Summary
L'athérosclérose est un processus inflammatoire chronique. Ce manuscrit illustre un outil facile à utiliser modèle ex vivo pour étudier carotide frais ou des plaques coronariennes. Le modèle in vivo ex permet à l'enquête de substances potentiels sur le milieu inflammatoire dans les lésions athérosclérotiques humaines et les résultats peuvent être analysés par diverses méthodes.
Abstract
L'athérosclérose est une maladie inflammatoire chronique du système vasculaire. Il existe différentes méthodes pour étudier le composé inflammatoire dans les lésions d'athérosclérose. Modèles de souris sont un outil important pour étudier les processus inflammatoires dans l'athérogenèse, mais ces modèles souffrent des différences phénotypiques et fonctionnelles entre la souris et le système immunitaire humain. Expériences in vitro de cellules sont utilisées pour évaluer spécifiquement les changements de type dépendant cellulaires causés par une substance de intérêt, mais des variations dépendant de la culture et de l'impossibilité d'analyser l'influence de molécules spécifiques dans le contexte du composé inflammatoire dans les lésions athérosclérotiques de limiter l'impact des résultats. En outre, la mesure des taux d'une molécule d'intérêt dans le sang humain permet d'approfondir sa pertinence clinique, mais il s'agit d'une inflammation systémique et non local. Par conséquent, nous décrivons ici un modèle de culture de la plaque d'athérome à étudier lésion biologie humaineex vivo. En bref, des plaques fraîches sont obtenus à partir de patients subissant une endartériectomie ou pontage coronarien greffage et stockés dans du milieu RPMI sur de la glace jusqu'à utilisation. Les échantillons sont découpés en petits morceaux puis par distribution aléatoire dans une plaque à 48 puits, contenant du milieu RPMI en plus d'une substance d'intérêt tels que des cytokines ou des chimiokines, seuls ou en combinaison pour des périodes de temps définies. Après incubation, les morceaux de plaque peuvent être congelés pour un choc isolement d'ARNm, inclus dans la paraffine ou des PTOM pour les colorations d'immunohistochimie ou brisées et lysées pour western blot. En outre, les cellules peuvent être isolées à partir de la plaque pour l'analyse de cytométrie en flux. En outre, les surnageants peuvent être collectées pour la mesure de la protéine par la technique ELISA. En conclusion, le modèle in vivo présentée ex ouvre la possibilité d'étudier plus avant la biologie lésionnelle inflammatoire, qui peut conduire à l'identification de mécanismes roman de la maladie et des cibles thérapeutiques.
Introduction
L'athérosclérose est une maladie inflammatoire chronique est l'une des principales causes de décès dans les pays industrialisés 1-2. Les complications de l'athérosclérose, le syndrome coronarien aigu en particulier, ont été liés à la rupture de lésions vulnérables, ce qui provoque l'athérothrombose et l'occlusion du vaisseau 3. L'immunité innée et adaptative semblent être impliqués à toutes les étapes de l'athérogenèse 2,4-5. Bien que des progrès importants ont été réalisés dans le traitement de l'infarctus du myocarde, une prévention efficace de l'athérosclérose et les événements cardiovasculaires indésirables sont encore en suspens. Ainsi, l'étude de la biologie lésionnel est essentielle pour accroître nos connaissances sur la physiopathologie de l'athérosclérose et à permettre l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques et le développement de nouvelles thérapies.
Dans de nombreux cas, des modèles murins sont utilisées pour étudier la physiopathologie des maladies spécifiques. Cependant, l'étude athérogenèse en utilisant des modèles de souris est accompanied par plusieurs limites: (1) Habituellement, les souris athérosclérotiques reçoivent une alimentation riche en cholestérol. Les niveaux de cholestérol dans ces modèles ne peuvent pas être comparés à ceux des patients ayant des taux sériques de cholestérol élevé 6. (2) Il existe des différences substantielles entre la souris et le système immunitaire humain; ainsi Foxp3 est un marqueur spécifique des cellules T régulatrices murins, alors que l'expression de Foxp3 humain dans des cellules T humaines ne confère pas nécessairement un phénotype de régulation 7. En outre, le paradigme Th1/Th2 tel que défini dans l'homme n'est pas entièrement transférable à cellules T murines. (3) Un certain nombre de marqueurs qui sont utilisés pour identifier les monocytes et les macrophages murins tels que F4/80 et les marqueurs de classique (M1) vs alternatif (M2) modèles d'activation n'existe pas dans les cellules myéloïdes humaines 8. (4) L'expression des gènes de monocytes de sang périphérique humains et murins a été trouvée pour être sensiblement différente 9.
Ainsi, afin d'accroître notre compréhension desprocessus inflammatoires chroniques de l'athérosclérose humaine, nous avons besoin de faire usage de modèles de travail avec les tissus humains, de sang ou de cellules. Ici, nous décrivons un modèle de culture de tissus de la plaque humaine, qui permet d'étudier de nouvelles substances potentiels dans le concept de biologie lésionnelle inflammatoire humaine.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Préparer moyen comme suit
- Milieu de culture: milieu RPMI.
- Ajouter 10% de sérum de veau foetal (SVF).
- Ajouter 100 U / ml de pénicilline G, et 100 g / ml de streptomycine.
2. Stockage du cylindre de plaque frais jusqu'à utilisation
- L'opération de la carotide endartériectomie des patients avec ou sans symptômes ischémiques (AVC, accident ischémique transitoire) avec une sténose de l'artère carotide importante sera faite par les chirurgiens vasculaires et l'endartériectomie de l'artère coronaire au cours de pontage aortocoronarien par les chirurgiens cardiaques. Carotides / plaques coronaires doivent être retirés en bloc de préserver la structure de la plaque comme décrit précédemment 5.
- Après plaque lieu de la disparition de l'échantillon dans un tube de milieu rempli et le stocker sur la glace (plaque doit être entièrement recouverte de milieu) jusqu'à utilisation.
3. Traitement de la plaque
- Utiliser une boîte de culture cellulaire appropriée (par exemple 60 mm)et ajoutez 5 ml de milieu RPMI.
- Placer le tissu de la plaque dans la boîte de culture (plaque doit être complètement recouverte par du milieu).
- Maintenir le tissu de la plaque d'attention au niveau des bords du tissu à l'aide de pinces stériles.
- Couper les bords de l'échantillon de plaque en utilisant un scalpel stérile.
- Diviser le tissu de la plaque en deux.
- Évaluer la morphologie de la lésion macroscopique (calcifiée, riche en lipides, rompu, thrombus, fibrose).
- Analyser la morphologie de la plaque exact après l'expérience ex vivo par immunohistochimie. Utilisez la classification AHA 10.
- Jeter plaques avec calcification grave ou de fibrose.
- Couper le tissu de la plaque en petits morceaux homologues (3 x 3 x 3 mm).
- Choc geler deux morceaux de plaque et de les stocker dans de l'azote liquide pour les valeurs de base de la lésion jusqu'à utilisation.
- Préparer une plaque de 48 puits.
- Ajouter 500 pi de milieu RPMI à chaque puits utilisé pour l'expérience.
- S'il vous plaît utiliser unt moins deux morceaux de plaque pour chaque groupe.
- Ajouter la substance d'intérêt (par exemple, les cytokines et les chimiokines spécifiques).
- Utiliser des éléments de plaque en tant que témoins non stimulées.
- Hasard planter le nombre approprié de pièces de plaque dans les puits.
- Culture des morceaux de plaque pour des points temporels indiqués.
- Pour l'expérience de stimulation tissulaire de la plaque avec le lipopolysaccharide (LPS)
- Utilisez les points de temps suivants: 3 h, 8 h et 24 h.
- Utiliser deux morceaux de plaque pour les LPS et deux pour le groupe non stimulé pour chaque point de temps, respectivement.
- Ajouter 1 pg / ml de lipopolysaccharide.
- Au cours de l'incubation, de maintenir la plaque à 48 puits à 37 ° C dans de l'air humidifié contenant 5% de CO 2.
4. Morceaux de tissu de la plaque de récolte de temps après indiquées
- Choc geler les morceaux de la plaque d'isolement de l'ARNm et la synthèse de l'ADNc (pour des informations détaillées voir proto-section de col 5).
- Recueillir le surnageant et stocké à -20 ° C pour analyse ELISA.
- Pour un transfert de Western, smash et lyser les tissus de la plaque. Filtrer le lysat par une um 0,65 et 0,1 um dispositif de filtre centrifuge.
- Incluez le tissu de la plaque dans les tissus-tec ou de la paraffine pour les colorations d'immunohistochimie.
5. L'extraction d'ARN à partir de morceaux de plaque de culture
- Utilisez une TissueLyser pour l'homogénéisation.
- Isoler l'ARN en utilisant le kit (voir le tableau des matériaux) selon les instructions du fabricant.
- Déterminer la quantité et la qualité de l'ARN des échantillons avec un spectrophotomètre.
- Utilisez le kit Boehringer ADNc pour la transcription inverse selon les instructions du fabricant.
- Pour la PCR quantitative, utiliser par exemple le kit de PCR en temps réel Roche avec SYBR Green.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ici, nous présentons un certain nombre de chiffres qui démontrent les résultats de l'ex vivo plaque culture. Pour évaluer les changements dans le milieu inflammatoire en réponse à l'agent de l'intérêt pour l'ex vivo expérience de modèle, nous mesurons différentes molécules qui sont connus pour être principalement impliqués dans l'athérogenèse. Comme cytokines pro-athérogènes représentatives nous choisissons TNFa, IL6 et IFNg 2,11. En outre, on utilise le facteur von Willebrand et du facteur tissulaire pour évaluer les changements pro-thrombotiques. En outre, pour faire face au développement de l'instabilité plaque induite par un agent d'intérêt, matrice métallopeptidase 9 (MMP9) niveaux seront analysés. Chemoattractance est également une étape importante dans la progression de la plaque et de la régression 11, donc, nous étudions les niveaux de CCL2, aussi appelées protéine chimiotactique des monocytes-1 (MCP-1), chemoattractant principe pour les monocytes / macrophages. Après attraction des cellules de roulement et l'adhésion cellulaire sont les étapes suivantes.Parce que nous choisissons de ICAM-1. En analysant davantage les voies de signalisation influencés par la substance d'intérêt, nous utilisons-extracellular signal-regulated kinases (ERK1 / 2), largement exprimée et activée par de nombreux stimuli différents tels que les cytokines, l'apoptose, la différenciation, l'infection par le virus et les ligands de la protéine G hétérotrimérique récepteurs couplés 12.
Tout d'abord, nous montrons changements dépendant du temps du composé inflammatoire des lésions athérosclérotiques culture non stimulées, analysés par réaction quantitative en temps réel en chaîne par polymérase (qRT-PCR) (figure 1). Pendant la culture plaque, une augmentation de l'activité du milieu lésionnel inflammatoire peut être observée. Aucune différence n'a été observée après 3 h par rapport à aucune culture (données non présentées). Après 8 heures de culture de la plaque, nous avons constaté une légère régulation à la hausse de certaines molécules telles que IL6, mais pas de TNF a et IFN g, alors après 24 h, il y avait une régulation à la haussede diverses molécules telles que le TNF a, IL6 et d'IFN g. Notamment, plus la durée de la culture de la plaque supérieure de la variation de l'expression des molécules sont.
En second lieu, afin de démontrer la faisabilité d'influencer le milieu inflammatoire dans les lésions athéroscléreuses, nous présentons les résultats de morceaux de plaques incubées avec 1 pg / ml de LPS pendant 3 heures, mesurée par qRT-PCR (figure 2). Morceaux de plaque non stimulées ont servi de contrôle négatif . Nous avons constaté que le LPS a induit une augmentation marquée de la teneur de l'activation du composé à l'intérieur de lésions d'athérosclérose inflammatoire. Diverses cytokines (IL6, TNF, etc une, la figure 2A-B), des chimiokines CCL2 (etc, non représentés), l'adhérence (ICAM1, et non représenté), la plaque de déstabilisation (matrice métallopeptidase 9 (MMP9), non représenté) et pro- molécules thrombotiques (facteur de von Willebrand, la figure 2C, Troisièmement, pour évaluer abondance des protéines, les surnageants de culture des lésions ont été analysés par ELISA et brisé les tissus de la plaque par Western blot (figure 3D). Sur la figure 3A-C, on montre l'analyse ELISA de l'IFN-g, MCP-1 et de TNF-a dans le surnageant de culture des échantillons incubés avec le LPS ou le contrôle pendant 8 heures. En outre, l'analyse western blot pour (phosphorylée) ERK 1/2 des tissus de la plaque brisées et lysées, soit stimulée par le LPS ou le contrôle, est démontré à la figure 3D. 
Figure 1. Effet de la culture plaque sur le composé lésionnelle inflammatoire au fil du temps. Morceaux de la plaque d'athérosclérose ont été choquent immédiatement congelées ou en culture pendant 8ou de 24 heures et l'expression des cytokines IL6 (A), IFN g (B) et du TNF a (C) indiqués ont été analysées par qRT-PCR. Les résultats indiqués représentent la moyenne de cinq expériences indépendantes. Cinq pièces de lésions athérosclérotiques de chaque groupe ont été utilisés pour le point de temps indiqué. Les valeurs sont normalisées à la b-actine et exprimées en copies ADNc / 1000 exemplaires b-actine. Les résultats sont présentés comme des boîtes à moustaches affichant moyenne et 25 e et 75 e percentiles que les boîtes et les 10 e et 90 e percentiles comme favoris. *: P <0,01. 
Figure 2. Stimulation par le LPS de morceaux de plaque de culture induit une augmentation de diverses molécules inflammatoires. Plaque morceaux ont été incubées avec 1 pg / ml de LPSou non stimulées pendant 3 heures et analysé par qRT-PCR. Les résultats indiqués représentent la moyenne de cinq expériences indépendantes. Deux morceaux de chaque groupe ont été utilisés. Les valeurs sont normalisées à la b-actine et exprimées en copies ADNc / 1000 exemplaires b-actine. Les résultats sont présentés comme des boîtes à moustaches affichant moyenne et 25 e et 75 e percentiles que les boîtes et les 10 e et 90 e percentiles comme favoris. *: P <0,01. 
Figure 3. L'expression des protéines dans le surnageant de la plaque de culture. Mesure représentative ELISA de cytokines IFN-g (A), le TNF-a (B) et de MCP-1 (C) dans le surnageant des morceaux de plaques traitées avec du LPS ou non stimulés pendant 8 h sont présentés. Les résultats présentés correspondent à la moyenne des cinq expérimentation indépendantsts. Les résultats sont présentés comme des boîtes à moustaches affichant moyenne et 25 e et 75 e percentiles que les boîtes et les 10 e et 90 e percentiles comme favoris. En outre, le représentant de Western Blot pour (phosphorylée) ERK 1/2 de LPS stimulé ou contrôler les lésions athéroscléreuses de culture après 3 heures est démontré dans la figure 3D. Les graphiques à barres montrant la colonne moyenne + SEM comme whiskers représentent la moyenne de cinq expériences indépendantes. *: P <0,01.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nous présentons ici un modèle ex vivo de la culture de la plaque d'étudier l'influence de substances potentiellement pertinentes sur l'athérosclérose lésion biologie. Le principal avantage de cette méthode ex vivo est la capacité d'évaluer l'influence de substances indiquées sur les cellules inflammatoires et leur interaction cellulaire ainsi que les voies inflammatoires et des cascades dans les lésions athérosclérotiques humaines. Plusieurs méthodes utilisables (par exemple RT-PCR, western blot, immunohistochimie, cytométrie en flux, ELISA) aide à fournir une analyse complète de l'impact de la substance d'intérêt sur l'inflammation des lésions athéroscléreuses.
Les processus inflammatoires dans l'athérosclérose murin sont bien comprises, aussi grâce à des modèles de souris sur-exprimant ou manque certains gènes d'intérêt 11. Cependant, les résultats ne correspondent pas toujours étroitement à l'homme 6-9,13. Souris athérosclérotiques reçoivent habituellement une grande chol pathologiqueEsterol alimentation 6. En outre, il est connu que le système immunitaire entre les humains et les souris présentent des différences substantielles 9.7. Ici, nous présentons un modèle ex vivo de la culture de la plaque, ce qui permet d'étudier l'influence d'une substance d'intérêt sur le composé inflammatoire dans les lésions athérosclérotiques humaines comme le montre Niessner et al. 14. De plus, diverses méthodes complémentaires peuvent être utilisées pour analyser les résultats d'une expérience de culture de la plaque, comparable à des études murines. Par conséquent, le modèle ex vivo ouvre la possibilité de remplacer murin in vivo dans certains cas, et peut représenter un excellent procédé de pontage entre une molécule favorisant l'athérosclérose putatif dans le système murin et de la traduction de la biologie humaine.
L'ex vivo modèle humain pour l'athérosclérose n'est pas comparable avec expériences in vitro dans des cellules. Les lignées cellulaires peuvent être facilement stockés et mis en culture, mais sont phénotypiquement et functionally pas identiques aux cellules primaires. Cellules fraîches peuvent être obtenus par le sang régulier attire, mais il est parfois très difficile de les cultiver et de la culture est soumise à de nombreux facteurs. En outre, en utilisant des expériences in vitro de culture de cellules, il n'est pas possible d'étudier l'influence de molécules spécifiques du composé inflammatoire dans les lésions athérosclérotiques. Ainsi, des expériences in vitro sont importants pour (translation) première étape pour les enquêtes sur la biologie humaine, mais ne parviennent pas à analyser plus en détail le rôle de la molécule d'intérêt dans le concept de l'athérosclérose humaine, en particulier l'interaction cellulaire et influence sur les cascades inflammatoires et de la voie dans les lésions athéroscléreuses .
Monaco et al. Établi une importante régime des cellules isolées à partir de tissus d'athérosclérose humaine 15 culture à court terme. Ils ont utilisé un mélange enzymatique de la collagénase, l'élastase et DNase. Cette méthode permet l'étude de lesiexpériences cellule-cellule d'Onal, signalisation analyse des voies et des études de transfert de gènes avec des vecteurs adénoviraux. Mais on ne sait pas comment le mélange enzymatique influe sur les cellules, c'est à dire diplômé de l'activation, l'expression des marqueurs de surface, etc En outre, on peut se demander si les résultats de ces expériences reflètent les processus réels à l'intérieur de lésions d'athérosclérose. En outre, l'emplacement d'origine des cellules sera détruit par le mélange enzymatique et le système de culture à court terme a les mêmes limites que les expériences in vitro dans des cellules.
Pour les études de cellule ou une population de cellules spécifiques à l'intérieur d'une lésion athérosclérotique, il est possible d'utiliser la méthode de micro-dissection par capture laser. Le composé d'intérêt cellule ou cellule sera découpé dans le tissu en utilisant un rayonnement infrarouge ou UV-laser et de l'ARN, l'ADN ou l'analyse des protéines peut être réalisée. La capture laser micro dissection ne semble pas endommager les cellules, l'expre des récepteurs de surface cellulairession etc L'avantage de cette méthode est l'analyse d'une cellule ou d'un emplacement d'intérêt à l'intérieur d'une lésion athérosclérotique. Mais il n'est pas possible d'évaluer en outre les cellules telles que des études in vitro.
Le modèle in vivo ex implique un large éventail de méthodes possibles pour mesurer et analyser les résultats. Temps réel la réaction en chaîne de la polymérase peut être effectuée après la synthèse de l'isolement d'ARN et d'ADNc pour étudier le niveau d'expression du gène comme indiqué par Niessner et al. 14. L'immunohistochimie est un outil mis en place afin d'évaluer le niveau de protéine dans le but de démontrer l'expression de la protéine et de l'origine cellulaire à l'intérieur de lésions athérosclérotiques. Western blot peut être utilisée pour analyser les voies de signalisation. En outre, l'isolement de la cellule par une digestion dans une solution d'enzyme ouvre la possibilité de réaliser une analyse de cytométrie en flux pour analyser en outre pour le type de cellule exemple, les sous-types cellulaires et le grade de l'activation. En outre, après l'isolement des cellulesspectratyping représentent une bonne méthode pour analyser plus en détail la variabilité T cell receptor. En outre, après l'isolement digestion cellulaire magnétique est une méthode de haute qualité de la séparation des cellules de sous-types cellulaires spécifiques pour des études in vitro ou l'analyse des microréseaux prouvé. Enfin, les surnageants peuvent être collectées pour la mesure de la protéine par ELISA. En conclusion, le modèle in vivo ex est un outil précieux pour étudier les changements exacts dans le milieu inflammatoire dans les lésions athérosclérotiques humaines.
Le modèle ex vivo est basée sur des échantillons d'endartériectomie. Utilisation de plaques d'athérosclérose obtenus à partir d'individus différents peuvent conduire à un degré plus élevé de la composition cellulaire différentielle et donc une variation ultérieure des niveaux de gènes / protéines d'intérêt. Ainsi, il est important d'utiliser des échantillons de plaque riches ou complexes lipides plutôt que de lésions fibroscléreux 10, parce que la réponse inflammatoire est nettement plus faible dans Lesio fibroscléreuxns. Par conséquent, il est d'un grand intérêt pour évaluer la morphologie de la plaque avant d'analyser les résultats des expériences de culture de la plaque.
En outre, chaque échantillon de spécimen comprend différents stades de développement de la lésion athérosclérotique / progression, de la dysfonction endothéliale et la première étape de l'accumulation de lipides, en direction de stries lipidiques et le développement d'un coeur nécrotique de la rupture des plaques. Ainsi, afin de minimiser l'hétérogénéité des tissus de la plaque, il est nécessaire de couper les bords, qui représentent généralement des étapes précoces de l'athérogenèse.
Il ne peut être exclu que la coupe induit des réponses de blessures des tissus. Mais les plaques de culture de tissus expériences ont montré des niveaux d'expression des gènes comparables des tissus de la plaque de culture de tissus de plaque non-cultivées. Ainsi, cela souligne que la méthode actuelle est un bon outil pour étudier le milieu inflammatoire dans les lésions d'athérosclérose.
La culture demorceaux de plaque est limitée à une période de temps allant jusqu'à une journée. Si le tissu est cultivé sur plaque plus d'une journée, la variation des résultats augmente considérablement. En outre, au bout de 3 jours, la composition de la plaque et de la morphologie des effondrements.
Il ya des limites qui doivent être pris en compte lors de l'application de ce modèle. Le modèle in vivo ex est une bonne méthode pour étudier le milieu inflammatoire dans les lésions d'athérosclérose. Néanmoins, les principaux composants sont manquants dans ce contexte. Pas de caractéristiques hémodynamiques sont applicables et influences systémiques sont totalement absente. De plus, avec cette méthode, il est possible d'étudier les changements à court terme, mais il lui manque une analyse à long terme en raison de l'effondrement de la morphologie de la plaque.
En conclusion, nous présentons ici une méthode qui sera utile pour les chercheurs qui s'intéressent à la recherche de nouvelles molécules potentielles sur l'inflammation des lésions athéroscléreuses humaines. L'ex vivo plaque cmodèle ulture fait souffrir de différences entre la souris et le système immunitaire humain, mais il nous donne la capacité d'analyser l'interaction cellulaire dans le contexte des lésions athérosclérotiques et représentent l'occasion d'étudier les cascades inflammatoires lésionnels locaux et les voies. La méthode ex vivo de la culture de la plaque décrite ici est facile à utiliser et est reproductible et peut aider à identifier et valider de nouveaux mécanismes de la maladie et des cibles thérapeutiques.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n'ont pas de conflits de divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions Nadine Wambsganss pour une excellente assistance technique. Ce travail a été soutenu par la Fondation allemande pour la recherche (DFG) ER 682/2-1 et une allocation de recherche de la Société allemande de cardiologie à C. Erbel ainsi que d'une allocation de recherche de l'allemand académique service Heidelberg à L. Zhao.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI medium | Gibco | 21875-091 | |
| FCS | Gibco | 10270-106 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P-4458 | |
| 15 ml Tube | Sarstedt | 62,554,502 | |
| Culture dish (60 mm) | Orange Scientific | 5550200 | |
| LPS | Sigma | L4516 | |
| Cell culture plates 48-well | Greiner | 677102 | |
| Scalpel - single use | Feather | FEA200130011 | |
| TissueLyser | Precellys 24 Dual | Cat. No. EQ03119.200.RD010.0 | |
| RNeasy (Mini) Kit | Qiagen | Cat. No. 74104 | |
| Boehringer cDNA kit | Roche Diagnostics | Cat. No. 11483188001 | |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific |
References
- Lusis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407, 233-241 (2000).
- Hansson, G. K., Libby, P. The immune response in atherosclerosis: a double-edged sword. Nat Rev Immunol. 6, 508-519 (2006).
- Virmani, R., Kolodgie, F. D., Burke, A. P., Farb, A., Schwartz, S. M. Lessons from sudden coronary death: a comprehensive morphological classification scheme for atherosclerotic lesions. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20, 1262-1275 (2000).
- Erbel, C., et al. Expression of IL-17A in human atherosclerotic lesions is associated with increased inflammation and plaque vulnerability. Basic Res Cardiol. 106, 125-134 (2011).
- Erbel, C., et al. Functional profile of activated dendritic cells in unstable atherosclerotic plaque. Basic Res Cardiol. 102, 123-132 (2007).
- Bentzon, J. F., Falk, E. Atherosclerotic lesions in mouse and man: is it the same disease. Curr Opin Lipidol. 21, 434-440 (2010).
- Tran, D. Q., Ramsey, H., Shevach, E. M. Induction of FOXP3 expression in naive human CD4+FOXP3 T cells by T-cell receptor stimulation is transforming growth factor-beta dependent but does not confer a regulatory phenotype. Blood. 110, 2983-2990 (2007).
- Raes, G., et al. Arginase-1 and Ym1 are markers for murine, but not human, alternatively activated myeloid cells. J Immunol. 174, 6561-6562 (2005).
- Ingersoll, M. A., et al. Comparison of gene expression profiles between human and mouse monocyte subsets. Blood. 115, 10-19 (2010).
- Stary, H. C. Natural history and histological classification of atherosclerotic lesions: an update. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20, 1177-1178 (2000).
- Galkina, E., Ley, K. Immune and inflammatory mechanisms of atherosclerosis. Annu Rev Immunol. 27, 165-197 (2009).
- Suganuma, T., Workman, J. L. MAP kinases and histone modification. J Mol Cell Biol. 4, 348-350 (2012).
- Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis. Nature. 473, 317-325 (2011).
- Niessner, A., et al. Synergistic proinflammatory effects of the antiviral cytokine interferon-alpha and Toll-like receptor 4 ligands in the atherosclerotic plaque. Circulation. 116, 2043-2052 (2007).
- Monaco, C., et al. Canonical pathway of nuclear factor kappa B activation selectively regulates proinflammatory and prothrombotic responses in human atherosclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 5634-5639 (2004).
