס כמותיות על הצמיחה והדינמיקה של ביטוי גנים נחלשו

Abstract

המטרה של ניסויים אלה היא להפיק נתונים בזמן קורס כמותיות על הצמיחה והדינמיקה של ביטוי גנים נחלשו ס מושבות חיידקי Typhimurium גדלו בתוך גידולים.

אנחנו שנוצרנו גידולי xenograft מודל בעכברים על ידי הזרקה תת עורית של שורת תאי סרטן השחלות אנושית, OVCAR-8 (מאגר גידול DCTD NCI, פרדריק, MD).

אנחנו הפכנו זנים מוחלשים של ס ' חיידקי typhimurium (ELH430: SL1344 ^phoPQ-1) עם לוציפראז constitutively הביע (luxCDABE) פלסמיד להדמיה ^2. זנים אלה במיוחד ליישב גידולים תוך שמירה על המהות שאינה ארסית לעכבר ^1.

ברגע שגידולים מדידים הוקמו, החיידקים הוזרקו דרך הווריד דרך וריד הזנב עם משתנה מינון. גידולים מקומיים, ביטוי חיידקי גן היה פיקוח בזמן אמת במהלך 60 שעות באמצעותin vivo הדמיה המערכת (IVIS). בכל נקודת זמן, גידולים שנכרתו, הומוגני, ומצופים לכמת מושבות חיידקים למתאם עם נתוני ביטוי גנים.

יחד, נתונים זה מניב מדד כמותי לצמיחה בvivo ודינמיקת ביטוי גנים של חיידקים הגדלים בתוך גידולים.

Introduction

ביולוגיה סינטטי התקדמה במהירות בעשור האחרון, וכעת נמצאת בעמדה כדי להשפיע על בעיות חשובות בתחום אנרגיה ובריאות. עם זאת, התרחבות לזירה הקלינית הואטה על ידי חששות בטיחות והיעדר פיתוח קריטריונים לעיצוב במעגלים גנטיים vivo. האצת יישומים רפואי השפעה גבוהה תדרוש שימוש בשיטות שממשק ישיר עם תשתית רפואית, מעגלים גנטיים שפועלים מחוץ לסביבת המעבדה המבוקרת, ומארחי חיידקים בטוחים וקלינית מקובלים.

מספר הזנים נחקר לטיפול בסרטן בשל היכולת שלהם לגדול באופן מועדף בגידולים. אלה כללו ג נובי, E. coli, ו 'cholorae, longum ב', וס typhimurium ^3-8. ס typhimurium יצר עניין מסוים כפי שהם הציגו בטיחות וסובלנות במספר הניסויים קליניים בבני אדם ^9-12. bacteri אלה הוצגו בתחילה כדי ליצור אפקטים אנטי סרטניים באמצעות גירוי של מערכת החיסון על ידי המארח ודלדול של חומרים מזינים הנדרשים לחילוף חומרים של תאי סרטן. ייצור של מטענים הטיפוליים מאוחר יותר נוסף בעקבות שינויים גנטיים. בעוד שמחקרים אלה מייצגים התקדמות חשובות בשימוש בחיידקים לטיפולים סרטניים, רוב המאמצים קיימים יש לסמוך על ביטוי ברמה גבוהה, שנובע בדרך כלל במשלוח של מינונים גבוהים, אפקטים מחוץ היעד, והתפתחות של עמידות מארח ^13-16 .

עכשיו, ביולוגיה סינטטי עשויה להוסיף ייצור מטענים לתכנות על ידי ניצול מעגלים גנטיים המחשוב מעוצב שיכול לבצע חישה ומשלוח ^17-20 מתקדמות. יכולים להיות מתוכננים מעגלים אלה לפעול כמערכות שיגור שחשים גירויים ספציפיים לגידול וייצור מטענים עצמי לווסת לפי צורך. עם זאת, לומד את הפונקציה של מעגלים אלה in vivo עד כה היה מאתגר.

> Ve_content "מאז פלסמידים הם המסגרת המשותפת למעגלים סינטטיים, אנו מתארים שיטה כדי לאפיין את הדינמיקה של ביטוי גנים המבוסס על פלסמיד in vivo תוך שימוש במודל עכבר. שיטות אלה לנצל הדמיה הארה זמן לשגות ומדידת כמותית של biodistribution. יחד, גישות אלה מספקות מסגרת ללימוד רשתות מבוססות פלסמיד in vivo עבור יישומים קליניים.

Protocol

1. הכנת תא

1. שורות תאי מעבר תוך שימוש בטכניקות סטנדרטיות תרבות תא. בניסוי זה, השתמשנו בתאי OVCAR-8 (NCI מאגר DCTD גידול, פרדריק, MD). לגדל תאים ליעד confluency של 80 - 100%.
2. דגירה תאים עם טריפסין 5 מ"ל במשך 5 דקות, ואז מוסיף 5 מיליליטר מדיום RPMI + FBS להשבית טריפסין.
3. קציר וספירת תאים בhemocytometer. Resuspend בללא DMEM פנול האדום בריכוז היעד של 5 x 10 ⁷ תאים / מ"ל, או כ -200 μl לכל בקבוק.
4. הוסף צמיחה המופחת של 15% גורם Matrigel (BD Biosciences) ולשמור את ההשעיה התא על קרח עד השתלה.

2. השתלת גידול

1. הרדימי 4 נקבות עכברים ישנים שבוע NCR / נו באמצעות 3% isoflurane ולחכות בערך 5 דקות על מנת להבטיח הרדמה עמוקה. השתמש במשחת וטרינר על עיניים כדי למנוע יובש ואילו בהרדמה.
2. לטעון את התאים (100 μl לגידול) במזרק 1 מ"ל ולצרף 27 1/ 2 מחט מד.
3. לכל אחד משני אתרי הזרקת כנף עוקץ אחוריות בין שתי המדינות, להרים את העור בעדינות עם מלקחיים כדי להפוך את האוהל ולהזריק תאים בבסיס. הקפד לא לחדור עמוק מדי, ייצור דם. להשתמש בפינצטה כדי להסיר בעדינות מזרק ללא ניתזים.
4. לפקח על צמיחת גידול ביום למשך 10 - 20 ימים עד קוטר גידול של 2 - 4 מ"מ הוא הגיע.

3. הכנת חיידקים

1. התחל תרבות לילה של חיידקים ב3 מ"ל LB תקשורת + אמפיצילין ממניות מקפיא C -80 או צלחת בקירור. בניסוי זה, השתמשנו בס typhimurium הזן ELH430 (SL1344 PhoPQ-aroA-).
2. בבוקר, לדלל 1:100 התרבות לLB המסונן ולגדול לOD600 0.4-0.6.
3. ספין למטה ולשטוף 3 פעמים בופר פוספט (PBS) וresuspend בOD600 סופי של 0.1 (כ 1 x 10 ⁷ תאים / מ"ל).

4. הזרקת חיידקים

1. להרדים את החיהעמדת ד בצד שלה עם הזנב מצביע לכיוון היד הדומיננטית שלך. השתמש במשחת וטרינר על עיניים כדי למנוע יובש ואילו בהרדמה.
2. להתרחב וריד הזנב באמצעות מים חמים או מנורת חום.
3. טען את החיידקים (100 μl לכל עכבר) במזרק 1 מ"ל ולכופף את הקצה רק פחות מ -90 מעלות.
4. יישר את קצה המזרק עם וריד הזנב, לחדור בעומק רדוד (צריך להרגיש שום התנגדות), ולהזריק חיידקים. שים לב לעקירת זרימת דם לזריקה מוצלחת.

5. עכבר הדמיה

1. להרדים בעלי חיים בחדר האינדוקציה ואז למקם כל עכבר על פלטפורמת ההדמיה. השתמש במשחת וטרינר על עיניים כדי למנוע יובש ואילו בהרדמה. לשמור על מיקום מדויק על מנת להבטיח תוצאות כמותיות בין נקודות זמן.
2. בעלי חיים תמונה באמצעות מערכת ההדמיה IVIS הספקטרום (Caliper מדעי חיים). אם הדמיה של בעלי חיים יותר מאשר 1, מקום מחסומי אור ביניהם כדי למנוע צולב illumination. בעלי חיים צריכים להיות צילמו ראשון בצד הגחון כדי לאשר לוקליזציה של חיידקים.
3. בעלי חיים תמונה באמצעות dorsally IVIS כל 2 שעות למשך תקופת הניסוי (36 שעות). ליצור כמובן זמן להחזר השקעה נתון.

6. כימות biodistribution קטריאלי

1. להרדים בעלי חיים באמצעות CO ₂ ומקום על הגב על חיתול סופג.
2. הפעל את החיה כדי לחשוף את שני גידולים תת עורי כנף העוקץ האחוריות. חותכים את רקמת העור שמסביב כדי להפריד ולהסיר את הגידולים. מחזיק את הגידול עם פינצטה, להסיר את העור באמצעות תנועת מספריים הפוכה. כאשר רובו של העור הופרד, להסיר לחלוטין את הגידול באמצעות פינצטה.
3. מניחים את האיברים בצינורות microcentrifuge-שקלו מראש. מאז המסה של צינורות אלה יכולים להשתנות באופן משמעותי חשוב לשקול מראש אותם לתוצאות כמותיות.

7. כימות biodistribution קטריאלי

1. עבור כל נקודת זמן, בלו, ולשקול את הגידולים.
2. להוסיף 500 + 15% גליצרול PBS μl וhomogenize באמצעות רקמות-Tearor (BioSpec). יש לשטוף את 3 פעמים homogenizer עם אתנול בין דגימות.
3. ליצור דילולים וצלחת לספירת מושבה חיידקים סדרתיים. לצלחת דילולים מרובים בצלחות שימוש מראש מחולקות צלחת אחת.

Representative Results

באמצעות פרוטוקול זה, אנו מסוגלים להפיק נתונים על צמיחה בvivo ודינמיקת ביטוי גנים של חיידקים ממוקדים סרטניים. זרימת העבודה הכוללת מסוכמת באיור 1.

בשלב הראשון, אנו מזריקים חיידקים (ירוק) ותמונת חיה באמצעות IVIS למדוד ביטוי גנים עם הארה (כחול) כמדווח.

לאחר מכן, בשלב השני, אנו בלו, homogenize, וגידולים צלחת לספירת מושבה כדי לקבוע את מספר החיידקים הגדלים בגידול.

פליטת אור שנוצר על ידי זני חיידקים הוא IVIS מדגים בעזרת (איור 2). עליות אות עם מינון מוזרק, עם מינון מינימאלי סביב קולוניאליסטי 5 x 10 ⁵ (איור 2 א). בכל המקרים, חיידקים מוחלשים הם רק מסוגלים גם ליישב במיוחד גידולים או להיכשל לגדול בעכברים. אות היא לכמת באמצעות יחידות זוהר לnormaliZE לזמן חשיפה, שבו ערכים אופייניים של 10 ^ 6 ומעלה מעידים על התישבות.

לזיהום נתון, עליות אות עם זמן על פני 24-48 שעות (איור 2). הופעת השיא היא סביב 36 שעות לאחר הזרקה, אך העיתוי עשוי להשתנות בהתאם לעומס ופלסמיד בשימוש. הקפד למקם את העכבר בדיוק באותו אופן בכל פעם על מנת להבטיח תוצאות כמותיות.

בסדרה הבאה של ניסויים, biodistrution חיידקים הוא לכמת למדוד את הצמיחה של חיידקים על פני זמן (איור 3). חיידקי קיימא בגידולים לכמת ידי מוציא ומאחד את הגידול וציפוי בדילולי סדרתי (איור 3 א). ניתן גם לכמת איברים אחרים באופן דומה. הנה, יש לנו להשתמש בטחול, שכן יחס גידול הטחול הוא מדד טיפוסי של ייחוד חיידקי ^{21, 22.}

סעיפים אלה מאפשרים לנו למדוד את אוכלוסיות החיידקיםtion לאורך זמן (איור 3). בצד השמאל, ניתן לראות כי מספר החיידקים לגדול בהתמדה בגידול לאורך כל תקופת הניסוי, עם זמן הכפלה של 1-3 שעות, באופן משמעותי איטי יותר מאשר בניסויי התרבות אצווה. שיעור מופחת זה עשוי בשל התנאים התזונתיים העניים בסביבת הגידול. בצד ימין, יש לנו לכמת את יחס גידול הטחול ולב, כי זה מגביר לאורך כל הניסוי. ממצא זה מדגים סגוליות, שבספירת הטחול הן בעצם קבועה, בעוד החיידקים ימשיכו לגדול בגידול.

איור 1. סכמטי של התהליך הניסיוני הכולל. (א) חיידקים מוזרקים בזנב הווריד ובמיוחד ליישב גידולים. (ב) בכל נקודת זמן, גידולים הם נכרת,הומוגני, ומצופה לספירת מושבה. הודפס מחדש באישור ^25. כל הזכויות שמורות 2012 האגודה אמריקנית לכימיה.

איור 2. הדמיה הארה שלמה חיה באמצעות IVIS. () אות עולה עם מינון הזרקה ו (ב) זמן. מותאם באישור ^25. כל הזכויות שמורות 2012 האגודה אמריקנית לכימיה.

איור 3. ספירת ציפוי ומושבה למדוד דינמיקת צמיחה. (א) דילולים סדרה לאפשר מושבות בודדות לתיספרנה למדגם מייצג טחול (תחתון). (ב) על ידי ביצוע ספירות אלה, אנו יכולים ליצור באמצעים אוכלוסיית vivo של חיידקים בתוך הגידולים ( כמו בB </ Strong>) מספר התאים עם ובלי פלסמיד (כמו בג) והגידול יחס טחול (כמו בד). מותאם באישור ^25. כל הזכויות שמורות 2012 האגודה אמריקנית לכימיה.

Discussion

באמצעות הליך זה, אנו מסוגלים לייצר קורסי זמן לצמיחה ודינמיקת ביטוי גנים של חיידקים מיישבים גידולים. בעוד מדידות אלה מבוצעות באופן שגרתי במבחנה בתרבות אצווה או מכשירים מיקרופלואידיקה, הם הרבה יותר קשים לבצע בגוף חי.

ישנם כמה שינויים שניתן ליישם שיטות אלה. בזמן שאנחנו משמשים-OVCAR 8 שורת התאים לייצר המודלים העכבר שלנו, מספר שורות תאים אחרים עשוי להיות בשימוש באופן שקול. לדוגמה, ניתן להשתמש בשורות תאי luciferized שתאפשרנה לcolocalization 3D של ערוצי לוציפראז סרטניים וחיידקים. בנוסף לכך, בזמן שאנחנו השתמשנו במודל דו צדדי אחורי אגף, מספר שונה ומיקומם של אתרי הזרקה עשוי לשמש ליצירת מודלים לחקר תופעות שונות. לדוגמה, אם גודל גידול הוא משתנה חשוב, ניתן להכין דילולים סדרתי של תאים והזריקו לאתרים שונים בו זמנית, שהניבו smalטיט וגידולים גדולים יותר בגודל. לבסוף, בזמן שאנחנו משמשים ס typhimurium זן ELH430, זנים אחרים של ס ' typhimurium או חיידקים אחרים כגון ג נובי, E. coli, V. cholorae, longum ב 'עשוי לשמש באופן שקול עם שיטות אלה, אם כי בספירת החיידקים להזרקה ייתכן שתצטרך להיות מותאמת.

השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול זה כרוך ביצירת מודל הסרטן בעכבר, וההכנה וההזרקה של חיידקים. ליצירתו של המודל בסרטן, דיוק בספירת התאים וריכוז, עוצמת זריקה, ומיקום אתר הזרקה יהיה מאוד לשפר את העקביות של הגידולים שנוצרו. מצאנו כי גידולים באופן שקול בגודל, בצורה, והניחו ליצור נתוני ההשוואה כמותית ביותר. להכנה של חיידקים, זה קריטי לשטוף אותם לחלוטין לפני הזריקה ולשלוט על ריכוז חיידקים, נפח, ואתר הזרקה בזהירות. צעדים אלה נדרשים avoהשפעה חיסונית מוגזמת id של ההזרקה, וכדי לשמור על השוואת כמותית בין מודלים עכבר נפרדים. מאז את מספר החיידקים שנכנסים לגידול הוא חלק קטן מהחומר המוזרק, שינויים במספר החיידקים מוזרקים בין עכברים יכולים לגרום להבדלים דרמטיים על התקדמות מושבה. לקבלת מידע נוסף, ראה כמה התייחסויות נוספות על הכנה לחיידקים כמותי במחקרי vivo ^{3, 4,}

בעוד טכניקות אלה הן ישימות מאוד למגוון רחב של מחקרים ספציפיים, כמה מגבלות קיימות להארכה ליישומים מסוימים. לדוגמה, משלוח תוך ורידית של ספירת חיידקים גבוהה לא יכול להיות רצוי לחיידקים מסוימים ו / או לדגמי עכבר בשל השפעה חיסונית. תוואי חלופי הוא אחד מממשל מסירה אוראלית (gavage), טכניקה שתוארה על יופיטר ^23. בנוסף, זמן לשגות הדמיה יכולה להיות די עתיר עבודה בהתאם למפרטאורך ניסוי FIC, רזולוציה פעמית, וציוד זמין. מיכון תהליך ההדמיה יהיה להקל על רבים מחולשות אלה, אלא גם מציג את האתגרים טכניים חדשים. עכבר האיברים החיוניים, כגון קצב לב, קצב נשימה, טמפרטורה חייבים להיות במעקב רציף על ידי ציוד נוסף. בנוסף, להרדמה לטווח ארוך, משחות עיניים יש להשתמש כדי לשמור על הלחות מתאימה. לבסוף, ברמה של חומר ההרדמה נמסרה לעכבר חייב להיות מותאמת באופן רציף כדי לשמור על העומק הנכון של הרדמה. מערכת בקרת משוב בחוג סגורה, המשלבת מדידות חיוניות עכבר עם משלוח הרדמה תקל מאוד את התהליך הזה.

בעוד ביולוגיה סינטטי השיגה הצלחה רבה ^{17, 19, 20,} החלת מעגלי גנים מהונדסים ביישומי vivo ידרוש כמותי, בקורסי זמן vivo להודיע ​​עקרונות עיצוב. ס typhimurium הוא זן מצוין לBiol הסינטטי הקליניogy לטיפול בסרטן שכן הוא דומה לE. coli, במיוחד colonizes גידולים, והוכח בניסויים בבני אדם בטוח קליניים ^{6, 12, 14, 22.} בנוסף, מחקרים שנעשו לאחרונה מצאו כי מעגלים רבים שפורסמו לתפקד בס typhimurium ללא שינוי ^24. באמצעות הפלטפורמה הניסיונית שתוארה כאן, לאחרונה תאר כיצד דינמי בפרופילי ביטוי vivo ניתן לתכנת באמצעות חוסר היציבות הפנימית של וקטורי פלסמיד ^25. בנוסף, מחקר שנעשה לאחרונה פותח שיטות חדשניות לשמירה על יציבות וקטורי פלסמיד in vivo ^23.

בעוד לוציפראז הוא כתב נפוץ בשימוש בתחום ההדמיה vivo לרגישות שלו ^5, יש דוגמאות של מחקרים מצוינים על כמותי בביטוי גני vivo באמצעות GFP ^26. באמצעות GFP יאפשר לחוקר ללמוד את הדינמיקה של מרחב והזמן של חיידקים בודדים in vivo.בנוסף לכך, בזמן שאנחנו השתמשנו במודל תת עורית, הרחבת מחקרים אלה כלפי מודלים רלוונטיים יותר של הסרטן יהיה להגביר עוד יותר את כוחם ⁷ החזוי. מחקרים עתידיים כמו זו עשויות לאפשר בדור הבא של ביולוגיה סינטטי vivo עבור יישומים קליניים.

פיתוח שתי הטכניקות ניסיוניות והחישובית בקונצרט יהיה קריטי להנדסה במעגלים גנטיים vivo. מודלים חישוביים במהירות יכולים לחקור פרמטרים של מערכת לחקור תפוקות פוטנציאליות אבל חייבים להישאר קשור באופן הדוק לתוצאות ניסוי להישאר רלוונטי. עד כה, תוצאות אלה היו קשה להשיג כמותית, נובע בחלקו מחוסר השיטות ללימוד מעגלים גנטיים in vivo.

בונים על פלטפורמה זו, יישומים עתידיים יכללו מעגלי גנים מהונדסים שעוד יותר להרחיב את טווח דינמיקת ביטוי, חישת גירויים ספציפיים לגידול ומוצר מטען ויסות עצמייון לפי צורך. כתחכום של אלה בעליות vivo מעגלים, הדרישות על נתונים כמותיים נדרשות לכוון אותם גם יגדל. אנו מאמינים שהשיטות שתוארו כאן, יחד עם חידושים בתחום ההדמיה עכבר לטווח ארוך, יגרמו תהליך זה אפשרי.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml syringe	BD Biosciences	309602
3/10 cc Insulin Syringe	BD Biosciences	309301
PrecisionGlide Needle	BD Biosciences	301629
RPMI Medium 1640 (1X), liquid, with L-glutamine	Invitrogen	11875-119
Ampicillin	Sigma Aldrich	A0166-5G
LB Agar Broth	Sigma Aldrich	L2897
Luria-Bertani broth	BD Biosciences	244610