Summary
טרשת עורקים היא תהליך דלקתי כרוני. כתב יד זה מדגים קל לשימוש מודל vivo לשעבר לחקור התרדמה טריות או הפלאק בעורקים הכליליים. מודל vivo לשעבר מאפשר החקירה של חומרים פוטנציאליים על הסביבה הדלקתית בטרשת עורקי אדם ותוצאות יכולים להיות מנותח על ידי שיטות שונות.
Abstract
טרשת עורקים היא מחלה דלקתית כרונית של כלי הדם. ישנן שיטות שונות כדי ללמוד את המתחם דלקתי בטרשת עורקים. מודלים עכבר הם כלי חשוב כדי לחקור תהליכים דלקתיים בatherogenesis, אבל המודלים האלה סובלים מהבדלים פנוטיפי ופונקציונליים בין מערכת חיסון אנושית והעכברית. בניסויים במבחנה תא משמשים כדי להעריך באופן ספציפי שינויי סוג תלוי לתאים הנגרמים על ידי חומר של עניין, אבל וריאציות תלויות תרבות וחוסר היכולת לנתח את השפעתן של מולקולות ספציפיות בהקשר של המתחם דלקתי בטרשת עורקים להגביל את ההשפעה של התוצאות. כמו כן, מדידת רמות של מולקולה של עניין בדם אדם מסייעת לחקור הרלוונטיות הקלינית שלה עוד יותר, אבל זה מייצג דלקת מערכתית ולא מקומית. לכן, אנחנו כאן לתאר מודל תרבות פלאק ללמוד ביולוגיה נגע טרשתית אדםvivo לשעבר. בקיצור, לוחות טריים מתקבלים מחולים שעברו endarterectomy או מעקפי השתלה ומאוחסנים במדיום RPMI על קרח עד לשימוש. הדגימות הן לחתוך לחתיכות קטנות ואחריו חלוקה אקראית לתוך צלחת 48 היטב, המכילים מדיום RPMI בנוסף למהותו של עניין, כגון ציטוקינים או כמוקינים לבד או בשילוב לתקופות זמן מוגדר. לאחר דגירה, חתיכות השלט ניתן הלם קפוא לבידוד ה-mRNA, משובץ בפרפין או אוקטובר לצביעת אימונוהיסטוכימיה או מרוסקת וlysed למערבית סופג. יתר על כן, תאים עשויים להיות מבודדים מהרובד לניתוח cytometry הזרימה. בנוסף, ניתן לאסוף supernatants למדידת חלבון על ידי ELISA. לסיכום, vivo המודל שהוצג לשעבר פותח את האפשרות ללמוד ביולוגיה lesional דלקתית, אשר עלול לגרום לזיהוי מנגנוני מחלה רומן ומטרות טיפוליות נוסף.
Introduction
טרשת עורקים כמחלה דלקתית כרונית היא אחת מסיבות מוות עיקריות במדינות מתועשות 1-2. סיבוכים של טרשת עורקים, תסמונת כלילית חריפה במיוחד, נמצאו קשורים לקרע של נגעים פגיעים, גורמים atherothrombosis וכלי חסימה 3. נראית חסינות מולדת ובעלי כושר הסתגלות להיות מעורבת בכל השלבים של atherogenesis 2,4-5. למרות התקדמות משמעותית נעשתה בטיפול באוטם שריר הלב, מניעה יעילה של טרשת עורקים ואירועי לב וכלי דם שליליים עדיין לא פתורים. לפיכך, ללמוד ביולוגיה lesional הוא חיוני להגדלת הידע שלנו על הפתופיזיולוגיה של טרשת עורקים ולאפשר זיהוי מטרות טיפוליות חדשניות ופיתוח של טיפולים חדשניים.
במקרים רבים, מודלים עכבריים משמשים כדי לחקור את הפתופיזיולוגיה של מחלות ספציפיות. עם זאת, לומד atherogenesis באמצעות מודלים עכבר הוא עכוmpanied ידי מספר מגבלות: (1) בדרך כלל, עכברים טרשתיים לקבל דיאטת כולסטרול גבוהה. רמות הכולסטרול במודלים האלה לא יכולות להיות בהשוואה לאלו בחולים עם רמות כולסטרול גבוהות בדם 6. (2) קיימים הבדלים מהותיים בין מערכת חיסון אנושית והעכברי; כך FOXP3 הוא סמן ספציפי של תאי T רגולטוריים עכבריים, ואילו ביטוי FOXP3 אדם בתאי T אנושיים לא בהכרח מקנה פנוטיפ רגולציה 7. כמו כן, הפרדיגמה Th1/Th2 כהגדרתו בבני האדם אינה ניתן להעברה באופן מלא לתאי T עכבריים. (3) מספר הסמנים המשמשים לזיהוי מונוציטים עכבריים ומקרופאגים כגון F4/80 וסמנים של קלאסי (M1) לעומת אלטרנטיבה (M2) דפוסי הפעלה אינו קיים בתאי מיאלואידית אדם 8. (4) התבטאות גנים של מונוציטים בדם היקפיים עכבריים ואנושיים כבר מצאה להיות שונה 9 באופן משמעותי.
לפיכך, על מנת להגביר את ההבנה שלנותהליכים דלקתיים כרוניים בטרשת עורקת אנושית, אנחנו צריכים לעשות שימוש במודלי עבודה עם רקמות אנושיות, דם או תאים. כאן, אנו מתארים מודל של תרבית רקמת רובד אנושית, המאפשרת חקירה של חומרי רומן פוטנציאליים בקונספט של הביולוגיה lesional דלקתית אנושית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכן בינוני כדלקמן
- תרבות בינונית: בינוני RPMI.
- הוסף 10% עוברי עגל בסרום (FCS).
- הוספת 100 פניצילין G U / ml, ו100 גר '/ מיליליטר סטרפטומיצין.
2. חפצים של גליל שלט טרי עד לשימוש
- פעולת הראש endarterectomy של חולים עם או בלי תסמיני איסכמי (שבץ, התקף איסכמי חולף) עם היצרות של עורק התרדמה משמעותית תיעשה על ידי מנתחי כלי דם וendarterectomy לב כלילית במהלך מעקפי השתלה על ידי מנתחי לב. תרדמה / שלטים כלילית צורך להסירו כמקשה אחת כדי לשמר את מבנה השלט כפי שתואר לעיל 5.
- אחרי מקום כריתת לוחית הדגימה בצינור בינוני מלא ולאחסן אותו על קרח (פלאק צריך להיות מכוסה לחלוטין עם מדיום) עד לשימוש.
3. עיבוד לוחית
- השתמש בצלחת נאותה תא תרבות (למשל 60 מ"מ)ולהוסיף 5 מיליליטר מדיום RPMI.
- הנח את רקמת פלאק לתוך צלחת התרבות (פלאק צריך להיות מכוסה לחלוטין עם מדיום).
- החזק את רקמת פלאק בזהירות בקצוות של הרקמה באמצעות מלקחיים סטריליות.
- חותכים את הקצוות של מדגם פלאק באמצעות אזמל סטרילי.
- מחלקים רקמת פלאק במחצית.
- להעריך את מורפולוגיה נגע macroscopically (מסויד, שומנים עשיר, מקרע, פקיק, פיברוזיס).
- לנתח מורפולוגיה פלאק המדויקת לאחר vivo הניסוי לשעבר על ידי אימונוהיסטוכימיה. השתמש בסיווג AHA 10.
- בטל הפלאק עם הסתיידות או פיברוזיס חמור.
- חותכים את רקמת השלט לחתיכות הומולוגיות קטנות (3 x 3 x 3 מ"מ).
- לזעזע להקפיא שתי חתיכות רובד ולאחסן אותם בחנקן נוזלי לערכי יסוד של הנגע עד לשימוש.
- הכן צלחת 48 היטב.
- הוסף 500 מדיום RPMI μl לכל המשמש גם לצורך הניסוי.
- נא להשתמשt לפחות שתי חתיכות שלט עבור כל קבוצה.
- הוסף את מהותו של העניין (למשל ציטוקינים וכמוקינים ספציפיים).
- השתמש חתיכות פלאק unstimulated שולטת.
- באופן אקראי לשתול המספר הופקע חלקי לוחית לתוך הבארות.
- תרבות חתיכות שלט לנקודות זמן שצוינו.
- לצורך ניסוי גירוי רקמת השלט עם lipopolysaccharide (LPS)
- השתמש בנקודתי הזמן הבאות: 3 שעות, 8 שעות ו24 שעות.
- השתמש 2 חתיכות פלאק לLPS ושתי לקבוצת unstimulated עבור כל נקודת זמן בהתאמה.
- הוסף 1 מיקרוגרם / מיליליטר של lipopolysaccharide.
- במהלך הדגירה, לשמור על הצלחת 48 היטב על 37 מעלות צלזיוס באוויר humidified המכיל 5% CO 2.
4. חתיכות רקמת פלאק קציר זמן מצויינים לאחר
- לזעזע להקפיא את חתיכות פלאק לבידוד mRNA וסינתזת cDNA (למידע מפורט, ראה פרוטוסעיף col 5).
- לאסוף את supernatant ואחסן אותו ב-20 ° C לניתוח ELISA.
- למערבי סופג, לרסק וlyse רקמת פלאק. סנן את lysate באמצעות מיקרומטר 0.65 ו0.1 מיקרומטר מכשיר מסנן צנטריפוגלי.
- להטביע רקמות פלאק ברקמות טק או פרפין לstainings אימונוהיסטוכימיה.
5. מיצוי RNA מחתיכות רובד תרבותיים
- השתמש TissueLyser להומוגניזציה.
- לבודד את הרנ"א על ידי שימוש בערכה (ראה טבלת חומרים) על פי הוראות יצרן.
- קבע את כמות RNA ואיכות של דגימות עם ספקטרופוטומטר.
- השתמש בערכת Boehringer cDNA לשעתוק לאחור על פי הוראות יצרן.
- לPCR כמוני, השתמש למשל בזמן אמת ערכת PCR רוש עם SYBR ירוק.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כאן אנו מציגים מספר הדמויות המדגימות תוצאות של vivo לשעבר culturing פלאק. כדי להעריך את השינויים בסביבה הדלקתית בתגובה לסוכן של העניין בvivo לשעבר ניסוי המודל, אנחנו מודדים מולקולות שונות אשר ידוע להיות מעורב בעיקר בatherogenesis. כציטוקינים פרו atherogenic נציג אנו בוחרים TNFa, IL6 וIFNg 2,11. בנוסף, אנו משתמשים בגורם פון Willebrand וגורם רקמות כדי להעריך את השינויים הפרו טרומבוטיים. יתר על כן, לתת מענה להתפתחות של חוסר יציבות הנגרמת על ידי פלאק סוכן של עניין, מטריקס metallopeptidase 9 (MMP9) רמות תנותח. Chemoattractance הוא גם צעד חשוב בהתקדמות רובד ורגרסיה 11, ובכך, אנו חוקרים את רמות CCL2, המכונים גם chemotactic מונוציטים חלבון-1 (MCP-1) chemoattractant עיקרון, למונוציטים / מקרופאגים. לאחר גלגול תא אטרקציה התא והידבקות הם בשלבים הבאים.בגלל שאנו בוחרים ICAM-1. על ידי ניתוח נוסף מסלולי האיתות מושפעים ממהותו של העניין אנו משתמשים קינאז (ERK1 / 2), בא לידי ביטוי ומופעל על ידי גירויים שונים כגון ציטוקינים, אפופטוזיס, התמיינות, הידבקות בוירוסים וליגנד לחלבון G heterotrimeric נרחב תאי מוסדר אות מצמידים קולטנים 12.
ראשית, עלינו להראות שינויים תלויים בזמן של המתחם דלקתי של נגעים טרשתיים בתרבית unstimulated, נותחו על ידי תגובה כמותית בזמן אמת פולימראז שרשרת (qRT-PCR) (איור 1). במהלך culturing פלאק, גידול של הפעילות של המילייה lesional דלקתי ניתן לצפות. לא נמצא הבדל לאחר 3 שעות לעומת אין תרבות (מידע לא מוצג). לאחר 8 שעות של תרבות פלאק, מצאנו גברת ביטוי קלה בלבד של כמה מולקולות כגון IL6, אבל לא של TNF וגרם IFN, ואילו לאחר 24 שעות, הייתה upregulationשל מולקולות שונות כגון TNF, IL6 וגרם IFN. יש לציין, כבר הזמן של תרבות פלאק הוא הווריאציה של ביטוי מולקולה גבוה יותר.
שנית, כדי להוכיח את ההיתכנות של השפעה על הסביבה הדלקתית בטרשת עורקים, אנו מציגים תוצאות של חתיכות פלאק הודגרו עם מיקרוגרם / LPS 1 מיליליטר למשך 3 שעות, שנמדד על ידי qRT-PCR (איור 2). חתיכות פלאק unstimulated שימשו כביקורת שלילית . מצאנו כי LPS גרם לעלייה ניכרת של הכיתה של הפעלה של המתחם דלקתי בתוך טרשת עורקים. ציטוקינים שונים (IL6, TNF וכו ', איור 2A-B), כמוקינים (CCL2 וכו', לא מוצג), הידבקות (ICAM1, לא מוצג), מערער את יציבות רובד (מטריקס metallopeptidase 9 (MMP9), לא מוצג) והפר מולקולות טרומבוטיים (גורם פון Willebrand, איור 2C, שלישית, כדי להעריך את שפע חלבונים, supernatants של נגעים בתרבית נותחו על ידי ELISA וניפץ רקמות פלאק ידי מערבי סופג (איור 3D). באיור 3A-C, אנו מציגים ניתוח ELISA של IFN-g, MCP-1 ו-TNF-בsupernatant של דגימות תרבית הודגרו עם LPS או שליטה במשך 8 שעות. בנוסף, ניתוח כתם מערבי לERK (פוספורילציה) 1/2 של רקמות שלט נופצו וlysated, או מגורה עם LPS או שליטה, בא לידי הביטוי באיור 3D. 
איור 1. השפעת culturing פלאק על מתחם lesional דלקתי לאורך זמן. חתיכות פלאק טרשת עורקות היו לזעזע מייד קפוא או בתרבית למשך 8או 24 שעות וביטוי של ציטוקינים הצביעו IL6 (א '), גרם IFN (B) ו-TNF (C) נותחו על ידי qRT-PCR. התוצאות המוצגות מייצגות את הממוצע של חמישה ניסויים בלתי תלויים. חמש חתיכות נגע טרשתיות לכל קבוצה שימשו לנקודת זמן שצוינה. ערכים הם מנורמל ב-אקטין והביעו כעותקי cDNA / 1,000 עותקים ב-אקטין. תוצאות מוצגות כחלקות תיבת מוצגות ממוצעת ו-25 ו75 עשירונים ה תיבות ו10 ה ו90 עשירונים th כמו שפם. *: P <0.01. 
איור 2. גירוי LPS של חתיכות רובד תרבותיים מושרה גידול של מולקולות דלקתיות שונות. חתיכות רובד הודגרו עם 1 מיקרוגרם / מיליליטר LPSאו unstimulated עבור 3 שעות ונותחו על ידי qRT-PCR. התוצאות המוצגות מייצגות את הממוצע של חמישה ניסויים בלתי תלויים. שתי חתיכות לכל קבוצה היו בשימוש. ערכים הם מנורמל ב-אקטין והביעו כעותקי cDNA / 1,000 עותקים ב-אקטין. תוצאות מוצגות כחלקות תיבת מוצגות ממוצעת ו-25 ו75 עשירונים ה תיבות ו10 ה ו90 עשירונים th כמו שפם. *: P <0.01. 
איור 3. ביטוי חלבון בsupernatant של פלאק בתרבית. מדידות הנציג ELISA של ציטוקינים IFN-g (), TNF-(B) וMCP-1 (ג) בsupernatant של חתיכות פלאק טופלו LPS או unstimulated ל8 שעה מוצגת. התוצאות המוצגות מייצגות את הממוצע של חמש ניסיוניים עצמאיts. תוצאות מוצגות כחלקות תיבת מוצגות ממוצעת ו-25 ו75 עשירונים ה תיבות ו10 ה ו90 עשירונים th כמו שפם. בנוסף, מערבי סופג נציג לERK (פוספורילציה) 1/2 של LPS מגורה או לשלוט בנגעים טרשתיים בתרבית אחרי 3 שעות באו לידי הביטוי באיור 3D. הגרפים בר טור בו מוצגות ממוצע + SEM כשפם מייצגים את הממוצע של חמישה ניסויים בלתי תלויים. *: P <0.01.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן אנו מציגים vivo לשעבר מודל תרבות פלאק כדי לחקור את ההשפעה של חומרים שעשויים להיות רלוונטיים בביולוגיה נגע טרשתית. היתרון העיקרי של vivo לשעבר בשיטה זו הוא היכולת להעריך את השפעתם של חומרים מצויינים בתאים דלקתיים והגומלין הסלולרי שלהם, כמו גם מסלולים ומפלים בתוך טרשת עורקי אדם דלקתיים. מספר שיטות לשימוש (למשל RT-PCR, כתם מערבי, אימונוהיסטוכימיה, cytometry זרימה, ELISA) עזרה כדי לספק ניתוח מקיף של ההשפעה של חומר ריבית על דלקת נגע טרשתית.
התהליכים דלקתיים בטרשת עורקת עכברית הם הבינו היטב, גם בזכות מודלים עכבר או חסר גנים מסוימים של עניין 11-להביע מעל. עם זאת, הממצאים אינם תמיד מתאימות באופן הדוק לבני אדם 6-9,13. עכברים טרשתיים בדרך כלל מקבלים גבוה חול פתולוגייםesterol דיאטה 6. בנוסף, ידוע כי מערכת החיסון בין בני האדם ועכברים להראות הבדלים משמעותיים 7-9. כאן, אנו מציגים מודל vivo לשעבר תרבות פלאק, המאפשר ללמוד את ההשפעה של חומר ריבית על המתחם דלקתי בטרשת עורקי אדם כפי שמוצג על ידי Niessner et al. 14. יתר על כן, ניתן להשתמש בשיטות שונות נוספות כדי לנתח את התוצאות של ניסוי תרבות פלאק, דומה למחקרים עכבריים. לכן, מודל vivo לשעבר פותח את האפשרות להחליף עכברי במחקרי vivo במקרים מסוימים עשוי לייצג בשיטת גישור מצוינת בין טרשת עורקים המשוערת קידום מולקולה במערכת והתרגום העכברי לביולוגיה של אדם.
Vivo המודל האנושי לשעבר לטרשת עורקת הוא לא ניתן להשוות בניסויים במבחנה תא. ניתן לאחסן בקלות ובשורות תאים בתרבית, אבל הם phenotypically ופוnctionally אינו זהה לתאים ראשוניים. ניתן להשיג תאים טריים על ידי דם רגיל מושך, אבל זה לפעמים קשה מאוד לתרבות ולתרבות נתונה לגורמים רבים. בנוסף, על ידי שימוש בניסויי תרבית תאים במבחנה, לא ניתן לחקור את ההשפעה של מולקולות ספציפיות במתחם דלקתי בטרשת עורקים. לכן, בניסויים במבחנה חשובים לצעד ראשוני (translational) לחקירות ביולוגיה של אדם, אבל לא מצליחים לנתח את התפקיד של המולקולה של עניין ברעיון של טרשת עורקים אנושית, במיוחד משחק גומלין סלולארי והשפעה על מפלים דלקתיים ומסלול בתוך טרשת עורקים נוסף .
מונקו et al. הוקם מערכת תרבות לטווח קצר חשובה של תאים מבודדים מהרקמה טרשתית אדם 15. הם השתמשו בתערובת האנזימטית של collagenase, אלסטט וDNase. שיטה זו מאפשרת חקירה של Lesiניסויי onal תאי תאים, איתות ניתוח מסלול ומחקרי העברת גנים עם וקטורי adenoviral. אבל זה עדיין לא ידוע איך התערובת אנזימטית משפיעה על התאים, כלומר גראד הפעלה, ביטוי סמן פני השטח וכו 'בנוסף, ניתן להטיל ספק בזה אם התוצאות של ניסויים אלה משקפים את התהליכים האמיתיים בתוך טרשת עורקים. יתר על כן, המיקום המקורי של התאים יושמד על ידי התערובת האנזימטית ומערכת התרבות בטווח הקצר יש אותן המגבלות כמו בניסויים במבחנה התא.
ללימודי תא או אוכלוסיית תאים ספציפיים בתוך נגע טרשתי, ניתן להשתמש בשיטה לנתיחה מיקרו הלכידה לייזר. מתחם התא או תא של עניין יהיה מנותק מהרקמות באמצעות אינפרא אדום או UV-לייזר ו-RNA, DNA או ניתוח חלבון ניתן לבצע. נתיחת מיקרו הלכידה לייזר לא נראתה נזק לתאים, expre קולטן תא השטחssion וכו 'יתרונה של השיטה הוא הניתוח של תא או מיקום של עניין בתוך נגע טרשתי. אבל זה לא ניתן להעריך עוד יותר את התאים כמו במבחנה.
מודל vivo לשעבר מפליל את מגוון רחב של שיטות אפשריות למדוד ולנתח את הממצאים. תגובת שרשרת של פולימראז זמן אמת ניתן לבצע לאחר סינתזת בידוד RNA וcDNA כדי לחקור את רמת ביטוי גנים, כפי שמוצגת על ידי Niessner et al. 14. אימונוהיסטוכימיה היא כלי שהוקם על מנת להעריך את רמת החלבון על מנת להוכיח את ביטוי החלבון והמוצא הסלולרי בתוך טרשת עורקים. מערבי סופג ניתן להשתמש בם כדי לנתח את מסלולי אות. בנוסף, תא בידוד על ידי עיכול בפתרון אנזים פותח את ההזדמנות כדי לבצע ניתוח תזרים cytometry לנתח נוסף לסוג תא, למשל, תת סלולארי וכיתה של הפעלה. יתר על כן, לאחר בידוד התאspectratyping מייצג שיטה טובה כדי לנתח את השתנות קולטן תא T נוסף. יתר על כן, לאחר בידוד תא מגנטי העיכול הוא שיטה איכותית מוכחת של הפרדת תאים של תת סלולריים ספציפיים במבחנה במחקרים נוספים או ניתוח microarray. לבסוף, ניתן לאסוף supernatants למדידת חלבון על ידי ELISA. לסיכום, מודל vivo לשעבר הוא כלי רב ערך כדי לחקור את השינויים המדויקים בסביבה הדלקתית בטרשת עורקי אדם.
מודל vivo לשעבר מבוסס על דגימות endarterectomy. שימוש פלאק טרשת עורקים המתקבל מאנשים שונים עלול לגרום למידה רבה יותר של הרכב תאי ההפרש ווריאציה כך גבוהה יותר של הרמות של גנים / חלבונים של עניין. לכן, חשוב להשתמש בדגימות פלאק עשירות או מסובכות שומנים בדם ולא נגעי fibrosclerotic 10, כי התגובה הדלקתית היא נמוכה במידה ניכרת בlesio fibroscleroticNS. לכן, זה עניין רב להעריך את מורפולוגיה פלאק לפני ניתוח התוצאות של ניסויי תרבות פלאק.
בנוסף, כל דגימת דגימה כוללת שלבים שונים של התפתחות / התקדמות טרשת עורקים נגע, מהתפקוד הלקוי של האנדותל הראשוני ושלב הצטברות שומנים בדם, לכיוון פסי שומן ופיתוח של ליבת נמקים ללוחות מקרע. לפיכך, על מנת למזער את ההטרוגניות של רקמות השלט, יש צורך לחתוך את הקצוות, המהווים בדרך כלל את שלבים מוקדמים של atherogenesis.
זה לא ניתן לשלול שהחיתוך גורם לתגובות פגיעה ברקמות. אבל ניסויי התרבות שלנו פלאק הרקמה הראו רמות ביטוי גנים דומות של רקמות הרובד התרבותיים לרקמות פלאק הלא מתורבתות. לכן, זה מדגיש כי השיטה הנוכחית היא כלי טוב כדי לחקור את הסביבה הדלקתית בטרשת עורקים.
התרבותחתיכות פלאק מוגבלת לתקופה של יום עד פעם אחת. אם רקמת פלאק היא תרבית יותר מיום, הווריאציה של עליות התוצאות באופן דרמטי. בנוסף, לאחר 3 ימי הרכב השלט והמורפולוגיה מתמוטט.
יש מגבלות שצריכות להישמר בחשבון בעת יישום מודל זה. מודל vivo לשעבר הוא שיטה טובה ללמוד את הסביבה הדלקתית בטרשת עורקים. עם זאת, מרכיבים עיקריים חסרים בהקשר זה. אין תכונות המודינמית חלות והשפעות מערכתיות חסרות לחלוטין. בנוסף, בשיטה זו אפשר רק לחקור שינויים לטווח קצר, אך חסר ניתוח לטווח ארוך בגלל הקריסה של מורפולוגיה פלאק.
לסיכום, אנו מציגים כאן שיטה שתהיה שימושי לחוקרים המעוניינים בחקירה של מולקולות פוטנציאליות חדשות בדלקת נגע טרשתית אנושית. Vivo לשעבר פלאק גמודל ulture עושה סובל מהבדלים בין מערכת חיסון אנושית והעכברי, אבל זה נותן לנו את היכולת לנתח את יחסי הגומלין הסלולריים בהקשר של טרשת עורקים ולייצג את ההזדמנות כדי לחקור את המפלים מקומיים lesional דלקתיים ומסלולים. Vivo לשעבר שיטת תרבות פלאק המתוארת כאן היא קלה לשימוש וניתנת לשחזור ועשויה לסייע לזהות ולאמת את מנגנוני מחלה רומן ומטרות טיפוליות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין לי המחברים התנגשויות לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים לנדין Wambsganss לקבלת סיוע טכני מעולה. עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר הגרמנית (DFG) 682/2-1 ER ומלגת מחקר מהחברה הגרמנית לקרדיולוגיה לג Erbel כמו גם מלגת מחקר מהגרמני האקדמי שירות היידלברג לל 'זאו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI medium | Gibco | 21875-091 | |
| FCS | Gibco | 10270-106 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P-4458 | |
| 15 ml Tube | Sarstedt | 62,554,502 | |
| Culture dish (60 mm) | Orange Scientific | 5550200 | |
| LPS | Sigma | L4516 | |
| Cell culture plates 48-well | Greiner | 677102 | |
| Scalpel - single use | Feather | FEA200130011 | |
| TissueLyser | Precellys 24 Dual | Cat. No. EQ03119.200.RD010.0 | |
| RNeasy (Mini) Kit | Qiagen | Cat. No. 74104 | |
| Boehringer cDNA kit | Roche Diagnostics | Cat. No. 11483188001 | |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific |
References
- Lusis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407, 233-241 (2000).
- Hansson, G. K., Libby, P. The immune response in atherosclerosis: a double-edged sword. Nat Rev Immunol. 6, 508-519 (2006).
- Virmani, R., Kolodgie, F. D., Burke, A. P., Farb, A., Schwartz, S. M. Lessons from sudden coronary death: a comprehensive morphological classification scheme for atherosclerotic lesions. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20, 1262-1275 (2000).
- Erbel, C., et al. Expression of IL-17A in human atherosclerotic lesions is associated with increased inflammation and plaque vulnerability. Basic Res Cardiol. 106, 125-134 (2011).
- Erbel, C., et al. Functional profile of activated dendritic cells in unstable atherosclerotic plaque. Basic Res Cardiol. 102, 123-132 (2007).
- Bentzon, J. F., Falk, E. Atherosclerotic lesions in mouse and man: is it the same disease. Curr Opin Lipidol. 21, 434-440 (2010).
- Tran, D. Q., Ramsey, H., Shevach, E. M. Induction of FOXP3 expression in naive human CD4+FOXP3 T cells by T-cell receptor stimulation is transforming growth factor-beta dependent but does not confer a regulatory phenotype. Blood. 110, 2983-2990 (2007).
- Raes, G., et al. Arginase-1 and Ym1 are markers for murine, but not human, alternatively activated myeloid cells. J Immunol. 174, 6561-6562 (2005).
- Ingersoll, M. A., et al. Comparison of gene expression profiles between human and mouse monocyte subsets. Blood. 115, 10-19 (2010).
- Stary, H. C. Natural history and histological classification of atherosclerotic lesions: an update. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20, 1177-1178 (2000).
- Galkina, E., Ley, K. Immune and inflammatory mechanisms of atherosclerosis. Annu Rev Immunol. 27, 165-197 (2009).
- Suganuma, T., Workman, J. L. MAP kinases and histone modification. J Mol Cell Biol. 4, 348-350 (2012).
- Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis. Nature. 473, 317-325 (2011).
- Niessner, A., et al. Synergistic proinflammatory effects of the antiviral cytokine interferon-alpha and Toll-like receptor 4 ligands in the atherosclerotic plaque. Circulation. 116, 2043-2052 (2007).
- Monaco, C., et al. Canonical pathway of nuclear factor kappa B activation selectively regulates proinflammatory and prothrombotic responses in human atherosclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 5634-5639 (2004).
