Summary
אנו מתארים את הנתיחה של מערכת העצבים של ים הארנבת הימית
Abstract
יש חלזון הרכיכה הימי Aplysia californica היסטוריה מכובדת כמודל של תפקוד מערכת עצבים, עם משמעות מיוחדת במחקרים של למידה וזיכרון. ההכנות האופייניות למחקרים מסוג זה הן אלה שבי חושיים ונותרו ללא פגע motoneurons בבעלי חיים גזורים מינימאלי, או תרבות משותפת עצבית טכני משוכללת של חושי וmotoneurons פרט. פחות נפוץ היא ההכנה העצבית המבודדת שבו אשכולות קטנים של תאי עצב להלכה הומוגניות הם ניתקו לתוך תאים בודדים בתרבות בטווח קצרה. תאים מבודדים כאלה שימושיים לאפיון biophysical של זרמי יונים באמצעות טכניקות מהדק תיקון, ואפנון ממוקד של conductances אלה. פרוטוקול להכנת תרבויות כאלה מתואר. הפרוטוקול מנצל את עצב סנסורי glutamatergic בקלות לזיהוי של גרעיני צדר וbuccal, ומתאר את הניתוק שלהם ותחזוקה המינימאליתתרבות n במשך כמה ימים ללא סרום.
Introduction
רכיכת opistobranch הימית, Aplysia, כבר מודל הנוירוביולוגי שימושי במשך עשורים רבים. הוא ידוע בעיקר כמודל של התרגלות והתניה קלסית 7, 8. מחקרים על למידה וזיכרון במודל זה זכה בפרס נובל לפיזיולוגיה ורפואה בשנת 2000 לאריק ר 'קנדל, בפרס הוא משותף עם Arvid Carlsson ופול גרינגרד 10. מחקרים שכלל הקלטות חשמל מהכנות מופחתות, שבו אלמנטים של מערכת העצבים של חסר חוליות זה הם גזורים מבעלי החיים עם עצבים ושרירים עזבו מצורף, סייעו להבהיר את התפקידים של נוירונים בודדים בAplysia. זיהוי של מנגנונים מולקולריים מדויקים המהווים למידה בAplysia עם זאת, לעתים קרובות מועסק טכניקה אחרת, לטווח ארוך שיתוף תרבויות של נוירון חושי וmotoneuron, השיגה אחד אחד מבעלי החיים תורמים בודדים ואפשרו ליצירת סינפסה בצלחת תרבות 21 .
אנחנו ואחרים 1, 3, 6, 14, 15, 16, ניצלו את הקלות שבי זיהה יכולים להיות ממוקדים נוירונים במודל זה, כמו גם הסיבולת שלהם בניסויים לטווח ארוך כדי להפוך את תרבויות טווח קצרות ניתקות של צבירי נוירונים להלכה הומוגניות שבו אנחנו לומדים זרמים יוניים תחת מהדק מתח בתצורת תיקון המהדק. נוירונים רבים Aplysia לעמוד לסיבובים חוזרים ונשנים של תיקון הידוק כדי לאפשר זמן למניפולציות ניסיוני לטווח ארוך. הטכניקה שימושית לתאי עצב, כגון תאי neurosecretory השקית של גנגליון הבטן, ואת עצב סנסורי של גרעיני צדר וbuccal דיסוציאציה שאנו מתארים כאן, אבל לא לתאי עצב גדולים מאוד> קוטר 60 מיקרומטר, כגון L7 או R2 של גנגליון הבטן. אנחנו לא מעסיקים Aplysia סרום בתרבויות שלנו, בניגוד לשיתוף התרבויות חושי motoneuron המתוארת במקום אחר. רוב הנוירונים שהושגו באמצעות הליך זה יהיו ללא תהליכים עבור tאז הוא ראשון 48 שעות בתרבות, בהנחיית שלמה הקלטת מתח תא, אלא יצמח ולפרט אקסונים ותהליכים אחרים למשך כ 14 ימים לפני שמת ממחסור בחומרים מזין ו / או גורמי גדילה.
טכניקה זו מייצרת תרבויות העיקריות של 50-100 נוירונים לכל צלחת מאזורים שתועדו פיסיולוגיים של גרעיני buccal וצדר. פרוטוקול זה שימושי לחוקרים לומדים היבטים של פיזיולוגיה של תא בודד בניסויים הדורשים ניסיון רב משכפל לכל בעלי חיים. הוא מייצר זוג תואם של תרבויות בשל ההפרדה האנטומי של תאי המטרה לhemiganglia ימין ועל שמאל, ומאפשר שתועלת ממחקרי הטיפול מתאים ותרבויות בקרה.
פרוטוקול מטרות מצרר buccal S (BSC) הנוירונים של גנגליון buccal ופלאורלי ventrocaudal (PVC) הנוירונים של גנגליון פלאורלי. תאים אלה הם גודל מתאים לכל הקלטות מתח תא וRobus התצוגהתגובות glutamatergic t. המתודולוגיה דנה מתאימה לרוב הגרעינים במערכת העצבים Aplysia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת תא
- ביום 1, לשקול ולהרדים בעלי חיים.
- שוקל 30 ק"ג חיה G-1. הרדימי במחזורי 5-10 בעלי חיים של 1:1 מי ים: MgCl איזוטוני. 6 שעות 2 0 במשך שעה 1 עם אוורור כגון משאבת אוויר אקווריום חשמלית עם airstone המצורף.
- כדאי להכין ציוד לנתיחה.
- להרכיב מגש חיתוך נקי עם סיכות ישרות מנירוסטה, כגון סיכות בד. להרכיב כמה צלחות פטרי המכילות מי ים מלאכותי (ASW; ראה לוחות 1 ו -3) + פניצילין / סטרפטומיצין (P / S).
- יש מיקרוסקופ חשמל נמוך מוכן. יש מכשירי חיתוך נקיים מוכנים, כגון האף מצולעים ומלקחי כירורגיות בסדר, ובסדר ומספריים כירורגיות גדולים. לרסס את המכשירים עם 70% אלכוהול isopropol לפני השימוש ולאפשר לו להתייבש.
- בעלי החיים עמדו על מגש לנתיחה.
- עמדת חיה צד למטה הגחון במגש לנתיחה. בעלי חיים פיןדרך קצוות של קיר גוף וגבולות parapodial, אך להימנע מזנב וראש, כדי לחשוף את פני השטח הגבי וחריץ איברי המין
- יש לשטוף את המשטח הגבי במים ברז קרים והאיטי בריצה. החל זרם אור של 70% אלכוהול isopropol מבקבוק לחיץ לאורך חריץ איברי המין ועל החלק העליון של הראש.
- הפוך את החתך הראשוני.
- באמצעות מיקרוסקופ כוח נמוך (ראה טבלה 2) ובא לידי ביטוי באור כדי לראות את הנקודה שבה חריץ המין נובע ממרווח הקליפה הקדמי, מתיחות להחזיק עם מלקחיים מצולע האף קיפול של רקמה בצד השמאל של מקור זה, תוך חיתוך רדוד חור לאורך כל הדרך החלק, האזור השטוח של קיר גוף רק בצד ימין של חריץ איברי המין עם מספריים בזווית משובחים.
- Hemolymph יש לשים לב לשפוך מהחור, לעתים נושא עימה גנגליון בטן והבטן.
- להרחיב את החתך.
- השתמש במספריים גדולים כדי להרחיב את החתך דואר anteriorly לנקודה בין rhinophores, תוך משיכת כלפי מעלה עם הלהב התחתון, כדי למנוע גניבת ציוד המעיים. האיברים הפנימיים יקויימו לשפוך מתוך החתך.
- הסר את הגרעינים.
- למקם את המגש ולמקד את המיקרוסקופ באזור הראש.
- בעזרת מלקחיים נקיים ומספריים עדינים, הסר את גרעיני הראש על ידי ניתוק בנקודה אחת את העצבים היוצרים את גרעיני הראש לתוך טבעת סביב הוושט כדי להסיר צדר-דוושה ומוחות גרעיני כקבוצה.
- הסר את גנגליון buccal ששומר על צד הגחון של הוושט.
- הסר את גנגליון הבטן על ידי חיתוך 4 connectives העצב גדול שהנושא מגנגליון זה.
- לבודד את הגרעינים של עניין.
- חתוך גרעיני ראש בנפרד, ומשאיר באורך של connectives מחובר זה לזה גנגליון של עניין ששווה לפחות הקוטר של גנגליון, זה יהיה לעכב אנזים יתר מערכת העיכולשל התאים של עניין בשלב הבא.
- לשים את כל גנגליון היעד באמצעות 2 שטיפות של ASW + P / S, נע בין שטיפות עם מלקחיים נקיים.
- אם מיקוד תאי PVC, השאר את hemiganglion צדר הזכות צמודה לhemiganglion הדוושה הימנית, ובאופן דומה לעזוב את hemiganglion צדר השמאלי מחובר לhemiganglion הדוושה השמאלית.
- השלך הגרעינים לא רצויים ושאר בעלי החיים על פי נוהג מקובל במחקר.
- Enzymatically לעכל את הגרעינים.
- עבור כל גנגליון, להכין 1 מ"ל של תמיסת אנזים בהיקף של 3.75 מ"ג dispase, hyaluronidase 1 מ"ג ו0.3 גרם collagenase הסוג XI לכל מ"ל של ASW + P / S בצינור פוליפרופילן חרוטי 15 מ"ל.
- המקום נשטף הגרעינים בפתרון אנזים ולצרף את הכובע בחוזקה. מניחים את הצינור על צידו על שייקר סיבובי (ראה טבלה 2) במהירות איטית לשעה 13-5 בלילה כ 23 מעלות צלזיוס (טמפרטורת חדר).
- הכןמנות התרבות.
- לפני microdissection (יום 2), להכין מנות התרבות במכסת מנוע בתרבית רקמת פולי-D-ליזין (PDL) מצופים. הוסף ~ 0.5 מ"ל PDL (0.2 מ"ג / מ"ל של מים סטריליים) למרכז צלחת 35 מ"מ ל~ 25 דקות.
- יש לשטוף את PDL 3x עם מים סטריליים. לאפשר לו להתייבש. UV-לעקר את הצלחות.
- יום 2 בודד תאי עצב.
- מלא מרכז 35 מנות מ"מ שהיו PDL מצופה וUV מעוקר עם כ 0.5 מ"ל של ASW + P / S כדי ליצור אי של מדיה בתוך הצלחת אחרת היבשה. ניתן לעשות זאת על הספסל, מחוץ למכסת מנוע בתרבית הרקמה. צלחת אחת צריכה להיות מוכנה לכל אשכול של תאים שמקורם hemiganglion.
- יש צלחת לנתיחה בקוטר 100 מ"מ מוכן שנעשתה על ידי sylgard ציפוי וריפוי משטח 5 מ"מ עמוק נתיחה, לבוש עם סיכות לנתיחה קנס של כמה מידות כדי לשמש כסיכות ובדיקות (ראה טבלה 3). יש לשטוף את המנה הזו עם 70% אלכוהול isopropol, ולאחר מכן עם ASW + P / S, ולבסוף Fill עם ASW + P / S.
- הכן microdissection של הגרעינים מעוכל.
- יוצקים את התמיסה המכילה אנזים צדר-הדוושה וbuccal הגרעינים מתעכלים לתוך הצלחת לנתיחה.
- מניחים את הצלחת על הבמה של מיקרוסקופ כנגד משטח שחור תחת אור מוחזר.
- שימוש ברקמת החיבור המצורפת, להצמיד כל צד הגבי hemiganglion צדר-דוושה למעלה. הרקמות תהיה רכות ולא סובלניים של מתיחה.
- Microdissect נוירונים PVC.
- באמצעות 2 זוגות של מלקחיים עדינים נקיים, ומחזיק את סיכת נתיחת קנס בזוג אחד של מלקחיים כמו בדיקה, לבודד את תאי PVC מhemiganglion פלאורלי. אנזים עיכול יהיה הוסר או שבורה מנדן רקמת חיבור המכסה את אשכול PVC, אך התאים ידבק אחד לשני.
- השתמש הבדיקה לנתק את התאים הללו מחיבור דוושת פלאורלי 18, אז תן אשכול סתיו התא לחלק התחתון של הנתיחהמנה.
- העבר את הנוירונים לצלחת התרבות.
- העבר את אשכול התא לצלחת תרבות 35 מ"מ שהוכנה על ידי בעדינות מתחנף האשכול לתוך קצה מעט אש מלוטשת חד פעמית זכוכית פיפטה פסטר, ולאחר מכן מחלק אותו לאט לתוך האי התקשורת בצלחת התרבות, להיות זהיר, כדי למנוע החדרת בועות אוויר לתוך פיפטה. חזור על בידוד של אשכול PVC של hemiganglion האחרים והמקום לתוך צלחת תרבות נפרדת.
- Microdissect ולהעביר נוירונים BSC.
- להצמיד את צד הגחון גנגליון buccal למעלה, בזהירות כדי לא לפגוע בתאים של עניין. חזור על שלב 1.12 עם 2 צבירי תאי BSC של גנגליון buccal 10.
- בידוד של נוירונים PVC וBSC יהיה לייצר 4 מנות התרבות המכילות צבירי נוירונים המכילות: 2 מנות אשכולות BSC ו -2 מנות המכילים צבירי PVC. מחק את שאר הגרעינים ומניחים בצד הצלחת לנתיחה 100 מ"מ.
- Dissociate את צבירי התאים.
- מניחים צלחת תרבות המכילה תאים על הבמה של מיקרוסקופ כוח הנמוך ולהסיר את הכיסוי.
- לנתק את אשכול PVC בעדינות על ידי מצליף את תחתית צלחת התרבות בסמוך לאשכול התא עם סיכת נתיחת קנס שנערכה במלקחיים. מצליף הוא לחפור את הקצה של הסיכה לתוך הפלסטיק של תחתית הצלחת כאילו מנסה לחפור את כתם מפלסטיק. כאשר חיכוך עם הפלסטיק משחרר את נקודת הסיכה, גל כלי הקשה מופק באמצעות המדיום שמפרק הגוש הסמוך של תאים.
- תנועות 05-10 מאי תהיה צורך כמעט לנתק את התאים לחלוטין, אבל עדיף להשאיר את האשכולות קטנים של תאים ולא לקפיציים יותר מדי פן ייהרסו את התאים על ידי צרופה מכאני.
- החלפת מכסים ולחזור עם מנות התרבות אחרות.
- אחסן תרביות תאים.
- מניחים את מנות התרבות המכילות איי תקשורת במרכזים שלהם עם תאים ניתק לתוךמיכל גדול המאפשר זרימת אוויר, כגון צלחת 25 מ"מ x 150 סיבוב פטרי פלסטיק, ומניח את המנה הזו בסט חממה עד 17 ° C.
- להתקין בתא צלחת פתוחה של מים כמקור ללחות. לעזוב ללא הפרעה בין לילה. התאים ידבק בציפוי פולי-D-ליזין במרכז הצלחת.
- מנות תרבות מבול.
- ביום 3, בעדינות להציף את המנות עם 2.5 מ"ל של ASW + P / S. לבחון וספירת התאים באמצעות מיקרוסקופ תרבית תאים הפוך. חנות ב17 ° C החממה.
2. Electrophysiology
השיטה היא תיקון סטנדרטי הידוק שתואר בטקסטים רבים (למשל סאקמן ונהר, 1995) 16. פרוטוקול זה יעבוד על תאי ≤ קיבול 100 PF, או תאים <קוטר 60 מיקרומטר בימים 3 ו 4 לפרוטוקול. תאים ללא תהליכים הם אופטימליים להקלטה. Considerat המיוחד הבאיונים להחיל:
- ניתן לאכלס תאים גדולים יותר עם הגדרת התצורה במגבר 200B Axopatch מוגדר β = 0.1. הפעלה של זרמים גדולים מאוד עלולה לגרום לתאים כדי להימלט מהדק מתח. פתרונות ASW תחליף לתוכן מלח (לדוגמה: חלק של NaCl להחליף עם כלוריד N-methy-D-glucamine בלתי חדיר) עשויים לשמש כדי להפחית את כל משרעת נוכחית תא.
- pipettes תיקון ורוסיליקט מלא סיבים משך על חולץ פיפטה וbackfilled אמצע הדרך עם פתרון תאי (ICS) בהיקף של 450 מ"מ KCl ומלחים אחרים (ראה טבלת מס '1) הם מתאים, וצריך להיות התנגדות של כ 0.5-1 MOhms. אם בידוד של זרמים יוניים ספציפיים הוא רצוי, למשל, Na + זרמים יכולים להיות מוחלפות בהיעדר זרמי K, K + בפתרון זה עם יונים אחרים כגון מדעי המחשב +. Cl - החלפה של מעגלים משולבים עם אניון impermeant גם אם מוצדק ICS טבעי יותר הוא רצוי9.
- התאים הם חזקים עם> 1 הקלטות ארוכות-HR אפשריים בטמפרטורת חדר. הקלטה היא אופטימלית בימים 3 ו -4 לפרוטוקול, המקביל ל 24-48 שעות בתרבות. לאחר 48 שעות יש קושי להרכיב חותמות gigaOhm, אולי בגלל הפירוט של glycocalyx על פני התא, ובעיות שנגרמו על ידי מהדק חלל תולדת תהליך. התאים שימושיים, עם זאת, ללימודים שאינם תיקון מהדק, כגון רעלים, שיכולים להתבצע ב< 14 ד.
- ASW ופתרונות אחרים כדי להימכר מכשיר הפתרון האכיל את כוח הכבידה, כמו גם פתרון תאי, צריכים להיות מסוננים באמצעות מזרק רכוב 0.2 מיקרומטר Acrodisk מסנן (לוח 3) לחסל את החלקיקים קטנים שמפריעים להיווצרות חותם gigaOhm.
- הפחתת רגישות מתרחשת בעת שימוש באגוניסטים כגון D-Aspartate (D-ASP), ולכן ~ 1-2 דקות בין יישומים של אגוניסטים מומלץ. לעומת זאת, potentiation הוא נצפה לעתים קרובות עם appli חזר מהירקטיון של אגוניסטים כגון L-גלוטמט (L-Glu).
- אגוניסט זרמים הופעלו כגון L-Glu ניתן ללמוד על ידי יישום אגוניסטים עם פיפטה Picospritzer. פיפטה זה משך את אותו הדבר כמו פיפטה את התיקון והוא מכיל אגוניסט בASW. כאשר קצה פיפטה זו ממוקם מתחת לצינור היציאה של מכשיר הפתרון האכיל את כוח הכבידה, ובזווית של ° 45 מצינור יצוא (איור 2F), אגוניסט יהיה שטף במהירות מתא, והפחתת הרגישות תהיה ממוזער. פיפטה אגוניסט צריכה ליצור זווית של 90 מעלות או יותר יחסית לפיפטה את התיקון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
את מיקומם של תאי העצב התחושתיים בתוך הגרעינים שממוקדים בפרוטוקול זה, הנוירונים BSC ו-PVC מוצגים באיור 1. הנוירונים BSC נמצאים ב2 אשכולות סגלגלים סימטריים בצד הגחוני של גנגליון buccal, את פני השטח שפונה מגוש buccal בגנגליון שלם (איור 1 א). הנוירונים PVC יצירת צבירים דו צדדיים, בצורת V שמקיפים את פני השטח הגבי של גנגליון צדר לכיוון הציר המרכזי (איור 1). יש עצב סנסורי אלה יש את היתרון של מיקום סטריאוטיפי בתוך הגרעינים, למרות מקבץ ימין או שמאל חסר בחיות בודדות בכ -1% ממופעים. BSC וצבירי נוירונים PVC ניתן לזיהוי על ידי הצבע הכתום הכהה של קרום התא וגודלו קטן יחסית בהשוואה לתאים סמוכים, כפי שמוצגים במתווה המעגל הגדולה של איור 1 א.
בתרבות, אלהתאי עצב הם לעתים קרובות ללא תהליכי היום לאחר ציפוי (איור 2 א) והם אידיאליים לתיקון מהדק באותו יום, ויום אחד לאחר מכן. לעתים ניתן להשיג מהדק מרחב מספיק גם כאשר מופיעים התאים יש תולדת תהליך (איור 2F), טוען כי לא כל הנבטה נראה כי לנבוע מהגוף התא היא חלק מהתא. אם טיפול לאחר עיכול אנזימטי היה עדין, תאים מגיעים בתרבות עם כמה תהליכים שלמים, ותהליכים אלה יגדלו עם זמן (איורים 2 ב-2E). תאים אלה אינם מתאימים לתיקון clamping אבל הקלטה תאית אפשרית.
זרמי מהדק תיקון תאים שלמים הנישאים על ידי מתח מגודר Na + וCa 2 + נרשמים בקלות מתא עצב PVC והתואר ראשון בתרבות 6 לטווח הקצר, ושני סוגי התאים להציג K מעורב נוכחי. נוירונים BSC גם מגיבים לאצטילכולין, סרוטונין וNMDA 4 (איור 3 ג ) עם זרמים מעוררים, בעוד הן נוירונים PVC BSC ולהגיב לL-Glu ו-D-3-ASP (איורים 3 א ו 3 ב) עם זרמים מעוררים. המאפיינים תרופתיים של L-Glu-והזרמים מושרה-D-ASP בנוירונים אלה כבר תוארו 4.
איור 1. Photomicrographs מראה את המיקום של תאי העצב התחושתי glutamatergic של גרעיני buccal וצדר (עיגולים אדומים). א buccal S מצרר (BSC), הניתנים לזיהוי על ידי נוירונים צבעם הכהה הכתום (המעגל גדול על hemiganglion שמאל) והתפקיד המקביל ב אשכול hemiganglion הימני (עיגולים קטנים יותר). בצורת V ב ', כתום כהה צדר ventrocaudal (PVC) של תא hemiganglion pleural ימין (שמאל hemiganglion לא מוצג).
גיל = "תמיד"> 
איור 2. Photomicrographs של עצב סנסורי glutamatergic בתרבות תאי א 'משעת 24 באשכול לאחר ציפוי PVC בצלחת התרבות מראה 2 נוירונים חושיים ותאים אחרים; תאים אחרים. PVC מתרבויות נפרדות ב24 שעות מוצגים כריבועי B, C.. נוירון BSC בתרבות ב24 שעות ואותו נוירון ב96 שעות, בהתאמה. ד ', א' נוירון PVC בתרבות ב24 שעות ואותו נוירון ב96 שעות, בהתאמה. פ PVC נוירון ב48 שעות ב ניסוי מהדק תיקון. פיפטה את התיקון היא פנייה לתא מהקצה הימני, בעוד פיפטה Picospritzer היא בתחתית. הצל הכהה הגדול נראה לעין בצד השמאל של התא הוא הפתיחה של פיפטה האמבטיה זורמת. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 3. זרמי glutamatergic בכל הקלטות מהדק תיקון סלולריים מתא עצב BSC ו-PVC. א תא נוכחי בכל נוירון BSC בתגובה לבקשת לחץ של L-Glu (1 מ"מ, 100 אלפיות שני). ב 'תא נוכחי בכל תא עצב בPVC תגובה לבקשת לחץ של D-ASP (1 מ"מ, 100 אלפיות שני). ג תא כל NMDA הנוכחי באותו התא BSC כמו ב( 1 מ"מ, 100 אלפיות שנייה).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
טכניקות דיסוציאציה מתוארות כאן יניבו תרבויות נוירון חושיות המכילות 50-100 נוירונים בודדים וביניהם מספר קטן של תאי גליה ובלתי מזוהים אחרים. השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול הם זמן הגרעינים יישארו בפתרון אנזים, והמצליף, ניתוק מצבירי התאים מתעכלים להתפרק האשכול לתוך תאים בודדים. אנזים עיכול (שלב 1.8) חייב להיות מותאם בטמפרטורה זמינה. בשעה 23 ° C עם רעד איטי, 13 שעות מספיקות לעיכול של BSC אשכולות while15 שעות היא אופטימלית עבור אשכולות PVC. תשואות נמוכות בתא צלחת התרבות ניתן לייחס לזמן מספיק באנזים, או יותר מדי הפרעה מכאנית באחד צעד ההעברה לתא (1.11 ו 1.12) או בזמן מצליף הצעד (1.13). כישלון של התאים להיצמד אל מצע התרבות, כמו גם הישרדות קצרה בתרבות היא בדרך כלל עקב הפרעה מכאנית מדי. זיהום של מבוי סתוםTures יכול להתרחש גם, והיא מטופלת על ידי המיטב להבטיח כי בעל חיים מורדמים הוא שטף היטב, כי מכשירי הנתיחה הם נקיים, וכי הגרעינים של עניין הם הכניסו דרך כמה שטיפות בASW + P / S. זה עשוי להיות נחוץ כדי לשטוף ואלכוהול נקי מכשירים בין חלקים שונים של הליך הנתיחה, או יש לך מספיק כלים מוכנים, כך שנקיים אלה יכולים לשמש לכל שלב.
מחקרים הנוירוביולוגי Aplysia לרוב נערכו על הכנות מופחתות המשמרות קשרים עצביים בין תאי עצב או בין תאי עצב ושרירים 2, 18. הכנות אלה להקל את ההקצאה של בקרה של תהליכים שריריים לתאי עצב ומעגלים עצביים ספציפיים וגם תאפשר מחקרים של ההגברה ולהנחיה של רפלקסים חוזרים ונשנים. הכנות שלמות הם לא מתאימים לסוגים מסוימים של פרוטוקולי מהדק מתח ולימוד ההשפעות של אגוניסטים שמהירות להפחית רגישות הקולטנים שלהם.
שיתוף התרבות העצבית לטווח הארוך היא כלי נוסף ללמוד potentiation וסיוע בתנאים מאוד בשליטה. לטווח ארוך גם שיתוף תרבויות להשאיל את עצמם ללימודים ביוכימיים בתאי עצב בודדים. הצלחה של הכנת שיתוף התרבות מיוחסת לעתים קרובות לתוספת של עד 50% hemolymph Aplysia לתרבויות 17. עם זאת, ההצלחה של גישה זו תלויה לעתים קרובות בהשתנות אצווה לקבוצה של hemolymph זה.
הכנת תרבית התאים ניתקו המתוארת כאן מרחיבה את הרפרטואר של שימוש במודל Aplysia. תרביות תאים ניתקות אינן מתאימות להסקת מעגלים עצביים או לומד סינפסה השלמה כשיטות שהוזכרו לעיל לעשות. יש הכנת תרבית התאים ניתקו השירות הגדול ביותר שלה הבמאשר את קיומו של conductances היוני הספציפי והמאפיינים קינטיים והתרופתיים בניסויים מהדק מתח תא בודדים. Sevזרמים ייחודיים eral התגלו באמצעות הכנות תא בודדות, כולל קטיון מעורר בתאי תיק נוכחי 19 וקולט D--ASP הנוכחי בBSC נוירונים 4. מחקרים על Aplysia לעתים רחוקות להתמקד בזרמים היוניים של תאים בודדים, בין השאר בשל הגודל לעתים קרובות המסורבל של תאים כאלה וקיומם של סוגים רבים אחרים מתאימים מודל סלולרי שלהשאיל את עצמם היטב לתיקון טכניקות מהדק. כתוצאה מכך, קיומם של זרמים מסוימים בAplysia, כגון אלה המופעלים על ידי חומצת אלפא לאמינו-3-הידרוקסיל-5-מתיל-4-isoxazole-פרופיונית (AMPA) בדרך כלל להסיק מבלוק של קולטן AMPA המשוער (R) התנהגויות הקשורות לעל ידי היריבים AMPAR להחיל הכנת העצבים המופחתת, ולא ישירות מוקלטים. לפיכך אימות קיומם של זרמים מסוימים לוקה בחסרה. בידוד של תאי עצב בתרבית ומתודולוגיה glutamatergic מהדק מתח תא הבודד מספק בדיקה ישירה לקיומו שלסוגים שונים של ערוצי L-GluR באורגניזם מודל זה.
שימוש נוסף של הנוירונים Aplysia בניסויים מהדק תיקון תא בודדים הוא בניתוח מפלי שליח שני. נוירונים Aplysia הם מתאימים במיוחד גם למחקרים של אפנון מושרה שליח שני כי הם יציבים לתקופות ארוכות של הקלטה בטמפרטורת חדר 3, 12, 20, 21 , והם חזקים מספיק שניתן לשמור תאים בודדים לאחר הקלטה והקליטו משוב לאחר 24 שעות 5. אשכולות נוירון החושיים buccal וצדר אלה נוח להניב זוג של תרבויות בהתאמה מכל גנגליון, כך שצלחת אחת יכולה להיות מיועדות תרבות שליטה ואילו בן הזוג שלה מקבל טיפול.
יתרון נוסף של התכשיר הוא במחקרים של המעמד המורפולוגי של תאי עצב בודדים. לדוגמה, גילו שגופי תא של הנוירונים Aplysia מחיות מזדקנות היו larגר מאלה מבעלי החיים צעירים, אך לא מפרט תהליכים בתא לאחר מספר ימים ב6 תרבות. הכנות נוירון הבודדות אלה גם להקל על מחקרים בשימוש בצבעים חיוניים כדי להעריך את הרמות של 2 תאיים Ca, pH, מיני חמצן תגובתי, פוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה ותכונות פיסיולוגיות אחרות, כי אז יכול להיות בהשוואה לתכונות neurophysiological של תאים בודדים. בעוד שחלק מהגישות הללו חלות בהכנות שלמות או תרבות משותפת, איסוף נתונים הוא הרבה יותר פשוט באמצעות תאי עצב בודדים במערכת תרבות קלה זה. בעתיד, אנו מקווים להשתמש בתאים אלה לפרופיל מולקולרי של תאים בודדים 13.
התרבות לטווח הקצר ניתקה מספקת חומר אידיאלי לחקר תהליכי neurophysiological יסוד, ועשויה לספק כלי חזק במיוחד כאשר משתמשים בו בשילוב עם מחקרים שכלל מופחתים או הכנות תרבות משותפת. ניתקAplysia נוירון התרבות מרחיבה את השירות של מודל החיה המכובד הזה לתחומים חדשים ומעניינים של מדעי המוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
מומן על ידי NIH P40 OD010952, קרן Korein, אוניברסיטת מיאמי המלגה לSLC ואחוות Maytag לATK. המחברים תודה להכיר את צוות של המשאבים הלאומי לAplysia, כמו גם לורן Simonitis וחנה פק, שסיפק micrographs לדמות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial seawater ASW | Sigma-Aldrich | assorted | (mM): 417 NaCl, 10 KCl, 10 CaCl2 (2 H2O), 5MgCl2 (6H2O), 15 HEPES-NaOH, pH 7.6 |
| Intracellular solution | Sigma | assorted | (mM): 450 KCl, 2.9 CaCl2 (2 H2O), 2.5 MgCl2 (6 H2O), 5 Na2ATP, 10 EGTA, and 40 HEPES-KOH, pH 7.4 |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| penicillin/streptomycin added to ASW at 1:100 | Lonzo Walkersville, Inc. | 17-603E | 5,000 Units/ml penicillin plus 5,000 mg/ml streptomycin |
| Neutral dispase II | Roche Diagnostics | 10165859001 | |
| hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H4272 | |
| collagenase type XI | Sigma-Aldrich | C9407 | |
| L-Glutamate (L-Glu) | Sigma-Aldrich | 49601-100G | |
| D-Aspartate (D-Asp) | Sigma-Aldrich | 11200-10G | |
| N-methyl-D-aspartate (NMDA) | Biomol | 100002-268 | |
| L-Asp | Sigma | A6683-25G | |
| alpha-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid (AMPA) | Sigma | A6816-5MG | |
| L-Glu R antagonists | various | various | |
| agar | |||
| kynurenate | Sigma-Aldrich | 61250 | |
| APV | Sigma-Aldrich | A5282 | |
| DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (NMDAR antagonist) | |||
| 2-propanol | VWRSP | BDH1133 | |
| Chloriding solution | Sigma | assorted | 25 g FeCl3 + 25 ml concentrated HCl + 50 ml H2O |
| Sylgard silicone 2-part polymer | World Precision Instruments (WPI) | SYL184 | Provides pin-out surface for small dissection dishes |
| 0-40x zoom magnification microscope for dissections | Wild | ||
| Techniquip 150 Watts Fiber Optic Illuminator | Microoptics of Florida | TQ FOI-150 | |
| RotoMix 50800 orbital mixer | |||
| Nikon Diaphot inverted phase-contrast microscope with 4x, 20x (optional) & 40x objectives | SR Research Ltd. | Eyelink II | |
| Tektronix digital oscilloscope | SR Research Ltd. | ||
| pClamp 10 data acquisition and analysis software | Molecular Devices | ||
| PC with Windows XP or higher operating system | PC Solutions | Thinkserver with solid state hard drives (80GB) and low noise monitors | |
| Flaming/Brown P87 micropipette puller | Sutter Instruments, Novato, CA | ||
| Axon Instruments Axopatch 200B clamp amplifier with a capacitance compensation range of 1-1000 pF; preamplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ||
| Axon instruments electrode holder assembly for Axopatch 200B preamplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | CV203BU | |
| Digidata 1200 A/D converter | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ||
| Picospritzer, powered by N2 adjustable for pressure and duration | Parker Hannifin, Cleveland, OH | ||
| TMC Micro-G Vibration isolation table | Ametek | ||
| Faraday cage | custom manufacture | ||
| Burleigh Piezoelectric Clamshell Micromanipulators | Burleigh Instruments; Thorlabs | presently PCS-5000; -6000 series + mounts | |
| Narishige M-152 manual manipulators (for perfusion system and picospritzer) | Narishige USA | ||
| Filament pipette glass,1.5 mm OD, 0.84 mm ID - | WPI | 1B150-3 | |
| 3 inch length | |||
| Ag/AgCl half cell | WPI | EP4 | |
| 15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon* Centrifuge Tubes | VWRSP | 21008-918 | |
| Angled Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| Dumostar Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| 35 mm falcon tissue culture dishes | VWRSP | 25382-064 | |
| falcon 150 x 25 mm tissue culture dishes; 1013 | VWRSP | 1013 | also can be made into small dissection dishes with sylgard |
| sylgard | WPI | SYL184 | |
| animal dissection tray | various | ||
| 15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon | VWRSP | 21008-918 | For 6-bore gravity-fed perfusion system |
| Aluminum clips with screw hole ends | hardware store | For perfusion system | |
| 23 gauge needles (manually file off points) | VWRSP | For perfusion system | |
| Polyethylene tubing 0.022"ID x 0.042"OD; 427411 | Becton-Dickinson | For perfusion system | |
| H-7 pipette stand/holder for microcap perfusion array | Narishige USA | For perfusion system | |
| one-way valves | For perfusion system | ||
| Drummond Microcaps 1 μl | VWRSP | For perfusion system | |
| 18 gauge needles for suction (filed off points) | |||
| Polyethylene tubing | Cole Parmer | 4.27436E+11 | |
| fine dissection pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| capillary tubes | Kimble 71900-100 | fire-polished and U-shaped in a Bunsen burner flame and filled with 3% agar in ECS | |
| modeling clay | craft store | ||
| dish holder for microscope stage with isolated ground bath | Custom manufacture | ||
| pasteur pipettes | VWRSP | 14672-412 | |
| pipette bulbs | VWRSP | 53283-911 | |
| acrodisk syringe filters | VWRSP | 28144-040 | |
| thick-walled 1.5 mm diameter borosilicate filament glass | WPI | 1B150F-3 | |
| High purity nitrogen cylinder and bifurcating regulator | |||
Tables 1-3. Lists of Reagents, Materials, and Equipment. |
|||
References
- Buttner, N., Siegelbaum, S. A. Antagonistic modulation of a hyperpolarization-activated Cl(-) current in Aplysia sensory neurons by SCP(B) and FMRFamide. J. Neurophysiol. 90 (2), 586-598 (2003).
- Byrne, J. H., Castellucci, V. F., Kandel, E. R. Contribution of individual mechanoreceptor sensory neurons to defensive gill-withdrawal reflex in Aplysia. J. Neurophysiol. 41 (2), 418-431 (1978).
- Carlson, S. L., Fieber, L. A. Physiological evidence that D-Aspartate activates a current distinct from ionotropic glutamate receptor currents in Aplysia californica. J. Neurophysiol. 106 (4), 1629-1636 (2011).
- Carlson, S. L., Kempsell, A. T., Fieber, L. A. Pharmacological evidence that D-Aspartate activates a current distinct from ionotropic glutamate receptor currents in Aplysia californica. Br. Behav. 2 (4), 391-401 (2012).
- Fieber, L. A. Characterization of Na+ and Ca2+ currents in bag cells of sexually immature Aplysia californica. J. Exp. Biol. 201 (5), 745-754 (1998).
- Fieber, L. .A., Carlson, S. L., Capo, T. R., Schmale, M. C. Changes in D-Aspartate ion currents in the Aplysia nervous system with aging. Br. Res. 1343, 28-36 (2010).
- Glansman, D. L. Habituation in Aplysia: The Cheshire Cat of neurobiology. Neurobiol. Learn. Mem. 92, 147-154 (2009).
- Hawkins, R. D., Abrams, T. W., Carew, T. J., Kandel, E. R. A Cellular Mechanism of Classical Conditioning in Aplysia: Activity-Dependent Amplification of Presynaptic Facilitation. Science, New. 219 (4583), 400-405 (1983).
- Ichinose, M., Sawada, M., Maeno, T., McAdoo, D. J. Effect of acetylcholine on ventrocaudal sensory neurons in the pleural ganglia of Aplysia. Cell Mol. Neurobiol. 9, 233-245 (1989).
- Kandel, E. R. Cellular basis of behavior. , W.H. Freeman. New York. (1976).
- Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialog between nerves and synapses. Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).
- Kupfermann, I., Castellucci, V., Pinsker, H., Kandel, E. Neuronal correlates of habituation and habituation of the gill-withdrawal reflex in Aplysia. Science. 167 (3926), 1743-1745 (1970).
- Magoski, N. S. Regulation of an Aplysia bag-cell neuron cation channel by closely associated protein kinase A and a protein phosphatase. J. Neurosci. 24 (30), 6833-6841 (2004).
- R, E. Neuronal transcriptome of Aplysia: neuronal compartments and circuitry. Cell. 127, 1453-1467 (2006).
- Nick, T. A., Kaczmarek, L. K., Carew, T. J. Ionic currents underlying developmental regulation of repetitive firing in Aplysia bag cell neurons. J. Neurosci. 16 (23), 7583-7598 (1996).
- Single-channel recording. Sakmann, B., Neher, E. , Plenum Press. NY. (1995).
- Tam, A. K., Geiger, J. E., Hung, A. Y., Groten, C. J., Magoski, N. S. Persistent Ca2+ current contributes to a prolonged depolarization in Aplysia bag cell neurons. J. Neurophysiol. 102 (6), 3753-3765 (2009).
- Schacher, S., Proshansky, E. Neurite regeneration by Aplysia neurons in dissociated cell culture: modulation by Aplysia hemolymph and the presence of the initial axonal segment. J. Neurosci. 3 (12), 2403-2413 (1983).
- Walters, E. T., Byrne, J. H., Carew, T. J., Kandel, E. R. Mechanoafferent neurons innervating tail of Aplysia. I. Response properties and synaptic connections. J. Neurophysiol. 50 (6), 1522-1542 (1983).
- Wilson, G. F., Richardson, F. C., Fisher, T. E., Olivera, B. M., Kaczmarek, L. K. Identification and characterization of a Ca(2+)-sensitive nonspecific cation channel underlying prolonged repetitive firing in Aplysia neurons. J. Neurosci. 16 (11), 3661-3671 (1996).
- White, B. H., Nick, T. A., Carew, T. J., Kaczmarek, L. K. Protein kinase C regulates a vesicular class of calcium channels in the bag cell neurons of Aplysia. J. Neurophysiol. 80 (5), 2514-2520 (1998).
- Wilson, G. F., Magoski, N. S., Kaczmarek, L. K. Modulation of a calcium-sensitive nonspecific cation channel by closely associated protein kinase and phosphatase activities. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95 (18), 10938-10943 (1998).
- Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures. J. Vis. Exp. (28), e1355 (2009).
