Summary
Цель этих экспериментов является получение количественных временных данных курса на рост и динамику экспрессии гена ослабленного
Abstract
Цель этих экспериментов является получение количественных временных данных курса на рост и динамику экспрессии генов ослабленных С. Typhimurium бактериальных колоний, выросших внутри опухолей.
Мы создали модель ксенотрансплантатом опухолей у мышей путем подкожной инъекции линии человеческих клеток рака яичников, OVCAR-8 (NCI УСПД Опухоль репозиторий, Фредерик, MD).
Мы превратили ослабленные штаммы S. Typhimurium бактерий (ELH430: SL1344 phoPQ-1) с конститутивной выразил люциферазы (luxCDABE) плазмиды для визуализации 2. Эти штаммы специально колонизировать опухолей, оставаясь по существу невирулентного к мыши 1.
После измеримых опухолей были созданы, бактерии вводили внутривенно через хвостовую вену с различной дозировкой. Опухоль локализованный, бактериальной экспрессии гена контролировать в реальном времени в течение 60 часов с использованиемВ естественных изображений системы (IVIS). В каждый момент времени, опухоли вырезали, гомогенизировали и высевают на чашки с количественной бактериальных колоний для корреляции с данными экспрессии генов.
Вместе эти данные дает количественную меру в естественных условиях роста и динамика экспрессии генов бактерий, растущих внутри опухолей.
Introduction
Синтетическая биология шло быстрыми темпами в течение последнего десятилетия и в настоящее время намеревается повлиять важных проблем в энергии и здоровья. Тем не менее, экспансия в клинической практике была замедлена проблемы безопасности и отсутствие разработки проектно критериев в естественных генетических схем. Высокочастотное ускоряющее воздействие медицинских приложений потребует использования методов, которые взаимодействуют напрямую с медицинской инфраструктуры, генетических схем, которые функционируют за пределами контролируемых условиях лаборатории, и безопасным и клинически принято микробными хозяевами.
Число штаммов были исследованы для лечения рака из-за их способности расти преимущественно в опухолях. К их числу относятся C. Новый, кишечная палочка, В. cholorae, Б. лонгум и С. Typhimurium 3-8. С. Typhimurium вызвал особый интерес, поскольку они выставлены безопасности и толерантности в ряде клинических испытаний на человеке 9-12. Эти bacteri первоначально показали создать противоопухолевый эффект посредством стимуляции иммунной системы хозяина и истощением питательных веществ, необходимых для рака клеточного метаболизма. Производство лечебно груза была добавлена позднее с помощью генной модификации. Хотя эти исследования представляют важные достижения в использовании бактерий для лечения опухолей, большинство существующих усилий полагались на высоком уровне выражения, которое обычно приводит к поставке высоких дозах, и от ворот эффекты и развитие устойчивости хозяина 13-16 .
Теперь, синтетическая биология может добавить производство программируемых грузов за счет использования вычислительных разработанные генетические схемы, которые могут выполнять расширенный зондирования и доставки 17-20. Эти схемы могут быть разработаны, чтобы действовать в качестве системы доставки, которые воспринимают опухоли специфические стимулы и саморегулирование груз производства по мере необходимости. Тем не менее, изучение функций этих схем в естественных условиях до сих пор было сложно.
ve_content "> Поскольку плазмиды общей основы для синтетических схем, мы опишем метод для характеристики динамики на основе плазмиды экспрессии генов в естественных условиях использования модели мыши. Эти методы используют покадровой визуализации люминесценции и количественного измерения биораспределении. Вместе эти подходы обеспечивают основу для изучения на основе плазмиды сетей в естественных условиях для клинического применения.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка клеток
- Прохождение клеточных линий с использованием стандартных методов культуры клеток. В этом эксперименте мы использовали OVCAR-8 клеток (NCI УСПД Опухоль репозиторий, Фредерик, MD). Рост клеток в целевой слияния 80 - 100%.
- Клетки инкубируют с 5 мл трипсина в течение 5 мин, затем добавляют 5 мл RPMI среда + FBS для инактивации трипсина.
- Урожай и граф клеток на гемоцитометра. Ресуспендируют в фенолового красного DMEM в целевой концентрации 5 × 10 7 клеток / мл или приблизительно 200 мкл на колбу.
- Добавьте 15% скидкой Матригель фактора роста (BD Biosciences) и держать клеточной суспензии на льду до имплантации.
2. Имплантации опухоли
- Обезболить 4-недельных самок на NCR / Nu мышей с использованием 3% изофлурана и ждать примерно 5 мин для обеспечения глубокого наркоза. Используйте ветеринару мазь на глаза, чтобы предотвратить сухость в то время как под наркозом.
- Загрузите клеток (100 мкл на опухоль) в 1 мл шприц и присоединить 27 1/ 2 иглы.
- Для каждого из двух двусторонних задних инъекции сайты фланг, снять кожу осторожно пинцетом, чтобы сделать палатку и вводят клетки у основания. Будьте осторожны, не проникает слишком глубоко, производства крови. Используйте пинцет, чтобы мягко удалить шприц без брызг.
- Мониторинг роста опухоли ежедневно в течение 10 - 20 дней, пока опухоль диаметром 2 - 4 мм не будет достигнута.
3. Бактерии подготовка
- Начать ночной культуры бактерий в 3 мл LB + ампициллин СМИ от -80 C со морозильнике или в холодильнике тарелку. В этом эксперименте мы использовали С. Typhimurium штамм ELH430 (SL1344 PhoPQ-AroA-).
- Утром, развести 1:100 культуры в фильтруется LB и вырасти до OD 600 0,4 - 0,6.
- Спин вниз и промыть 3 раза в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS) и ресуспендируют в конечной OD600 0,1 (приблизительно 1 × 10 7 клеток / мл).
4. Бактерии инъекций
- Обезболить животныхD положение на боку с хвостом по направлению к своей доминирующей рукой. Используйте ветеринару мазь на глаза, чтобы предотвратить сухость в то время как под наркозом.
- Разбавить хвостовую вену использованием теплой воды или тепла лампы.
- Загрузите бактерий (100 мкл на мышь) в 1 мл шприц и согнуть кончик чуть менее 90 градусов.
- Совместите наконечник шприца с хвостовой вены, проникают на небольшую глубину (не должен чувствовать никакого сопротивления), и ввести бактерий. Соблюдайте кровотока смещения для успешной инъекции.
5. Мышь изображений
- Обезболить животных в индукции камеры затем поместить каждую мышь на изображение платформы. Используйте ветеринару мазь на глаза, чтобы предотвратить сухость в то время как под наркозом. Поддержание точного позиционирования для обеспечения количественных результатов между временными точками.
- Изображения животных с использованием спектра IVIS изображений (суппорт Life Sciences). Если изображение более 1 животного, место световые барьеры между ними, чтобы предотвратить перекрестное иллюзиюДИСКРИМИНАЦИИ. Животные должны быть отображены первые на брюшной стороне, чтобы подтвердить локализацию бактерий.
- Изображение животных дорсально использованием IVIS каждые 2 ч в течение продолжительности эксперимента (36 часов). Создание временной ход для данной ROI.
6. Количественная Бактериальные Биораспределение
- Усыпить животных с использованием CO 2 и место на спине с помощью абсорбирующих подгузников.
- Поверните животных, чтобы выставить двух задних фланг подкожных опухолей. Вырезать окружающие ткани кожи для отделения и удаления опухолей. Холдинг опухоли с помощью пинцета, удалить кожу с помощью обратного движения ножницами. Когда большинство кожи был отделен, полностью удалить опухоль с помощью пинцета.
- Поместите органов в предварительно взвешенный микроцентрифужные пробирки. Поскольку масса эти трубы могут существенно важно предварительно взвешивают для количественных результатов.
7. Количественная Бактериальные Биораспределение
- Для каждого момента времени, акцизов и весят опухолей.
- Добавить 500 мкл PBS + 15% глицерина и гомогенизировать использованием Tissue-Tearor (BioSpec). Промыть 3 раза гомогенизатором с этанолом между выборками.
- Создать серийные разведения и пластины для подсчета бактериальных колоний. К пластине нескольких разведений на одной пластине использовать предварительно секционного пластин.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Используя этот протокол, мы можем сгенерировать данные в естественных условиях экономического роста и динамика экспрессии генов опухолевой целевых бактерий. Общий рабочий процесс приведены на рисунке 1.
На первом этапе мы вводим бактерий (зеленый) и изображение животного с использованием IVIS для измерения экспрессии генов с свечения (синий) в качестве репортера.
Затем, на втором этапе акцизной, гомогенизации, и пластина опухолей для подсчета колоний для определения количества бактерий, растущих в опухоли.
Биолюминесценция порожденных бактериальных штаммов визуализируется использованием IVIS (рис. 2). Сигнал возрастает с увеличением дозы вводят с минимальной колонизации доза около 5 × 10 5 (фиг. 2А). Во всех случаях аттенуированных бактерий способны только либо конкретно колонизировать опухолей или не растут в мышах. Сигнал количественно, используя сияние единиц нормировкиге за время экспозиции, где типичные значения 10 ^ 6 или выше свидетельствует о колонизации.
Для данной инфекции сигнала возрастает с течением времени в течение 24-48 ч (фиг. 2В). Пик начала составляет около 36 часов после инъекции, но времени может варьироваться в зависимости от штамма и плазмида используется. Обязательно наведите точно так же каждый раз, чтобы обеспечить количественные результаты.
В следующей серии экспериментов, бактериальные biodistrution количественно измерить рост бактерий в течение долгого времени (фиг. 3). Жизнеспособных бактерий в опухоли количественно путем вырезания и гомогенизации опухоли и покрытие на серийных разведений (фиг. 3А). Другие органы также могут быть количественно аналогично. Здесь мы использовали селезенки, так как опухоль селезенки соотношение является типичным мере бактериальных специфичность 21, 22.
Эти счетчики позволяют нам измерить бактериального населенияния с течением времени (рис. 3В). Слева мы видим, что количество бактерий неуклонно расти в опухоли на протяжении всего эксперимента, причем она удваивалась каждые 1-3 ч, существенно медленнее, чем в экспериментах периодической культуре. Это привело к снижению скорости, скорее всего, из-за плохих условий в питательной среде опухоли. На правом, мы количественно опухоли селезенки соотношение и заметить, что она увеличивается в течение всего эксперимента. Этот результат демонстрирует специфичность, что в селезенке рассчитывает, по существу постоянными, а бактерии продолжают расти в опухоли.
Рисунок 1. Схема общей экспериментальной процесса. (А) бактерии вводятся в хвостовой вены и, в частности колонизировать опухолей. (Б) В каждый момент времени, опухоли вырезали,гомогенизируют и покрытие для подсчета колоний. Печатается с разрешения 25. Copyright 2012 Американского химического общества.
Рисунок 2. Всего-люминесценции животных визуализации с использованием IVIS. (А) сигнал растет с инъекции дозы и (б) времени. Адаптировано с разрешения 25. Copyright 2012 Американского химического общества.
Рисунок 3. Покрытие и подсчета колоний для измерения динамики роста. (А) Серийные разведения позволяют отдельным колониям будут считать репрезентативной выборке селезенки (внизу). (Б) Следуя этим пунктам, мы можем создать в естественных мер популяция бактерий внутрь опухоли ( как в пункте б </ Сильный>) число клеток с и без плазмиды (как в в), и опухоль в селезенке соотношение (как в г). Адаптировано с разрешения 25. Copyright 2012 Американского химического общества.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Используя эту процедуру, мы способны генерировать время курсов для роста и динамики экспрессии генов бактерий колонизации опухолей. В то время как эти измерения выполняются в плановом порядке в пробирке в периодической культуре или микрофлюидики устройств, они гораздо труднее выполнять в естественных условиях.
Есть несколько модификаций, которые могут быть применены к этих методов. В то время как мы использовали OVCAR-8 клеточной линии для получения нашей модели мыши, ряд других клеточных линий могут быть использованы эквивалентно. Например, линии luciferized клетки могут быть использованы, которые позволяют 3D совместной локализации опухоли и бактериальной люциферазы каналов. Кроме того, хотя мы использовали двусторонние задние модели фланг, разное количество и расположение мест инъекций может быть использован для создания моделей для изучения различных явлений. Например, если размер опухоли является важной переменной, серийных разведений клетки могут быть подготовлены и вводили в различных местах одновременно, создавая маленькийлер и больших размеров опухолей. Наконец, в то время как мы использовали S. Typhimurium штамм ELH430, другие штаммы S. Typhimurium или других бактерий, таких как C. Новый, E.coli, В. cholorae, Б. лонгум могут быть использованы эквивалентно с этими методами, хотя количество бактерий для инъекций, возможно, должны быть скорректированы.
Наиболее важным шагом в этом протоколе включают создание модели рака мыши и подготовки и инъекции бактерий. Для создания модели рака, точность клеток и концентрации, объем инъекции, и размещение инъекции значительно повысит согласованность опухолей генерируется. Мы обнаружили, что эквивалентно размеры, форму и помещают опухоли создать наиболее количественно сопоставимых данных. Для приготовления бактерии, очень важно, чтобы полностью вымыть их перед инъекцией и контроля для бактерий концентрации, объема и места инъекции тщательно. Эти шаги, необходимые для AVOID чрезмерное влияние иммунологической инъекции и для поддержания количественного сравнения между отдельными моделями мыши. Поскольку количество бактерий, которые попадают в опухоль представляет собой небольшую часть введенной дозы, вариации в количестве вводили бактерии между мышами, может привести к существенных различий в колонии прогрессии. Для получения дополнительной информации см. несколько дополнительных ссылок на бактериальный препарат для количественных исследований в естественных условиях 3, 4,
Хотя эти методы хорошо адаптируется к различным конкретных исследований, существуют некоторые ограничения для расширения для некоторых приложений. Например, внутривенного введения высоких бактерий не может быть желательно для некоторых бактерий и / или мышиных моделях из-за иммунологические воздействия. Одной из альтернатив путем введения является пероральная доставка (затравки), технику, которая описана на Юпитер 23. Кроме того, в заданный промежуток времени может быть довольно трудоемким в зависимости от образцаFIC длины эксперимента, временным разрешением, и оборудование. Автоматизация процесса формирования изображения может облегчить многие из этих бремя, но и вводит новые технические проблемы. Мышь жизненно важные органы, такие как частота сердечных сокращений, частоты дыхания и температуры должны быть под постоянным контролем дополнительного оборудования. Кроме того, для более долгосрочного анестезии, глазные мази должны быть использованы для поддержания достаточной влажности. Наконец, уровень анестетика доставлены мыши должен постоянно корректироваться для поддержания надлежащего глубину анестезии. Замкнутой системы управления с обратной связью, которая объединяет мышь жизненно важных измерений с анестетиком доставки будет в значительной степени способствовать этому процессу.
В то время как синтетическая биология добилась больших успехов 17, 19, 20, применение генной инженерии цепей в естественных приложений потребует количественного, в естественных условиях курсах время, чтобы сообщить принципы проектирования. С. Typhimurium является отличным деформации для клинического синтетический биолгии для лечения рака, так как он похож на E. палочка, специально колонизирует опухоли, и было показано, безопасны в клинических испытаниях на человеке 6, 12, 14, 22. Кроме того, недавние исследования показали, что многие опубликованных схем функционировать в S. Typhimurium без изменений 24. Используя экспериментальные платформ, описанные здесь, мы недавно описал, как динамические профили в естественных условиях выражение можно программировать с помощью внутренней нестабильности плазмиды векторы 25. Кроме того, недавние исследования разработаны новые способы стабильно поддерживать плазмидные векторы в естественных условиях 23.
В то время как люциферазы является общей репортера используется для прижизненного изображения для его чувствительность 5, есть примеры превосходных исследований по количественному в естественных условиях экспрессии гена GFP использованием 26. Использование GFP позволит исследователю для изучения пространственно-временной динамики отдельных бактерий в естественных условиях.Кроме того, хотя мы использовали модель подкожной, расширяя эти исследования к более соответствующим моделях рака будет способствовать дальнейшему росту их предсказательной силой 7. Будущие исследования, как это может позволить следующему поколению в естественных условиях синтетической биологии для клинического применения.
Разработка экспериментальных и вычислительных методов в концерте будет иметь решающее значение для машиностроения в естественных условиях генетических схем. Численное моделирование может быстро исследовать параметры системы, чтобы исследовать потенциальные выходы, но должны оставаться тесно связано с экспериментальными результатами, чтобы оставаться актуальными. До сих пор эти результаты было трудно получить количественно, отчасти из-за отсутствия методов для изучения генетических схем в естественных условиях.
Исходя их этого, будущие приложения будут включать генной инженерии схем, еще более расширяющих диапазон динамики экспрессии, чувствуя опухоль-специфических стимулов и саморегулируемых груза нефтепродуктовион по мере необходимости. Как сложность этих схем в естественных условиях увеличивается, требования на количественных данных, необходимых для настройки их также будет увеличиваться. Мы считаем, что методы, описанные здесь, наряду с новыми инновациями в долгосрочной мыши изображениями, сделает этот процесс возможным.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы благодарим Х. Флеминг критического чтения и редактирования рукописи. Эта работа была поддержана Misrock Докторантура стипендий (TD) и NDSEG стипендий (AP). ШНБ следователь HHMI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 309602 | |
| 3/10 cc Insulin Syringe | BD Biosciences | 309301 | |
| PrecisionGlide Needle | BD Biosciences | 301629 | |
| RPMI Medium 1640 (1X), liquid, with L-glutamine | Invitrogen | 11875-119 | |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | A0166-5G | |
| LB Agar Broth | Sigma Aldrich | L2897 | |
| Luria-Bertani broth | BD Biosciences | 244610 |
References
- Hohmann, E. L., Oletta, C. A., Miller, S. I. Evaluation of a phoP/phoQ-deleted, aroA-deleted live oral Salmonella typhi vaccine strain in human volunteers. Vaccine. 14 (1), 19-24 (1996).
- Leschner, S., et al. Tumor Invasion of Salmonella enterica Serovar Typhimurium Is Accompanied by Strong Hemorrhage Promoted by TNF-alpha. Plos One. 4 (8), (2009).
- Min, J. J., et al. Quantitative bioluminescence imaging of tumor-targeting bacteria in living animals. Nat. Protoc. 3 (4), 629-636 (2008).
- Min, J. J., et al. Noninvasive real-time imaging of tumors and metastases using tumor-targeting light-emitting Escherichia coli. Mol. Imaging Biol. 10 (1), 54-61 (2008).
- Choy, G., et al. Comparison of noninvasive fluorescent and bioluminescent small animal optical imaging. Biotechniques. 35 (5), 1022-1033 (2003).
- Pawelek, J. M., Low, K. B., Bermudes, D. Tumor-targeted Salmonella as a novel anticancer vector. Cancer Research. 57 (20), 4537-4544 (1997).
- Fu, X., Hoffman, R. M. Human ovarian carcinoma metastatic models constructed in nude mice by orthotopic transplantation of histologically-intact patient specimens. Anticancer Res. 13 (2), 283-286 (1993).
- Ozbudak, E. M., et al. Regulation of noise in the expression of a single gene. Nat. Genet. 31 (1), 69-73 (2002).
- Elowitz, M. B., et al. Stochastic gene expression in a single cell. Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).
- Toso, J. F., et al. Phase I study of the intravenous administration of attenuated Salmonella typhimurium to patients with metastatic melanoma. J. Clin. Oncol. 20 (1), 142-152 (2002).
- Heimann, D. M., Rosenberg, S. A. Continuous intravenous administration of live genetically modified salmonella typhimurium in patients with metastatic melanoma. J. Immunother. 26 (2), 179-180 (2003).
- Forbes, N. S. Engineering the perfect (bacterial) cancer therapy. Nat. Rev. Cancer. 10 (11), 785-794 (2010).
- Guo, H., et al. Targeting tumor gene by shRNA-expressing Salmonella-mediated RNAi. Gene Ther. 18 (1), 95-105 (2011).
- Hoffman, R. M. Tumor-seeking Salmonella amino acid auxotrophs. Curr Opin Biotechnol. 22 (6), 917-923 (2011).
- Nguyen, V. H., et al. Genetically engineered Salmonella typhimurium as an imageable therapeutic probe for cancer. Cancer Research. 70 (1), 18-23 (2010).
- Zhao, M., et al. Targeted therapy with a Salmonella typhimurium leucine-arginine auxotroph cures orthotopic human breast tumors in nude mice. Cancer Research. 66 (15), 7647-7652 (2006).
- Danino, T., et al. A synchronized quorum of genetic clocks. Nature. 463 (7279), 326-330 (2010).
- Anderson, J. C., et al. Environmentally controlled invasion of cancer cells by engineered bacteria. J. Mol. Biol. 355 (4), 619-627 (2006).
- Hasty, J., McMillen, D., Collins, J. J. Engineered gene circuits. Nature. 420 (6912), 224-230 (2002).
- Prindle, A., et al. A sensing array of radically coupled genetic 'biopixels'. Nature. 481 (7379), 39-44 (2012).
- Xu, D. Q., et al. Bacterial delivery of siRNAs: a new approach to solid tumor therapy. Methods Mol. Biol. 487, 161-187 (2009).
- Zheng, L. M., et al. Tumor amplified protein expression therapy: Salmonella as a tumor-selective protein delivery vector. Oncol. Res. 12 (3), 127-1235 (2000).
- Kim, K., et al. A novel balanced-lethal host-vector system based on glmS. Plos One. 8 (3), e60511 (2013).
- Prindle, A., et al. Genetic Circuits in Salmonella typhimurium. ACS Synthetic Biology. , (2012).
- Danino, T., et al. In vivo gene expression dynamics of tumor-targeted bacteria. ACS Synthetic Biology. , (2012).
- Zhao, M., et al. Spatial-temporal imaging of bacterial infection and antibiotic response in intact animals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (17), 9814-9818 (2001).
