Summary
动脉粥样硬化是一种慢性炎症过程。这个手稿说明了一个易于使用的体外模型，探讨新的颈动脉或冠状动脉斑块。在体外模型允许潜在物质上的炎症环境在人类动脉粥样硬化病变和结果可以通过各种方法进行分析调查。
Abstract
动脉粥样硬化是血管系统的慢性炎性疾病。有各种各样的方法来研究炎性化合物在动脉粥样硬化病变。鼠模型是研究动脉粥样硬化的炎症过程的重要工具，但这些模型遭受从鼠和人的免疫系统之间的表型和功能的差异。 体外细胞实验是用来具体评价引起的物质的细胞类型依赖性变化息，但培养依赖性变化，而无法分析的炎性化合物在动脉粥样硬化病变的上下文中的特定分子的影响限制结果的影响。此外，测量在人体血液中感兴趣的分子的水平，有助于进一步研究其临床相关性，但是这表示系统的，而不是局部炎症。因此，我们在这里描述的牌匾文化模型来研究人类动脉粥样硬化病变的生物学体外 。总之，新的牌匾是由发生内膜剥脱术或冠状动脉旁路移植术的患者获得并存储在RPMI培养基置于冰上，直到使用。将试样切成小块，接着随机分配到48孔板中，含有RPMI培养基中，除了感兴趣的，例如单独或组合的时间期间限定的细胞因子或趋化因子的物质。孵育后，将斑块件可休克急冻mRNA分离，包埋在石蜡中或十月进行免疫组织化学染色或砸碎并裂解为蛋白印迹。此外，细胞可以从噬菌斑进行流式细胞术分析分离。另外，上清液可以通过ELISA收集的蛋白的测量。总之，所提出的离体模型打开，以进一步研究炎性皮损生物学，这可能导致在鉴定新的疾病的机制和治疗靶点的可能性。
Introduction
动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病是导致死亡的主要原因，在工业化国家1-2 1。动脉粥样硬化，特别是急性冠脉综合征的并发症，已与脆弱性病变破裂，引起动脉粥样硬化和血管闭塞3。先天免疫和适应性免疫似乎在所有的步骤动脉粥样硬化2,4-5的参与。虽然显著的进步已经取得了在治疗心肌梗死，有效预防动脉粥样硬化和心血管不良事件仍然没有得到解决。因此，研究皮损生物学是在动脉粥样硬化的病理生理学增加我们的知识至关重要，以允许识别的新的治疗靶点和新疗法的开发。
在许多情况下，小鼠模型被用于研究特定疾病的病理生理学。但是，使用小鼠模型研究动脉粥样硬化是ACCO通过一些限制mpanied：（1）通常情况下，动脉粥样硬化的小鼠接受高胆固醇饮食。在这些模型中的胆固醇水平不能与升高的患者血清胆固醇水平的6相比较。 （2）有在小鼠和人类免疫系统之间的巨大差异;因而FOXP3是鼠的调节性T细胞的特异性标记物，而在人T细胞人类FOXP3表达不一定赋予一个监管型7。另外，如在人类中所定义的Th1/Th2的范例并不是全部转让给小鼠T细胞。 （3），用于识别小鼠单核细胞和巨噬细胞等F4/80和经典（M1）的标记一些标志物与替代（M2）的激活模式在人类骨髓细胞8不存在。 （4）的鼠和人外周血单核细胞的基因表达已被发现是基本上不同9。
因此，为了增加我们的理解在人类动脉粥样硬化的慢性炎症过程，我们需要利用模型与人体组织，血液或细胞的工作。在这里，我们描述了人类的斑块组织文化，这使得在人类炎性皮损生物学的概念，潜在的新物质研究的典范。
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Protocol
1，准备培养基如下
- 培养基：RPMI培养基。
- 添加10％胎牛血清（FCS）。
- 添加100 U / ml青霉素G和100微克/毫升链霉素。
2，储存新鲜的斑块缸，直到使用
- 患者有或无缺血症状（卒中，短暂性脑缺血发作）有显著颈内动脉狭窄的颈动脉内膜切除术操作将通过血管外科医生和冠状动脉内膜切除术过程中心脏外科冠状动脉旁路移植术来进行。颈动脉/冠状动脉斑块必须整块取下前面5所述保存斑块结构。
- 后斑块摘除发生在介质填充管中的样品，并储存在冰（噬斑需要被完全覆盖的介质）中直至使用。
3，斑块的处理
- 使用充足的细胞培养皿（ 例如 60mm）中并加入5 ml RPMI培养基。
- 将斑块组织到培养皿（牌匾应完全覆盖介质）。
- 用无菌镊子小心地握住斑块组织在组织的边缘。
- 切断斑块样品的边缘用无菌解剖刀。
- 划分斑块组织的一半。
- 宏观评估病变形态（钙化，脂肪丰富，破裂，血栓，纤维化）。
- 在体外实验中通过免疫组化分析后，确切的斑块形态。使用果酸分类10。
- 丢弃斑块伴重度钙化或纤维化。
- 切斑块组织成同源小块（3×3×3毫米）。
- 震撼冻结2斑块件，它们在液氮中储存的病变基础值，直到使用。
- 准备一个48孔板。
- 加入500μlRPMI培养基中，以每孔用于实验。
- 请用吨至少两件斑块各组。
- 添加的利益（ 例如特定的细胞因子和趋化因子）的物质。
- 使用未刺激斑块碎片作为对照。
- 随机厂的斑块碎片的数量划拨入井。
- 文化的牌匾件为指定的时间点。
- 对于斑块组织刺激实验与脂多糖（LPS）
- 使用下面的时间点：3小时，8小时和24小时。
- 使用2个牌匾为LPS和两个用于未刺激组，每个时间点分别。
- 加入脂多糖1微克/毫升。
- 在温育后，保持在48孔板中于37℃在含5％CO 2的加湿空气。
4，表示经过时间的收获斑块组织块
- 震撼冻结斑块碎片的mRNA分离和cDNA合成（有关详细信息，请参阅原山坳第5节）。
- 收集上清液并在-20℃下用于ELISA分析存储它。
- 对于西方墨点法，粉碎和溶解斑块组织。通过0.65微米和0.1微米的离心过滤设备过滤裂解液。
- 嵌入斑块组织在组织TEC或石蜡进行免疫组化染色。
5，从培养斑块碎片RNA提取
- 使用TissueLyser的同质化。
- 通过使用该试剂盒（见材料表），根据制造商的说明书分离出的RNA。
- 确定与分光光度计样品的RNA的数量和质量。
- 根据制造商的说明使用勃林格cDNA的试剂盒进行逆转录。
- 对于定量PCR，使用例如罗氏实时PCR试剂盒用的SYBR Green。
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Representative Results
在这里，我们提出了一些数字，展示的体外培养斑块的结果。评估响应于在体外模型实验中感兴趣的代理的变化在炎症环境中，我们测量它被称为是主要参与动脉粥样硬化的不同分子。作为代表性的促动脉粥样硬化的细胞因子，我们选择的TNFa，IL-6和IFNg的2,11。此外，我们使用von Willebrand因子和组织因子来评估前血栓形成的变化。此外，为了解决斑块的不稳定性诱导的感兴趣剂，基质金属蛋白酶9（MMP9）的水平将被分析的发展。 Chemoattractance也是在斑块进展和回归11的一个重要步骤，因此，我们研究的CCL2的水平，也称为单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1），趋化原则对于单核细胞/巨噬细胞。后细胞吸引细胞滚动和粘附的以下步骤。正因为如此，我们选择ICAM-1。通过进一步分析由关注物质的影响的信号传导途径，我们使用细胞外信号调节激酶（ERK1 / 2），广泛表达，并通过许多不同的刺激，如细胞因子，凋亡，分化，病毒感染和配体的异源三聚G蛋白的激活偶联受体12。
首先，我们表明未刺激的培养的动脉粥样硬化病变的炎性化合物的时间依赖性变化，通过定量实时聚合酶链反应（定量RT-PCR）（ 图1）进行分析。在菌斑培养，增加了炎症病灶周围环境的活性可以观察到。无差异3小时与没文化（数据未显示）后发现。后菌斑培养8小时后，我们发现了一些分子如IL6只有轻微的上调，但TNF和IFN克没有，而在24小时后，有一个上调各种分子如TNF一，IL-6和IFN克 。值得注意的是，更长的菌斑培养时间的较高分子的表达的变化是。
二，显示影响炎症环境中动脉粥样硬化病变的可行性，我们提出的斑块碎片孵育1μg/ ml的LPS 3小时，通过定量RT-PCR检测（ 图2）的结果。未刺激斑块碎片作为阴性对照。我们发现，LPS诱导激活内动脉粥样硬化病变的炎症化合物的品位显着增加。各种细胞因子（IL-6，肿瘤坏死因子等， 图2A-B），趋化因子（CCL2等，未示出），粘附（ICAM1，未示出），斑块不稳定（基质金属蛋白酶9（MMP9），未示出）和亲血栓性分子（ 血管性血友病因子， 如图2C所示 ， 第三，以评价蛋白质丰度，培养的病变上清液用ELISA分析和Western印迹（ 图3D）捣烂斑块组织。在图3A-C中，我们显示的IFN-α克ELISA分析，MCP-1和TNF-α在培养用LPS或控制8小时培养的样品的上清液。此外，免疫印迹分析（磷酸化）的ERK砸了，lysated斑块组织的1/2，无论是与LPS或控制的刺激，是体现在图3D。 
图1：在一段时间内的炎性皮损斑块复合培养的影响。动脉粥样硬化斑块碎片，立即震惊冷冻或培养8或24小时显示细胞因子IL-6（A），干扰素克（B）和肿瘤坏死因子 （C）和表达，实时定量RT-PCR检测。显示的结果代表了5个独立实验的平均值。被用于指示的时间点五粥样硬化病变片为每个组。值进行归一化，以β-肌动蛋白，并表示为的cDNA拷贝/千β-肌动蛋白的拷贝。结果显示为箱线图显示平均值和25 日和75 百分位作为箱和10 日和90百分位为晶须。 *：P <0.01。 
诱导增加各种炎症分子的培养匾幅图2 LPS刺激。斑块碎片孵育1μg/ ml的LPS或者未刺激3小时，并通过定量RT-PCR检测。显示的结果代表了5个独立实验的平均值。两片的每个组被使用。值进行归一化，以β-肌动蛋白，并表示为的cDNA拷贝/千β-肌动蛋白的拷贝。结果显示为箱线图显示平均值和25 日和75 百分位作为箱和10 日和90百分位为晶须。 *：P <0.01。 
在培养的斑块的上清液图3蛋白表达。细胞因子的代表性的ELISA测定IFN-α克（A），肿瘤坏死因子-α（B）和MCP-1（C）中的LPS或未受刺激治疗8噬斑片上清小时都显示。显示的结果代表了五个独立experimen平均TS。结果显示为箱线图显示平均值和25 日和75 百分位作为箱和10 日和90百分位为晶须。此外，代表性的Western印迹对（磷酸化）的ERK LPS的1/2刺激或控制培养的粥样硬化病变后3小时被表现在图3D。列条形图显示平均值+ SEM作为晶须代表的五个独立实验的平均值。 *：P <0.01。
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Discussion
在这里，我们提出了一个体外菌斑培养模型，探讨潜在的有关物质对动脉粥样硬化病变的生物学影响。这种离体方法的主要优点是，以评估表明物质对炎症细胞和其细胞相互作用以及炎症通路和人类动脉粥样硬化病灶内级联的影响的能力。几个实用方法（ 如 RT-PCR，免疫印迹，免疫组化，流式细胞仪，ELISA法），有助于提供对动脉粥样硬化病变的炎症感兴趣的物质的影响进行全面的分析。
在小鼠动脉粥样硬化的炎症过程都很好理解，也感谢小鼠模型过度表达或缺乏兴趣11的某些基因。不过，研究结果并不总是紧贴人体6-9,13。动脉粥样硬化的小鼠通常会收到一个病理性高哲ESTEROL饮食6。此外，它是已知的人类和小鼠之间的免疫系统出现实质性差异7-9。在这里，我们提出了一个体外菌斑培养模型，它允许学习兴趣的一种物质上的抗炎化合物在人类动脉粥样硬化病变的影响，如由Niessner 等 14。此外，各种其他的方法可以用来分析一个噬菌斑培养实验，比得上鼠的研究结果。因此，该体外模型打开替换小鼠的体内研究在某些情况下的可能性，并可能代表了推定的动脉粥样硬化促进分子在小鼠系统中，换算为人类生物学之间具有优异桥接的方法。
人类的体外模型为动脉粥样硬化是不与体外细胞实验比较。细胞系可以很容易地存储和培养，但表型和福nctionally不完全相同的原代细胞。新鲜细胞可以通过定期抽血来获得，但它是偶尔很难对其进行培养和培养经受许多因素。此外，通过使用体外细胞培养实验中，这是不可能的，调查特定分子在炎性化合物在动脉粥样硬化病变的影响。因此， 在体外实验对人类生物学的初步调查（平移）的重要一步，但未能进一步分析在人类动脉粥样硬化，动脉粥样硬化病变中炎症级联反应和途径特别是细胞的相互作用和影响力的概念的兴趣分子的作用。
摩纳哥等人建立的细胞自人动脉粥样硬化组织15中分离的一个重要的短期培养系统。他们已经使用的胶原酶，弹性蛋白酶和DNA酶的酶混合物。这种方法允许乐死调查ONAL细胞 - 细胞实验中，信号通路分析，并与腺病毒载体基因转移的研究。但它仍是未知如何酶混合物影响细胞，活化的，即梯度，表面标志物表达等，此外，它可以被质疑这些实验的结果反映内粥样硬化病变的实际流程。此外，细胞的原始位置将通过酶的混合物被破坏和短期培养系统具有相同的局限性， 在体外细胞实验。
对于动脉粥样硬化病灶内特定的细胞或细胞群体的研究中，也可以使用激光捕获显微解剖的方法。所感兴趣的细胞或细胞化合物将通过使用红外线或紫外线激光和RNA，DNA或蛋白质的分析可以被执行来切出的组织。激光捕获显微解剖似乎并没有破坏细胞，细胞表面受体EXPRE裂变等的方法的优点是动脉粥样硬化病灶内的细胞或感兴趣的位置的分析。但它不可能进一步评估细胞如体外研究。
在体外模型牵连广泛的可能的方法来测量和分析的结果。实时聚合酶链式反应可RNA分离和cDNA合成后进行调查基因的表达水平如图所示由Niessner 等 14。免疫组织化学是既定的工具来评估蛋白质的水平，以证明内粥样硬化病变的蛋白质表达和细胞来源。 Western印迹法可用于分析信号途径。此外，细胞分离消化的酶液打开的机会进行流式细胞仪分析，以进一步分析，例如细胞类型，细胞亚型和品位激活。此外，后细胞分离谱型是一个很好的方法来进一步分析T细胞受体变异。此外，经过消化磁性细胞分离为特定的细胞亚型作进一步的体外研究或微阵列分析的细胞分离的经过验证的高品质的方法。最后，上清液可以通过ELISA收集的蛋白的测量。总之， 体外模型是一个有价值的工具，调查在炎症环境在人类动脉粥样硬化病变的确切变化。
在体外模型是基于动脉内膜切除术样本。使用来自不同个体获得的粥样硬化斑块，可能会导致更大程度的差蜂窝组合物和感兴趣的基因/蛋白的水平因而更高的变化。因此，使用脂质丰富的或复杂的斑块样品，而不是fibrosclerotic病变10是很重要的，因为炎症反应是显着地降低在fibrosclerotic lesio纳秒。因此，这是极大的兴趣分析的斑块培养实验结果之前，评估斑块形态。
另外，每个样本的样本包括动脉粥样硬化病变的发展/级数，从最初的内皮功能障碍和脂质蓄积步骤，对脂肪条纹和坏死核心，以破裂斑块的发展的不同阶段。因此，为了最大限度地减少斑块组织的异质性，有必要切断的边缘，它一般表示早期步骤动脉粥样硬化。
它不能被排除，切削引起的组织损伤的反应。但是，我们的斑块组织培养实验表明，培养斑块组织，以非培养的斑块组织可比基因表达水平。因此，这种强调指出，当前的方法是一个很好的工具来调查炎症环境中动脉粥样硬化病变。
文化斑块件被限制为最多到一天的时间段。如果斑块组织被培养了一天多，结果急剧增加的变化。此外，经过3天的斑块组成和形态崩溃。
有需要牢记应用此模型时的局限性。在体外模型是研究炎症环境中动脉粥样硬化病变的好方法。然而，主要成分中缺少这样的背景下。无血流动力学特点是适用的和全身的影响是完全缺失的。另外，用这种方法，它是唯一可能的调查的短期变化，但缺乏由于斑块形态的崩溃的长期分析。
总之，我们在这里介绍的方法，将成为研究人员谁是有兴趣在人的动脉粥样硬化病变的炎症潜在的新分子的调查有用的。在体外斑块çulture模式确实从小鼠和人类免疫系统之间的差异受到影响，但它给我们分析在动脉粥样硬化病变的情况下细胞相互作用，并表示有机会，调查当地的皮损炎症级联反应和途径的能力。这里所描述的体外菌斑培养方法是易于使用，并且是可重复的，并可能有助于识别和验证新的疾病的机制和治疗靶点。
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Disclosures
作者并没有任何冲突披露。
Acknowledgments
我们感谢纳丁Wambsganss优秀的技术援助。这项工作是由德国研究基金会（DFG）ER 682/2-1和科研津贴从心脏病的德国社会为C ERBEL以及研究津贴由德国学术服务海德堡到L赵支撑。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI medium | Gibco | 21875-091 | |
| FCS | Gibco | 10270-106 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P-4458 | |
| 15 ml Tube | Sarstedt | 62,554,502 | |
| Culture dish (60 mm) | Orange Scientific | 5550200 | |
| LPS | Sigma | L4516 | |
| Cell culture plates 48-well | Greiner | 677102 | |
| Scalpel - single use | Feather | FEA200130011 | |
| TissueLyser | Precellys 24 Dual | Cat. No. EQ03119.200.RD010.0 | |
| RNeasy (Mini) Kit | Qiagen | Cat. No. 74104 | |
| Boehringer cDNA kit | Roche Diagnostics | Cat. No. 11483188001 | |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific |
References
- Lusis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407, 233-241 (2000).
- Hansson, G. K., Libby, P. The immune response in atherosclerosis: a double-edged sword. Nat Rev Immunol. 6, 508-519 (2006).
- Virmani, R., Kolodgie, F. D., Burke, A. P., Farb, A., Schwartz, S. M. Lessons from sudden coronary death: a comprehensive morphological classification scheme for atherosclerotic lesions. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20, 1262-1275 (2000).
- Erbel, C., et al. Expression of IL-17A in human atherosclerotic lesions is associated with increased inflammation and plaque vulnerability. Basic Res Cardiol. 106, 125-134 (2011).
- Erbel, C., et al. Functional profile of activated dendritic cells in unstable atherosclerotic plaque. Basic Res Cardiol. 102, 123-132 (2007).
- Bentzon, J. F., Falk, E. Atherosclerotic lesions in mouse and man: is it the same disease. Curr Opin Lipidol. 21, 434-440 (2010).
- Tran, D. Q., Ramsey, H., Shevach, E. M. Induction of FOXP3 expression in naive human CD4+FOXP3 T cells by T-cell receptor stimulation is transforming growth factor-beta dependent but does not confer a regulatory phenotype. Blood. 110, 2983-2990 (2007).
- Raes, G., et al. Arginase-1 and Ym1 are markers for murine, but not human, alternatively activated myeloid cells. J Immunol. 174, 6561-6562 (2005).
- Ingersoll, M. A., et al. Comparison of gene expression profiles between human and mouse monocyte subsets. Blood. 115, 10-19 (2010).
- Stary, H. C. Natural history and histological classification of atherosclerotic lesions: an update. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20, 1177-1178 (2000).
- Galkina, E., Ley, K. Immune and inflammatory mechanisms of atherosclerosis. Annu Rev Immunol. 27, 165-197 (2009).
- Suganuma, T., Workman, J. L. MAP kinases and histone modification. J Mol Cell Biol. 4, 348-350 (2012).
- Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis. Nature. 473, 317-325 (2011).
- Niessner, A., et al. Synergistic proinflammatory effects of the antiviral cytokine interferon-alpha and Toll-like receptor 4 ligands in the atherosclerotic plaque. Circulation. 116, 2043-2052 (2007).
- Monaco, C., et al. Canonical pathway of nuclear factor kappa B activation selectively regulates proinflammatory and prothrombotic responses in human atherosclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 5634-5639 (2004).
