Summary
La meta de estos experimentos es para generar datos de tiempo-por supuesto cuantitativas a la la el crecimiento y el dinámica de la expresión de genes de atenuada
Abstract
La meta de estos experimentos es para generar datos de tiempo-por supuesto cuantitativas a la la el crecimiento y el dinámica de la expresión de genes de atenuada S. typhimurium colonias bacterianas que crecen dentro de los tumores.
Hemos generado los tumores de xenoinjerto modelo en ratones mediante inyección subcutánea de una línea celular de cáncer de ovario humana, OVCAR-8 (NCI Repositorio de Tumor DCTD, Frederick, MD).
Se transformaron cepas atenuadas de S. bacterias typhimurium (ELH430: SL1344 phoPQ-1) con una luciferasa expresada constitutivamente (luxCDABE) plásmido para la visualización 2. Estas cepas colonizan específicamente los tumores mientras que restante esencialmente no-virulenta a la del ratón 1.
Una vez que se establecieron los tumores medibles, las bacterias fueron inyectados por vía intravenosa a través de la vena de la cola con diferentes dosis. Del Tumor-localizada, la expresión de genes bacteriana se monitorizó en el tiempo real a través de el curso de 60 horas utilizando unen sistema de imágenes in vivo (de IVIS). En cada punto de tiempo, los tumores se extirparon, se homogeneizó, y se sembraron para cuantificar las colonias bacterianas para la correlación con datos de expresión génica.
Juntos, este de datos rinde un medida cuantitativa de la en crecimiento in vivo y dinámica de la expresión de genes de las bacterias que crecen dentro de los tumores.
Introduction
La biología sintética ha progresado rápidamente en la última década y ahora está posicionada para impactar los problemas importantes de la energía y la salud. Sin embargo, expansión en el arena clínica ha sido ralentizado por las preocupaciones de seguridad y una ausencia de el desarrollo de criterios de diseño para en los circuitos de genéticos in vivo. Acelerar las aplicaciones médicas de alto impacto requerirá métodos que interactúan directamente con la infraestructura médica, circuitos genéticos que funcionan fuera del entorno de laboratorio controlado, y los huéspedes microbianos seguros y clínicamente aceptado utilizar.
Un número de cepas han sido investigado para la terapia de cáncer de debido a la su capacidad para crecer preferencialmente en los tumores de. Estos han incluido C. novyi, E. coli, V. cholorae, B. longum, y la S. typhimurium 3-8. S. typhimurium ha generado particular, interés, ya que han exhibido la seguridad y la tolerancia en un número de los ensayos clínicos humanos 9-12. Estos bacteri un fueron mostrados inicialmente para crear efectos anti-tumorales a través de la estimulación de la sistema de inmune del huésped y por el agotamiento de nutrientes requeridos para el metabolismo de celular de cáncer de. De Producción de de carga terapéutica más tarde se añadió a través de modificaciones genéticos. Mientras que estos estudios representan importantes avances en el uso de las bacterias para las terapias de tumorales, la mayoría de los esfuerzos de existentes se han basado en de alta-nivel de expresión que típicamente da como resultado en la entrega de de alta dosificaciones, efectos de fuera de objetivo, y de desarrollo de la resistencia del huésped 13-16 de .
Ahora, la biología sintético puede añadir producción de de carga programable de mediante la utilización de circuitos de genéticos computacionalmente-diseñados que pueden realizar sensing y la entrega 17-20 avanzados. Estos circuitos de pueden ser diseñados para actuar como los sistemas de de entrega que detectan estímulos del tumor-específicas y de la libre-regular la de producción de carga como sea necesario. Sin embargo, el estudio de la función de estos circuitos en vivo hasta el momento ha sido difícil.
ve_content "> Dado que plásmidos son la marco común para los circuitos de sintéticos, nos describimos un método para caracterizar la dinámica de la la expresión de genes plásmido-basado en en in vivo el uso de un modelo de ratón. Estos métodos utilizan proyección de imagen luminiscencia de lapso de tiempo y la medición cuantitativa de la biodistribución. Juntos, estos enfoques proporcionan un marco para el estudio de redes de plásmido-basados en in vivo para las aplicaciones clínicas.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparación de células
- Líneas de células Passage que utilizan técnicas de cultivo celular estándar. En este experimento, se utilizaron células OVCAR-8 (NCI Repositorio tumor DCTD, Frederick, MD). Se cultivan las células a un objetivo confluencia del 80 - 100%.
- Se incuban las células con 5 ml de tripsina durante 5 min, a continuación, añadir 5 ml de medio RPMI + FBS para inactivar la tripsina.
- Harvest y el recuento de las células sobre un hemocitómetro. Volver a suspender en fenol DMEM que rojo-libre de a una concentración de destino de 5 x 10 7 células / ml, o acerca de 200 l por matraz de.
- Añadir 15% reducida el crecimiento factor de de Matrigel (BD Biosciences) y mantener a la suspensión de células en el hielo hasta la implantación.
2. La implantación del tumor
- Anestesie 4 semanas de edad las mujeres NCR / nu ratones utilizando 3% isoflurano y esperar unos 5 minutos para asegurar la anestesia profunda. Use ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia.
- Cargue las células (100 l por tumor) en una jeringa de 1 ml y adjuntar un 27 1/ 2 aguja de calibre.
- Para cada uno de dos sitios de inyección flanco trasero bilaterales, levantar la piel suavemente con fórceps para hacer una tienda de campaña e inyectar las células en la base. Tenga cuidado de no para penetrar en demasiado profundo, produciendo sangre. Use unas pinzas para quitar suavemente la jeringa sin salpicaduras.
- Monitorear el crecimiento del tumor todos los días para el 10 de - 20 días hasta que un diámetro del tumor de 2 - se alcanza 4 mm.
3. Las bacterias Preparación
- Inicie un cultivo nocturno de bacterias en 3 ml de medio LB + ampicilina de un -80 C Stock congelador o placa refrigerada. En este experimento, se utilizó S. typhimurium cepa ELH430 (SL1344 phoPQ-aroA de-).
- Por la mañana, se diluye la cultura 1:100 en LB filtrada y crecer a OD600 0,4 a ,6.
- Decantar y lavar 3 veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y resuspender en un final de DO600 de 0,1 (aproximadamente 1 x 10 7 células / ml).
4. Inyección Bacteria
- Anestesiar al animal unaposición d en su lado con la cola apuntando hacia su mano dominante. Use ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia.
- Dilatar la vena de la cola con agua caliente o una lámpara de calor.
- Cargar las bacterias (100 l por ratón) en una jeringa de 1 ml y doblar la punta un poco menos de 90 grados.
- Alinee la punta jeringa con la vena de la cola, penetrar por lo una profundidad poco profunda (debería sentir ningún resistencia), e inyectar bacteria. Observar el desplazamiento flujo de sangre para una inyección de éxito.
5. Ratón Imagenología
- Anestesiar a los animales en la cámara de inducción y luego coloque cada ratón en la plataforma de imágenes. Use ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia. Mantener posicionamiento preciso para asegurar resultados cuantitativas entre los puntos de tiempo.
- Animales de imagen utilizando el sistema de imágenes IVIS Spectrum (Caliper Life Sciences). Si la imagen de más de 1 animal, lugar barreras de luz entre ellos para evitar cross-illuminación. Los animales deben ser reflejados primero en el lado ventral para confirmar la localización de las bacterias.
- Animales de imagen dorsalmente el uso de de IVIS todos los 2 hr para la duración de el experimento (36 hora). Generar un curso de tiempo para un retorno de la inversión determinada.
6. Cuantificación de biodistribución bacteriana
- La eutanasia de los animales utilizando CO 2 y el lugar en la parte posterior de un pañal absorbente.
- Girar el animal para exponer los dos tumores subcutáneos flanco trasero. Cortar el tejido de la piel circundante para separar y eliminar los tumores. Sosteniendo el tumor con unas pinzas, retire la piel usando un movimiento de scissor invertida. Cuando la mayoría de los la piel ha sido separado, eliminar totalmente el tumor que usa las pinzas.
- Coloque los órganos en tubos de microcentrífuga pesados previamente. Dado que la masa de estos tubos de puede variar de manera significativa es importante a pre-sopesar ellos para resultados cuantitativos.
7. Cuantificación de biodistribución bacteriana
- Para cada punto del tiempo, los impuestos especiales y sopesar los tumores.
- Añadir 500 l de PBS + 15% de glicerol y homogeneizar con un tejido-Tearor (BioSpec). Enjuague el homogeneizador 3 veces con etanol entre las muestras.
- Generar diluciones en serie y la placa para el recuento de colonias bacterianas. Para placa de múltiples diluciones en una sola placa uso placas de pre-seccionados.
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Representative Results
El uso de este protocolo, que son capaces de generar datos sobre el crecimiento in vivo y la dinámica de la expresión de genes de bacterias específicas del tumor. El flujo de trabajo general se resume en la Figura 1.
En la primera etapa de, nos inyectamos bacterias (verde) y de la imagen el animal el uso de de IVIS para medir la expresión gen con luminiscencia (azul) como un reportero.
Luego, en la segunda etapa, que los impuestos especiales, homogeneizar, y tumores placa para el recuento de colonias para determinar el número de bacterias que crecen en el tumor.
Bioluminiscencia generado por cepas bacterianas es visualizados de IVIS utilizando (la Figura 2). Aumentos de de señales con dosificación de inyectada, con una dosificación colonizadora mínimo en torno 5 x 10 5 (Figura 2A). En todos los casos, las bacterias atenuadas sólo son capaces de colonizar ya sea específicamente o no a los tumores crecer en los ratones. De Señales está cuantificado usando unidades de de radiancia a normalize para el tiempo de exposición, donde los valores típicos de 10 ^ 6 o superior son indicativos de la colonización.
Para una determinada infección, aumenta la señal con el tiempo de más de 24 a 48 h (Figura 2B). El pico de aparición es de alrededor de 36 horas después de la inyección, pero el tiempo puede variar dependiendo de la cepa y el plásmido que se utiliza. Asegúrese de colocar el ratón de la misma manera cada vez, para asegurar que los resultados cuantitativos.
En la siguiente serie de experimentos, biodistrution bacteriana se cuantifica para medir el crecimiento de las bacterias con el tiempo (Figura 3). Bacterias viables en los tumores se cuantifican mediante la escisión y homogeneización de la del tumor y la galjanoplastia de a diluciones de serie (la Figura 3A). Otros órganos también pueden ser cuantificados de manera similar. Aquí, hemos utilizado el bazo, ya que la relación tumor-bazo es una medida típica de especificidad bacteriana 21, 22.
Estas cuentas permiten medir la población bacterianación lo largo del tiempo (la Figura 3B). A la izquierda, podemos ver que el número de bacterias crecer de manera constante en el tumor durante toda la duración de el experimento, con un tiempo de duplicación de 1-3 hr, sustancialmente más lento que en experimentos de cultivo de de proceso por lotes. Esta tasa de reducido es de debido a las pobres condiciones de nutrientes en el medio ambiente tumor probable. A la derecha, que hemos cuantificado el ratio de tumor-el bazo y observar de que aumenta durante todo el experimento. Este hallazgo demuestra especificidad, en que los recuentos de de bazo son esencialmente constante mientras que las bacterias continúan a crecer en el tumor.
Figura 1. Esquemática de el proceso experimental en general. (Un) Las bacterias se inyectan en el la cola-vena y colonizan específicamente los tumores. (B) En cada punto de tiempo de, los tumores Se escinden los,se homogeneizaron, y se colocaron para el recuento de colonias. Reproducido con permiso 25. Derechos de autor 2012 American Chemical Society.
Figura 2. Formación de imágenes de luminiscencia Todo-animal usando IVIS. (A) de señal aumenta con la dosis de inyección y (b) el tiempo. Adaptado con el permiso 25. Derechos de autor 2012 American Chemical Society.
Figura 3. Plating y de la colonia recuentos de para medir dinámica de crecimiento. (A) Las diluciones en serie permiten a los colonias individuales para ser contados para una muestra representativa bazo (parte inferior). (B) Al seguir estos recuentos de, podemos crear en las medidas de de población in vivo de bacterias en el interior los los tumores ( como en b </ Strong>) número de células con y sin el plásmido (como en c) y el tumor a relación de bazo (como en d). Adaptado con el permiso 25. Derechos de autor 2012 American Chemical Society.
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Discussion
El uso de este procedimiento, que son capaces de generar cursos a tiempo para el crecimiento y la dinámica de la expresión de genes de bacterias que colonizan los tumores. Si bien estas mediciones se realizan rutinariamente in vitro en cultivo discontinuo o dispositivos de microfluidos, que son mucho más difíciles de realizar in vivo.
Hay varias modificaciones que se pueden aplicar a estos métodos. Mientras que se utilizó la línea celular OVCAR-8 para generar nuestros modelos de ratón, un número de otras líneas celulares puede ser utilizada de forma equivalente. Por ejemplo, las líneas celulares luciferized se pueden usar que permiten la colocalización 3D de canales de luciferasa tumorales y bacterianas. Además, mientras que se utilizó un modelo bilateral trasera flanco, un número diferente y la ubicación de los sitios de inyección se puede utilizar para generar modelos para estudiar fenómenos diferentes. Por ejemplo, si el tamaño del tumor es una variable importante, diluciones en serie de células se pueden preparar y se inyectan a diferentes sitios al mismo tiempo, la generación de Smaller y los tumores de mayor tamaño. Por último, aunque se utilizó S. typhimurium cepa ELH430, otras cepas de S. typhimurium o otras bacterias tales como C. novyi, E. coli, V. cholorae, B. longum se puede usar equivalentemente con estos métodos, aunque los recuentos bacterianos para inyección pueden necesitar ser ajustado.
Los pasos más críticos en este protocolo implican la creación del modelo de cáncer de ratón, y la preparación y la inyección de bacterias. Para la creación del modelo de cáncer, la precisión en el recuento de células y la concentración, volumen de inyección, y la colocación sitio de la inyección mejorará en gran medida la consistencia de los tumores generados. Hemos encontrado que los tumores equivalente de tamaño, forma, y se coloca crean los datos más cuantitativamente comparables. Para la preparación de las bacterias, es crítico para lavar por completo antes de la inyección y para el control de la concentración de las bacterias, el volumen, y el sitio de inyección cuidadosamente. Estos pasos son necesarios para evitar unIdentificación del impacto inmunológica excesiva de la inyección, y para mantener la comparación cuantitativa entre los modelos separados de ratón. Dado que el número de bacterias que entran en el tumor es una pequeña fracción de la dosis inyectada, las variaciones en el número de bacterias entre los ratones inyectados pueden dar lugar a diferencias dramáticas en la progresión de colonia. Para obtener información adicional, consulte varias referencias adicionales en preparación bacteriana para cuantitativa en los estudios in vivo, 3, 4,
Mientras que estas técnicas son muy adaptables a una variedad de estudios específicos, existen algunas limitaciones para extender a ciertas aplicaciones. Por ejemplo, la administración intravenosa de los recuentos bacterianos altos puede no ser deseable para ciertas bacterias y / o modelos de ratón debido a impacto inmunológico. Una ruta alternativa de administración es la administración oral (sonda nasogástrica), una técnica que se describe en JoVe 23. Además, time-lapse puede ser muy intensiva en trabajo en función de la especificidadLongitud del experimento fic, resolución temporal, y el equipo disponible. Automatizar el proceso de formación de imágenes podría aliviar muchas de estas cargas, sino que también introduce nuevos desafíos técnicos. Signos vitales ratón como la frecuencia cardíaca, la frecuencia respiratoria y la temperatura deben ser observados por el equipo adicional. Además, para la anestesia de más largo plazo, pomadas oculares deben ser utilizados para mantener la humedad adecuada. Por último, el nivel de anestesia entregado a el ratón debe ser ajustado continuamente para mantener la profundidad adecuada de la anestesia. Un sistema de control de realimentación en bucle cerrado que integra mediciones vitales de ratón con la administración de anestesia facilitaría en gran medida este proceso.
Mientras que la biología sintética ha alcanzado mucho éxito 17, 19, 20, la aplicación de circuitos de genes de ingeniería para aplicaciones in vivo requerirá cuantitativa, cursos de tiempo in vivo para informar a los principios de diseño. S. typhimurium es una excelente variedad de biología sintética clínicagía para la terapia del cáncer, ya que es similar a la E. coli, coloniza específicamente tumores, y se ha demostrado seguro en ensayos clínicos humanos 6, 12, 14, 22. Además, estudios recientes han encontrado que muchos circuitos publicados funcionan en S. typhimurium sin modificación 24. Utilizando la plataforma experimental descrito aquí, hemos descrito recientemente el dinamismo perfiles de expresión in vivo puede ser programado utilizando la inestabilidad inherente de los vectores plasmídicos 25. Además, investigaciones recientes han desarrollado nuevos métodos para mantener de forma estable vectores de plásmido in vivo 23.
Mientras que la luciferasa es un reportero común utilizado para la formación de imágenes in vivo para su sensibilidad 5, hay ejemplos de excelentes estudios sobre cuantitativa en la expresión génica in vivo utilizando GFP 26. Usando GFP permitiría al investigador estudiar la dinámica espacio-temporales de las bacterias individuales en vivo.Además, mientras que se utilizó un modelo subcutáneo, se extiende estos estudios hacia modelos más relevantes de cáncer aumentarían aún más su poder predictivo 7. Los estudios futuros como esta pueden permitir una próxima generación de la biología sintética in vivo para aplicaciones clínicas.
El desarrollo de ambas técnicas experimentales y computacionales en concierto será fundamental para la ingeniería de los circuitos genéticos in vivo. Modelado computacional puede investigar rápidamente los parámetros del sistema para explorar salidas posibles, pero debe mantenerse íntimamente ligada a los resultados experimentales para seguir siendo relevante. Hasta el momento, estos resultados han sido difíciles de obtener cuantitativamente, debido en parte a la falta de métodos para el estudio de circuitos genéticos in vivo.
Basándose en esta plataforma, aplicaciones futuras incluirán circuitos de genes de ingeniería que se extienden aún más la gama de la dinámica de la expresión, detección de estímulos específicos de tumores y auto-regulación de productos de cargaIon, según sea necesario. A medida que la sofisticación de estos aumentos en vivo circuitos, los requisitos relativos a los datos cuantitativos necesarios para sintonizar ellos también aumentarán. Creemos que los métodos descritos aquí, junto con las nuevas innovaciones en imagen del ratón a largo plazo, hará posible este proceso.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Damos las gracias a H. Fleming para la lectura crítica y la edición del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por una beca postdoctoral Misrock (TD) y NDSEG de Becas de Postgrado (AP). SNB es un investigador del HHMI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 309602 | |
| 3/10 cc Insulin Syringe | BD Biosciences | 309301 | |
| PrecisionGlide Needle | BD Biosciences | 301629 | |
| RPMI Medium 1640 (1X), liquid, with L-glutamine | Invitrogen | 11875-119 | |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | A0166-5G | |
| LB Agar Broth | Sigma Aldrich | L2897 | |
| Luria-Bertani broth | BD Biosciences | 244610 |
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