Måling Vekst og Gene Expression Dynamics of Tumor-målrettet Published: July 6, 2013 doi: 10.3791/50540

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Tal Danino*¹, Arthur Prindle*², Jeff Hasty^2,3,4, Sangeeta Bhatia^1,5,6,7,8

¹Health Sciences and Technology, Massachusetts Institute of Technology, ²Department of Bioengineering, University of California, San Diego, ³Biocircuits Institute, University of California, San Diego, ⁴Molecular Biology Section, Division of Biological Science, University of California, San Diego, ⁵Broad Institute of Harvard and MIT, ⁶Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, ⁷Electrical Engineering and Computer Science and David H. Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology, ⁸Howard Hughes Medical Institute

* These authors contributed equally

Summary

Målet med disse forsøkene er å generere kvantitative tid-retters data på vekst og genuttrykk dynamikk av svekket

Abstract

Målet med disse forsøkene er å generere kvantitative tid-retters data på vekst og genuttrykk dynamikk av svekket S. typhimurium bakterielle kolonier vokser inni svulster.

Vi generert modell xenografttumorer hos mus ved subkutan injeksjon av en menneskelig eggstokkreft cellelinje, ovčar-8 (NCI DCTD Tumor Repository, Frederick, MD).

Vi forvandlet svekkede stammer av S. typhimurium bakterier (ELH430: SL1344 ^phoPQ-1) med en konstitutivt uttrykt luciferase (luxCDABE) plasmid for visualisering ^to. Disse stammer som er spesielt kolonisere svulster mens resterende i hovedsak ikke-virulente til musen ^en.

Når målbare tumorer var etablert ble bakterier injisert intravenøst ​​via halevenen med varierende dosering. Tumor-lokalisert, ble bakteriell genekspresjon overvåkes i sanntid i løpet av 60 timer ved hjelp av enin vivo avbildning system (IVIS). På hvert tidspunkt ble svulster fjernet, homogenisert, og belagt å kvantifisere bakterielle kolonier for korrelasjon med genekspresjonsdata.

Sammen gir disse opplysninger et kvantitativt mål på in vivo veksten og genekspresjon dynamikk av bakterier som vokser inne i tumorer.

Introduction

Syntetisk biologi har utviklet seg raskt de siste ti årene og er nå posisjonert til å påvirke viktige problemer i energi og helse. Imidlertid har ekspansjon i den kliniske arena blitt bremset av sikkerhetsmessige hensyn og et fravær av å utvikle design kriterier for in vivo genetiske kretser. Akselererende high impact medisinske anvendelser vil kreve å benytte metoder som grensesnittet direkte med medisinsk infrastruktur, genetiske kretser som fungerer utenfor det kontrollerte lab setting, og trygge og klinisk akseptert mikrobielle verter.

Et antall stammer er blitt undersøkt for behandling av kreft på grunn av deres evne til å vokse fortrinnsvis i svulster. Symptomene har omfattet C. novyi, E. coli, V. cholorae, B. Longum, og S. typhimurium ^3-8. S. typhimurium har generert spesiell interesse som de har stilt sikkerhet og toleranse i en rekke kliniske studier ^9-12. Disse bacteri en ble først vist til å skape anti-tumor virkninger gjennom stimulering av vertens immunsystem og ved uttømming av næringsstoffer som kreves for kreftcelle metabolisme. Produksjon av terapeutisk lasten ble senere lagt gjennom genetiske modifikasjoner. Mens disse studiene representerer viktige fremskritt i bruk av bakterier for tumor terapi, har flertallet av eksisterende innsats stolt på høyt nivå uttrykk som vanligvis resulterer i levering av høye doser, off-target effekter, og utvikling av host motstand ^13-16 .

Nå kan syntetisk biologi legge programmerbar last produksjon ved å utnytte beregningsmessig-designede genetiske kretser som kan utføre avanserte sensorer og levering ^17-20. Disse kretser kan være utformet for å fungere som leveringssystemer som føler tumor-spesifikke stimuli og selv regulere last produksjon etter behov. Imidlertid har studere funksjonen av disse kretser i vivo hittil vært vanskelig.

ve_content "> Siden plasmider er et felles rammeverk for syntetiske kretser, beskriver vi en metode for å karakterisere dynamikken i plasmid-genekspresjon in vivo ved hjelp av en mus modell. utnytte Disse metodene time-lapse luminescens bildebehandling og kvantitativ måling av biodistribusjon. Sammen disse metodene gir et rammeverk for å studere plasmid-baserte nettverk in vivo for kliniske applikasjoner.

Protocol

En. Celleforberedelsen

1. Passasje cellelinjer med standard cellekultur teknikker. I dette forsøket brukte vi ovčar-8 celler (NCI DCTD Tumor Repository, Frederick, MD). Dyrk celler til et mål sammenflyting på 80 - 100%.
2. Inkuber cellene med 5 ml trypsin i 5 min, deretter legge til 5 ml RPMI medium + FBS å inaktivere trypsin.
3. Innhøsting og telle celler i et hemocytometer. Resuspender i fenol rød-fri DMEM i en ønsket konsentrasjon av 5 x 10 ⁷ celler / ml, eller omtrent 200 ul per kolbe.
4. Tilsett 15% redusert vekstfaktor Matrigel (BD Biosciences) og holde celle-suspensjon på is inntil implantasjon.

2. Tumorimplantasjonen

1. Anesthetize fire uker gamle hunn NCR / Nu mus med 3% isofluran og vente ca 5 min å sikre dyp anestesi. Bruk dyrlege salve på øynene for å hindre tørrhet mens under anestesi.
2. Laste cellene (100 mL per tumor) i en 1 ml sprøyte og sett på en 27 1/ 2 kanyle.
3. For hver av de to bilaterale hind flanke injeksjonssteder, løfter huden forsiktig med pinsett for å lage et telt og injisere celler på basen. Pass på ikke å trenge for dypt, produsere blod. Bruk pinsett til å forsiktig fjerne sprøyte uten sprut.
4. Overvåk tumorvekst daglig i 10 - 20 dager inntil en svulst diameter på 2-4 mm.

3. Bakterier Forberedelse

1. Starte en overnatting kultur av bakterier i 3 ml LB media + Ampicillin fra en -80 C fryser lager eller nedkjølt plate. I dette forsøket har vi brukt S. typhimurium belastning ELH430 (SL1344 PhoPQ-Aroa-).
2. I morgen, fortynne kulturen 1:100 inn filtrert LB og vokse til OD600 0,4 til 0,6.
3. Spinn ned og vaskes tre ganger i fosfatbufret saltvann (PBS) og resuspender ved en endelig OD600 på 0,1 (ca. 1 x 10 ⁷ celler / ml).

4. Bakterier Injection

1. Anesthetize dyret end posisjon på siden med halen peker mot din dominerende hånd. Bruk dyrlege salve på øynene for å hindre tørrhet mens under anestesi.
2. Strekke halevenen med varmt vann eller en varmelampe.
3. Last inn bakterier (100 mL per mus) i en 1 ml sprøyte og bøye spissen bare mindre enn 90 grader.
4. Rett inn sprøytespissen med halen vene, trenge på en grunne dybde (hvis du kjenner noen motstand), og injisere bakterier. Observer bloodflow slagvolum for en vellykket injeksjon.

5. Mus Imaging

1. Anesthetize dyr i induksjon kammer deretter plassere hver mus på bildebehandling plattformen. Bruk dyrlege salve på øynene for å hindre tørrhet mens under anestesi. Opprettholde presis posisjonering for å sikre kvantitative resultater mellom tidspunkter.
2. Bilde dyr ved hjelp av IVIS Spectrum imaging system (Caliper Life Sciences). Hvis bildebehandling mer enn ett dyr, sted lys barrierer mellom dem for å unngå kryss-illuminering. Dyr skal avbildes først på den ventrale side for å bekrefte lokaliseringen av bakterier.
3. Bilde dyr dorsalt ved hjelp IVIS hver 2 timer for varigheten av forsøket (36 timer). Generere en gang kurs for en gitt avkastning.

6. Kvantifisere Bakteriell biodistribusjon

1. Avlive dyr med CO ₂ og legg den tilbake på et absorberende bleie.
2. Slå dyret å eksponere de to hind flanke subkutane svulster. Skjær den omkringliggende hud vev for å skille ut og fjerne svulster. Holde svulsten med pinsett, fjerner huden ved hjelp av en omvendt saks bevegelse. Når de fleste av huden har blitt separert, fullt fjerne svulsten ved hjelp av pinsett.
3. Plasser organer i pre-veide mikrosentrifugerørene. Siden massen av disse rør kan variere betydelig, er det viktig å foreta en veie dem for kvantitative resultater.

7. Kvantifisere Bakteriell biodistribusjon

1. For hvert tidspunkt, forbrukeravgift og veie svulster.
2. Legg til 500 mL PBS + 15% glyserol og homogenisere ved hjelp av en Tissue-Tearor (Biospec). Skyll homogenisatoren 3 ganger med etanol mellom prøvene.
3. Generere seriefortynning og plate for bakteriell koloni telling. Til plate flere fortynninger på en enkelt plate bruker pre-delt plater.

Representative Results

Ved hjelp av denne protokollen, er vi i stand til å generere data på in vivo vekst og genuttrykk dynamikk av tumor målrettede bakterier. Den samlede arbeidsflyten er oppsummert i figur 1.

I den første fasen, injiserer vi bakterier (grønn) og image dyret bruker IVIS å måle genuttrykk med luminescens (blå) som reporter.

Deretter, i det andre trinn, vi avgiften, homogenisere og plate-tumorer for kimtall for å bestemme antall bakterier som vokser i tumoren.

Bioluminescence generert av bakteriestammer er visualisert ved hjelp IVIS (figur 2). Signal øker med injisert dose, med et minimum kolonisere dosering rundt 5 x 10 ⁵ (Figur 2A). I alle tilfeller, attenuerte bakterier er bare i stand til å enten spesielt kolonisere tumorer eller mislykkes i å vokse i mus. Signal kvantifiseres utstråling enheter til normaliseringze for eksponeringstid, hvor typiske verdier på 10 ^ 6 eller høyere er indikative for kolonisering.

For en gitt infeksjon, signal øker med tiden enn 24-48 timer (figur 2B). Toppen utbruddet er rundt 36 timer etter injeksjon, men tidspunktet kan variere avhengig av belastningen og plasmidet som brukes. Sørg for å plassere musen på nøyaktig samme måte hver gang for å sikre kvantitative resultater.

I det neste sett av eksperimenter, er bakteriell biodistrution kvantifiseres for å måle veksten av bakterier over tid (figur 3). Levedyktige bakterier i svulster er kvantifisert ved excising og homogenisere svulsten og platekledning på seriefortynninger (figur 3A). Andre organer kan også kvantifiseres tilsvarende. Her har vi benyttet milt, siden tumor milt-forholdet er et typisk mål på spesifisitet bakteriell ^{21, 22..}

Disse teller tillate oss å måle bakteriell befolkningensjon over tid (Figur 3B). På venstre, kan vi se at antall bakterier vokse jevnt i tumoren i løpet av varigheten av forsøket, med en doblingstid på 1-3 timer, betydelig langsommere enn i batch-kultur-eksperimenter. Dette reduserte satsen er sannsynligvis på grunn av dårlige næringsforhold i svulsten miljøet. På høyre, har vi kvantifisert tumor-milt-forhold og observere at det øker gjennom hele eksperimentet. Dette funnet viser spesifisitet, ved at milten teller er i det vesentlige konstant mens bakterier fortsette å vokse i tumoren.

Figur 1. Skjematisk av den generelle eksperimentelle prosess. (A) Bakterier som injiseres ved hale-venen og spesifikt kolonisere tumorer. (B) ved hvert tidspunkt, ble tumorer skåret ut,homogenisert, og belagt for kimtall. Gjengitt med tillatelse ^25. Copyright 2012 American Chemical Society.

Figur 2. Hel-dyr luminescens avbildning ved hjelp IVIS. (A)-signal øker med injeksjon dosering og (b) tid. Tilpasset med tillatelse ^25. Copyright 2012 American Chemical Society.

Figur 3. Platekledning og kolonien teller for å måle vekst dynamikk. (A) Seriefortynninger tillater individuelle kolonier å bli regnet for et representativt milt sample (nederst). (B) Ved å følge disse teller, kan vi skape in vivo befolkningen tiltak av bakterier inne i svulster ( som i b </ Sterk>) antall celler med og uten plasmidet (som i c) og svulsten til milt-forhold (som i d). Tilpasset med tillatelse ^25. Copyright 2012 American Chemical Society.

Discussion

Ved hjelp av denne prosedyren, er vi i stand til å generere tid kurs for vekst og genuttrykk dynamikk av bakterier koloniserer svulster. Selv om disse målingene er rutinemessig utført in vitro i batch-kultur eller MicroFluidics enheter, de er mye mer vanskelig å utføre in vivo.

Det er flere endringer som kan brukes til disse metodene. Selv om vi brukte ovčar-8-cellelinje for å generere våre mus modeller, kan en rekke andre cellelinjer benyttes tilsvarende. For eksempel kan luciferized cellelinjer brukes som tillater 3D colocalization av tumor og bakteriell luciferase kanaler. I tillegg kan mens vi brukte en bilateral flanke hind-modell, et annet antall og plassering av injeksjonssteder brukes til å generere modeller for å studere forskjellige fenomener. For eksempel er hvis tumor størrelse en viktig variabel, kan serielle fortynninger av cellene være forberedt og injisert til forskjellige steder samtidig, genererer smaller-og større størrelse svulster. Til slutt, mens vi brukte S. typhimurium belastning ELH430, andre stammer av S. typhimurium eller andre bakterier slik som C. novyi, E. coli, V. cholorae, kan B. Longum brukes ekvivalent med disse metodene, men de bakterietall for injeksjon kan være nødvendig å justere.

De mest kritiske trinnene i denne protokollen innebærer etableringen av mus kreft modell, og utarbeidelse og injeksjon av bakterier. For etableringen av kreft modell, vil presisjon i celletall og konsentrasjon, injeksjon volum, og injeksjonsstedet plassering i stor grad forbedre konsistensen av svulstene som genereres. Vi har funnet at ekvivalent størrelse, formet og plassert tumorer skape de mest sammenlignbare data kvantitativt. For fremstilling av bakterier, er det avgjørende å fullstendig vaske dem før injeksjon og å kontrollere for bakteriene konsentrasjon, volum, og injeksjonsstedet nøye. Disse trinnene er pålagt å avoid overdreven immunologisk påvirkning av injeksjonen, og for å opprettholde kvantitativ sammenligning mellom separate musemodeller. Siden antallet av bakterier som kommer inn i tumoren er en liten brøkdel av den injiserte dose, kan variasjoner i antall av bakterier mellom injiserte mus resultere i dramatiske forskjeller på koloni progresjon. For mer informasjon, se flere andre referanser på bakteriell forberedelse til kvantitativ in vivo studier ^{3, 4,}

Mens disse teknikkene er svært tilpasningsdyktig til en rekke spesifikke studier, noen begrensninger finnes for å utvide til visse applikasjoner. For eksempel kan intravenøs levering av høye bakterietall ikke være ønskelig for visse bakterier og / eller musemodeller på grunn av immunologisk effekt. Et alternativ tilførselsvei er oral levering (sonde), en teknikk som er beskrevet på Jove ^23. I tillegg kan time-lapse bildebehandling være ganske arbeidskrevende avhengig av spesiFIC eksperiment lengde, tid-oppløsning og utstyr tilgjengelig. Automatisere bildebehandling prosessen ville lindre mange av disse byrdene, men introduserer også nye tekniske utfordringer. Mus vitals som hjertefrekvens, pustefrekvens, og temperaturen må være kontinuerlig overvåket av ekstra utstyr. I tillegg, For å oppnå langvarig anestesi, må øyesalver bli brukt for å opprettholde tilstrekkelig fuktighet. Endelig må nivået av anestesi levert til mus justeres kontinuerlig for å opprettholde den riktige dybden av anestesi. Et lukket feedback styresystem som integrerer mus vitale mål med bedøvelse levering vil i stor grad forenkle denne prosessen.

Mens syntetisk biologi har oppnådd stor suksess ^{17, 19, 20,} anvende konstruerte genet kretser til in vivo-anvendelser vil kreve kvantitativ, in vivo tid kurs for å informere utformingsprinsippene. S. typhimurium er en utmerket belastning for klinisk syntetisk biollogi for kreftterapi, siden den er lik E. coli, koloniserer spesielt svulster, og har vist seg trygge i kliniske studier ^{6, 12, 14, 22.} I tillegg har nyere studier funnet at mange publiserte kretser fungere i S. typhimurium uten forbehold ^24.. Ved hjelp av den eksperimentelle plattformen beskrevet her, vi nylig beskrev hvordan dynamisk in vivo uttrykk profiler kan programmeres ved hjelp av den iboende ustabilitet av plasmidvektorer ^25. I tillegg har senere forskning utviklet nye metoder for stabilt å opprettholde plasmidvektorer in vivo ^23..

Mens luciferase reporter er en vanlig anvendt for in vivo avbildning for dens følsomhet ^5, finnes det eksempler på gode kvantitative studier på in vivo-genekspresjon ved hjelp av GFP ^26.. Ved hjelp av GFP ville tillate forskeren å studere romlig-temporale dynamikken i enkelte bakterier in vivo.I tillegg, mens vi brukte en subkutan modell, utvide disse studiene mot mer relevante modeller av kreft vil ytterligere øke sin prediktiv effekt ^7. Fremtidige studier som dette kan muliggjøre en neste generasjon in vivo syntetisk biologi for kliniske applikasjoner.

Utvikle både eksperimentelle og beregningsorientert teknikker i konserten vil være avgjørende for prosjektering in vivo genetiske kretser. Beregningsorientert modellering kan raskt sondere systemparametrer å utforske mulige utganger, men må være nært knyttet til eksperimentelle resultater å forbli relevant. Så langt har disse resultatene vært vanskelig å skaffe kvantitativt, delvis på grunn av mangel på metoder for å studere genetiske kretser in vivo.

Bygge på denne plattformen, vil fremtidige bruksområder er konstruert genet kretser som ytterligere utvide omfanget av uttrykket dynamikk, sensing tumor-spesifikke stimuli og selvregulerende last produktion etter behov. Som raffinement av disse in vivo kretser øker, kravene til kvantitative data som kreves for å stille dem vil også øke. Vi tror at metodene beskrevet her, sammen med nye innovasjoner i langsiktig mus bildebehandling, vil gjøre denne prosessen mulig.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml syringe	BD Biosciences	309602
3/10 cc Insulin Syringe	BD Biosciences	309301
PrecisionGlide Needle	BD Biosciences	301629
RPMI Medium 1640 (1X), liquid, with L-glutamine	Invitrogen	11875-119
Ampicillin	Sigma Aldrich	A0166-5G
LB Agar Broth	Sigma Aldrich	L2897
Luria-Bertani broth	BD Biosciences	244610