Summary
Wir beschreiben die Dissektion des Nervensystems der Meeresumwelt Seehasen
Abstract
Die Meeresschnecke Aplysia californica Weichtier hat eine traditionsreiche Geschichte als Modell für die Funktion des Nervensystems, mit besonderer Bedeutung in den Studien von Lernen und Gedächtnis. Die typischen Vorbereitungen für solche Studien sind solche, bei denen die sensorischen und Motoneuronen intakt gelassen werden in einem minimal seziert Tier oder eine technisch aufwendige neuronalen Co-Kultur der einzelnen sensorischen und Motoneuronen. Weniger häufig ist das isolierte neuronale Vorbereitung, in denen kleine Gruppen von Neuronen sind nominell homogen dissoziiert in einzelne Zellen in kurzfristige Kultur. Solche isolierten Zellen sind für die biophysikalischen Charakterisierung Ionenströme mit Patch-Clamp-Techniken, und gezielte Beeinflussung dieser Leitwerte. Ein Protokoll für die Herstellung solcher Kulturen beschrieben. Das Protokoll nutzt die leicht identifizierbaren glutamatergen sensorischen Neuronen des Pleura-und Buccalganglien, und beschreibt deren Dissoziation und minimale Wartung in Kultur für mehrere Tage ohne Serum.
Introduction
Die marine opistobranch Weichtier, Aplysia, ist ein nützliches neurobiologischen Modell für viele Jahrzehnte. Es ist am besten als ein Modell der Gewöhnung und klassische Konditionierung 7, 8 bekannt. Studien über Lernen und Gedächtnis in diesem Modell gewann den Nobelpreis für Physiologie oder Medizin im Jahr 2000 für Eric R. Kandel, in einem Preis, den er mit Arvid Carlsson und Paul Greengard 10 geteilt. Studien mit elektrischen Aufnahmen von reduzierten Zubereitungen, in denen Elemente des Nervensystems des wirbellosen aus dem Tier seziert Nerven und Muskeln belassen wird, haben dazu beigetragen, erläutern die Rollen der einzelnen Neuronen in Aplysia. Identifizierung der genauen molekularen Mechanismen, die das Lernen in Aplysia bilden aber oft eine andere Technik eingesetzt, langfristige Co-Kulturen von einer sensorischen Neuronen und Motoneuronen, erhalten eine nach der anderen von den einzelnen Tieren und Spender erlaubt, eine Synapse in der Kulturschale 21 bilden .
Wir und andere 1, 3, 6, 14, 15, 16 haben die Leichtigkeit, mit der Neuronen in diesem Modell kann gezielt sowie ihre Ausdauer werden in langfristige Experimente dissoziiert kurzfristig Kulturen von Clustern aus nominell homogenen Neuronen identifiziert machen genutzt in denen wir studieren Ionenströme unter Voltage-Clamp in der Patch-Clamp-Konfiguration. Viele Aplysia aufstehen, um wiederholte Runden der Patch-Clamp-Zeit für dauerhafte experimentelle Manipulationen zu ermöglichen. Das Verfahren ist nützlich für die Neuronen wie die neurosecretory Tasche Zellen des Abdominalganglion und der sensorischen Neuronen der Pleura und Buccalganglien deren Dissoziation hier beschriebenen, nicht aber für sehr große Neuronen> 60 um Durchmesser, wie L7 oder R2 die Abdominalganglion. Wir beschäftigen keine Aplysia Serum in unseren Kulturen, im Gegensatz zu den sensorisch-Motoneuronen Co-Kulturen an anderer Stelle beschrieben. Die meisten Neuronen erhalten mit diesem Verfahren wird ohne Prozesse für ter zunächst 48 h in Kultur, Erleichterung ganze Zelle Spannung Aufnahme, aber dann sprießen und erarbeiten Axone und andere Prozesse für etwa 14 Tage vor dem Sterben aus Mangel an Nährstoffen und / oder Wachstumsfaktoren.
Diese Technik erzeugt primären Kulturen von 50-100 Neuronen pro Schale aus physiologisch dokumentiert Regionen der bukkalen und Pleuralganglien. Dieses Protokoll ist für die Forscher studieren Aspekte der einzelnen Zelle Physiologie in Experimenten, die zahlreiche Experimentwiederholungen pro Tier erforderlich. Es entsteht ein passendes Paar von Kulturen aufgrund der anatomischen Trennung der Zielzellen in linke und rechte hemiganglia, ermöglicht Untersuchungen, die Nutzen aus abgestimmten Behandlung und Kontrollkulturen.
Das Protokoll zielt bukkalen S-Cluster (BSC) Neuronen des Ganglion bukkalen und Pleura ventrokaudal (PVC) Neuronen des Ganglion Pleura. Diese Zellen sind eine geeignete Größe für die gesamte Zellspannung Aufnahmen und Display robust glutamatergen Antworten. Die diskutierten Methodik ist für die meisten Ganglien in der Aplysia Nervensystem.
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Protocol
1. Zellpräparation
- Am Tag 1, wiegen und betäuben Tier.
- Wiegen eine 30 g-1 kg Tier. Anesthetize in 5-10 Tier Volumen von 1:1 Meerwasser: isotonische MgCl. 6H 2 0 1 h mit Belüftung wie eine elektrische Luftpumpe Aquarium mit angeschlossenem airstone.
- Bereiten Dissektion liefert.
- Montieren sauber Dissektion Tablett mit Edelstahl Stecknadeln, wie Stoff-Pins. Montieren Sie mehrere Petrischalen mit künstlichem Meerwasser (ASW, siehe Tabellen 1 und 3) + Penicillin / Streptomycin (P / S).
- Haben Sie bereit eine Low-Power-Mikroskop. Haben sauber Dissektionsinstrumente bereit, wie z. B. gerippte Nase und feine chirurgische Pinzette und feine und große chirurgische Schere. Sprühen Sie die Geräte mit 70% Isopropylalkohol vor der Verwendung und trocknen lassen.
- Position Tier auf Dissektion Fach.
- Position Tier Bauchseite nach unten in der Präparation Fach. Pin Tierdurch Kanten des Körpers Wand und parapodial Grenzen, aber vermeiden Schwanz und Kopf, um die dorsale Oberfläche freizulegen und den Genitalbereich Nut
- Spülen Sie die Dorsalfläche in langsam laufenden kaltem Leitungswasser. Tragen Sie eine dünne Strom von 70% Isopropylalkohol von einem Squeeze-Flasche entlang der genitalen Nut und über die Oberseite des Kopfes.
- Machen Sie den ersten Schnitt.
- Mit einem Low-Power-Mikroskop (siehe Tabelle 2) und das reflektierte Licht auf den Punkt, wo die genitale Nut stammt aus der vorderen Schale Marge beobachten, straff mit gerippten Nase-Zange eine Falte des Gewebes auf der linken Seite dieser Herkunft zu halten, während eine flache snipping Hole Alle den Weg durch die glatte, ebene Fläche des Körpers Wand gleich rechts von der genitalen Nut mit feinen abgewinkelte Schere.
- Hämolymphe beobachtet werden, um aus dem Loch gießen, manchmal mit sich trägt, die Abdominalganglion und Magen.
- Erweitern Sie den Einschnitt.
- Verwenden Sie große Schere th erweiterne Einschnitt vorne zu einem Punkt zwischen den Rhinophoren, um beim Ziehen nach oben mit dem unteren Messer zu vermeiden nicking den Darm. Die inneren Organe werden beobachtet zu verschütten aus dem Einschnitt werden.
- Entfernen Sie den Ganglien.
- Positionieren Sie das Fach, und konzentrieren das Mikroskop auf den Kopfbereich.
- Mit sauberen Pinzette und einer feinen Schere, entfernen Sie den Kopf Ganglien durch Abtrennen an einem Punkt die Nerven, die den Kopf Ganglien bilden in einem Ring um die Speiseröhre zu Pleura-Pedal und Cerebralganglien als Gruppe zu entfernen.
- Entfernen Sie die bukkale Ganglion, das der Bauchseite des Ösophagus hält.
- Entfernen Sie die Abdominalganglion indem die 4 großen Nerv Konnektive dass Problem von diesem Ganglion.
- Isolieren Ganglien des Interesses.
- Trim Kopf Ganglien auseinander, so dass eine Länge von Verknüpfungen an jedem Ganglion von Interesse, die in Höhe von mindestens dem Durchmesser des Ganglion ist, dies wird über verzögern Enzym-Verdauungvon den Zellen von Interesse in dem nächsten Schritt.
- Setzen Sie jedes Ziel Ganglion durch 2 Spülungen ASW + P / S, die sich zwischen Spülungen mit sauberen Pinzette.
- Wenn gezielt die PVC Zellen, lassen Sie den rechten Pleura hemiganglion an das rechte Pedal hemiganglion, und in ähnlicher Weise lassen Sie die linke Pleura hemiganglion an der linken Pedal hemiganglion.
- Entsorgen Sie unerwünschte Ganglien und den Rest des Tieres nach akzeptierten Forschungspraxis.
- Enzymatisch verdauen die Ganglien.
- Für jedes Ganglion Herstellung von 1 ml Enzymlösung, bestehend aus 3,75 mg Dispase, 1 mg Hyaluronidase und 0,3 g Collagenase Typ XI pro ml ASW + P / S in einem 15 ml konischen Röhrchen aus Polypropylen.
- Platz gespült Ganglien in Enzymlösung und befestigen Sie den Deckel fest. Legen Sie das Rohr auf seiner Seite auf einem Schüttler (siehe Tabelle 2) bei niedriger Geschwindigkeit für 13-5 h über Nacht bei ca. 23 ° C (Raumtemperatur).
- Bereiten Sie dasKulturschalen.
- Vor Mikrodissektion (Tag 2), bereiten Poly-D-Lysin (PDL)-beschichteten Kulturschalen in einer Gewebekultur Kapuze. In ~ 0,5 ml PDL (0,2 mg / ml sterilem Wasser) in die Mitte eines 35-mm-Schale für ~ 25 min.
- Spülen PDL 3x mit sterilem Wasser. Trocknen lassen. UV-Sterilisation der Platten.
- Tag 2 Isolieren Neuronen.
- Füllen Sie das Zentrum von 35 mm Gerichte, die PDL-beschichteten und UV mit ca. 0,5 ml ASW + P / S sterilisiert, um eine Insel der Medien innerhalb der ansonsten trockenen Gericht zu schaffen waren. Dies kann auf der Bank durchgeführt werden, außerhalb der Gewebekulturabzug. Ein Gericht sollte für jede Zelle, die von einem Cluster hemiganglion hergestellt werden.
- Haben Sie bereit eine 100 mm Durchmesser Dissektion Gericht durch Sylgard-Beschichtung und Härten einer 5 mm tiefen Dissektion Oberfläche, mit feinen Sezierung Pins von mehreren Größen als Stifte und Sonden verwendet werden (siehe Tabelle 3) ausgestattet. Spülen Sie dieses Gericht mit 70% Isopropylalkohol, dann mit ASW + P / S, und schließlich fill sie mit ASW + P / S.
- Bereiten Mikrodissektion verdaut Ganglien.
- Gießen Sie die Lösung, die das Enzym verdaut Pleura-Pedal und Buccalganglien in die Dissektion Gericht.
- Legen Sie die Schüssel auf dem Tisch des Mikroskops gegen eine schwarze Fläche unter reflektierte Licht.
- Mit dem beigefügten Bindegewebe, festzunageln jedes Pleura-Pedal hemiganglion dorsalen Seite nach oben. Die Gewebe wird weich und intolerant von Stretching.
- Microdissect PVC Neuronen.
- Mit 2 Paar sauberen feinen Pinzette, und hält einen feinen Sezierung Stift in eine Pinzette als Sonde, isolieren die Zellen aus einem PVC Pleura hemiganglion. Enzyme Verdauung wird entfernt haben oder neben das Bindegewebe Mantel für den PVC-Cluster gebrochen, aber die Zellen aneinander haften.
- Verwenden Sie die Sonde, um diese Zellen aus dem Pedal-Pleura Binde 18 lösen, dann lassen Sie die Zelle Cluster fallen auf den Boden der DissektionGericht.
- Übertragen Neuronen Kulturschale.
- Übertragen Sie die Zelle Cluster auf eine vorbereitete 35 mm Kulturschale durch leichtes Ansaugen der Cluster in der Spitze eines leicht feuerpolierten Einweg-Glas-Pasteur-Pipette, dann Abgeben es langsam in den Medien Insel in einer Kulturschale, wobei darauf zu vermeiden Einführung Luftblasen in die Pipette. Wiederholen Sie die Isolierung des PVC-Cluster der anderen hemiganglion und in einen separaten Kulturschale.
- Microdissect und übertragen BSC Neuronen.
- Merken Sie sich die bukkalen Ganglion Bauchseite up, mit Sorgfalt, um die Zellen von Interesse zu ersparen. Wiederholen Sie Schritt 2 1.12 mit den BSC Zellhaufen der bukkalen Ganglion 10.
- Isolation von PVC und BSC Neuronen produzieren 4 Kulturschalen mit Neuronencluster: 2 Schalen mit BSC-Cluster und 2 Schalen mit PVC-Clustern. Entsorgen Sie den Rest der Ganglien und beiseite stellen die 100 mm Dissektion Gericht.
- Dissociate die Zellhaufen.
- Legen Sie eine Kulturschale mit Zellen auf der Stufe der Low-Power-Mikroskop und den Deckel abnehmen.
- Dissociate die PVC-Cluster durch leichtes Ausklopfen den Boden der Kulturschale neben dem Zellverband mit einem feinen Stift in Dissektion Zange gehalten. Flicking gräbt die Spitze des Stiftes in den Kunststoff der Boden der Schale als versuchte heraus zu graben ein Fleck aus Kunststoff. Wenn die Reibung mit dem Kunststoff der Stift Punkt gibt, wird eine Stoßwelle durch das Medium, die auseinander bricht die Nähe Klumpen von Zellen produziert.
- 5-10 Flicks erforderlich sein, um fast vollständig distanzieren die Zellen werden, aber es ist besser, kleine Gruppen von Zellen eher verlassen als zu viel streichen damit die Zellen durch mechanische schiere zerstört werden.
- Deckel aufsetzen und wiederholen mit anderen Kulturschalen.
- Bewahren Zellkulturen.
- Legen Sie die Kulturschalen mit Medien Inseln in ihren Zentren mit dissoziierten Zellen inein großer Container, der Luftzirkulation, zB ein 150 x 25 mm rund Kunststoff-Petrischale erlaubt, und legen Sie dieses Gericht in einem Inkubator-Set bis 17 ° C.
- Installieren Sie in der Kammer eine offene Schale mit Wasser als Quelle von Feuchtigkeit. Lassen Sie über Nacht ungestört. Die Zellen werden auf die Poly-D-Lysin-Beschichtung in der Mitte der Schale zu halten.
- Flood Kulturschalen.
- Am Tag 3, vorsichtig überschwemmen die Gerichte mit 2,5 ml ASW + P / S. Untersuchen und zählen Sie die Zellen mit einem inversen Mikroskop Zellkultur. Shop in der 17 ° C-Inkubator.
2. Elektrophysiologie
Die Methode ist Standard Patch-Clamp-das hat in zahlreichen Texten beschrieben worden (z. B. Sakmann und Neher, 1995) 16. Dieses Protokoll wird auf Zellen arbeiten ≤ 100 pF Kapazität oder Zellen <60 Mikrometer Durchmesser während der Tage 3 und 4 des Protokolls. Zellen ohne Prozesse sind optimal für die Aufnahme. Die folgenden speziellen PRÜFUNGIonen gelten:
- Größere Zellen können mit der Konfiguration Einstellung auf dem Axopatch 200B Verstärker auf β = 0,1 untergebracht werden. Aktivierung sehr große Ströme verursachen Zellen Spannungsklemme entkommen. ASW Lösungen für Salzgehalt substituiert (z. B. ein Bruchteil des NaCl mit undurchlässigen N-methyl-D-Glucamin Chlorid substituiert ist) verwendet werden, um Gesamtzellstrom Amplitude zu reduzieren.
- Fasergefüllte Borosilikatglas Patch-Pipetten auf einer Pipette Abzieher gezogen und auf halbem Weg mit intrazellulären Lösung (ICS), bestehend aus 450 mM KCl und andere Salze (siehe Tabelle 1) verfüllt sind geeignet und sollte Widerstand von ca. 0,5-1 MOhm haben. Wenn Isolierung spezifischer Ionenströme erwünscht ist, beispielsweise Na +-Ströme in Abwesenheit von K Ströme, K + in dieser Lösung mit anderen Ionen, wie Cs + ersetzt werden. Cl - Austausch von ICS mit einem impermeant Anion ist auch dann gerechtfertigt, wenn eine natürliche ICS erwünscht9.
- Die Zellen sind mit> 1 hr-lange Aufnahmen möglich bei Raumtemperatur stabil. Die Aufnahme ist optimal an den Tagen 3 und 4 des Protokolls, entsprechend 24-48 h in Kultur. Nach 48 Stunden gibt es Schwierigkeiten bilden Gigaohm Dichtungen, vielleicht wegen der Ausarbeitung eines Glykokalyx auf der Zelloberfläche und Raum Klemme Probleme Prozess Auswuchs verursacht. Die Zellen sind nützlich, aber für nicht-Patch-Clamp-Untersuchungen wie Toxikologie, die bei <14 d abgeschlossen werden kann.
- ASW und andere Lösungen von der Schwerkraft Lösung Gerät verzichtet werden, sowie intrazelluläre Lösung sollte durch eine Spritze gefiltert werden montiert 0,2 um Acrodisk Filter (Tabelle 3), um feine Partikel, die mit Gigaohm Dichtung Bildung stören zu beseitigen.
- Desensibilisierung tritt bei der Verwendung von Agonisten, wie zB D-Aspartat (D-Asp), deshalb ~ 1-2 min zwischen Anwendungen von Agonisten empfohlen. Umgekehrt wird oft mit schnellen Potenzierung wiederholt Anwendung beobachtetKation-Agonisten, wie L-Glutamat (L-Glu).
- Agonist aktiviert Ströme wie L-Glu durch Anlegen Agonisten mit der Pipette Picospritzer untersucht werden. Diese Pipette ist der gleiche wie der Patch-Pipette gezogen und enthält Agonist in ASW. Wenn die Spitze dieser Pipette ist unterhalb der Abflussleitung der Schwerkraft Lösung positioniert und in einem 45 ° Winkel von der Abflussleitung (2F), Agonisten schnell weggewaschen werden aus der Zelle und Desensibilisierung minimiert. Der Agonist Pipette schaffen einen Winkel von 90 ° oder mehr relativ zu der Patch-Pipette.
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Representative Results
Die Positionen der sensorischen Neuronen im Ganglien, die in diesem Protokoll ausgerichtet sind, sind die BSC und PVC Neuronen in Abbildung 1 dargestellt. Die BSC Neuronen in 2 symmetrische oval Cluster auf der Bauchseite des bukkalen Ganglion, die Oberfläche, die abgewandt von der bukkalen Masse im intakten Ganglion (1A) angeordnet ist. Die PVC Neuronen bilden bilateralen, V-förmigen Cluster, die sich um die dorsale Oberfläche der Pleura Ganglion in Richtung der Mittelachse (1B). Diese sensorischen Neuronen haben den Vorteil einer stereotypen Stelle innerhalb der Ganglien, obwohl die rechte oder linke Cluster in einzelnen Tieren fehlt bei ca. 1% der Vorkommen. Die BSC und PVC Neuronencluster können durch den dunkelorange Farbe der Zellmembran und relativ geringen Größe im Vergleich zu den umliegenden Zellen, wie in dem großen Kreis Umriss 1A gezeigt.
In der Kultur, dieseNeuronen sind oft ohne Prozesse der Tag nach der Beschichtung (2A) und sind ideal für Patch-Clamp an diesem Tag, und einen Tag später. Manchmal ist es möglich, ausreichend Platz Klammer erreichen, selbst wenn die Zellen zu verarbeiten Auswuchs (2F) zu haben scheinen, was darauf hindeutet, dass nicht alle Keime, die wahrscheinlich aus dem Zellkörper ausgehen, ist ein Teil der Zelle. Falls beim Umgang nach enzymatischer Verdauung war sanft, ankommen Zellen in Kultur mit einigen Prozesse intakt, und diese Prozesse wachsen mit der Zeit (2B-2E). Solche Zellen sind nicht für Patch-Clamp-geeignet, aber intrazelluläre Aufnahme möglich ist.
Whole cell Patch-Clamp-Ströme von spannungsgesteuerten Na + und Ca 2 + durchgeführt werden leicht aus PVC und BSC Neuronen in kurzfristige Kultur 6 aufgezeichnet und beide Zelltypen zeigen eine gemischte K aktuellen. BSC Neuronen auch Acetylcholin, Serotonin und NMDA 4 (3C antworten) Mit anregenden Ströme, während beide BSC und PVC Neuronen L-Glu-Asp und D 3 (3A und 3B) reagieren mit anregenden Strömen. Die pharmakologischen Eigenschaften von L-Glu-und D-Asp-induzierten Strömen in diesen Neuronen wurden 4 beschrieben.
Abbildung 1. Mikroaufnahmen, welche die Position der glutamatergen sensorischen Neuronen der bukkalen und Pleuralganglien (rote Kreise). A. Die bukkalen S-Cluster (BSC) Neuronen, erkennbar durch ihre dunkle Farbe orange (großer Kreis auf der linken hemiganglion) und der entsprechenden Position in der rechts hemiganglion (kleinere Kreise). B. V-förmig, dunkelorange Pleura ventrokaudal (PVC) Zellencluster des rechten Pleura hemiganglion (links hemiganglion nicht gezeigt).
Abbildung 2. Mikroaufnahmen der glutamatergen sensorischen Neuronen in Kultur A. Zellen aus dem PVC-Cluster 24 Stunden nach der Beschichtung in Kulturschale zeigt 2 sensorischen Neuronen und anderen Zellen;. Andere PVC Zellen aus getrennten Kulturen nach 24 Stunden werden als Einsätze gezeigt B, C.. Ein BSC Neuron in Kultur bei 24 Stunden und demselben Neuron in 96 Stunden auf. D, E. A PVC Neuron in Kultur bei 24 Stunden und das gleiche Neuron bei 96 Stunden, beziehungsweise. F. A PVC Neuron bei 48 h in eine Patch-Clamp-Experiment. Die Patch-Pipette Inkontaktbringen der Zelle von der rechten Kante, während die Picospritzer Pipette ist an der Unterseite. Die großen dunklen Schatten sichtbar auf der linken Seite der Zelle ist die Eröffnung des strömenden Bad Pipette. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3. Glutamaterge Ströme in Ganzzell Patch-Clamp-Aufnahmen von BSC und PVC Neuronen. A. Ganzzell-Strom in einem BSC Neurons in Reaktion auf den Druck-Anwendung von L-Glu (1 mM, 100 ms). B. Ganzzell-Strom in einem Neuron in PVC Auf Druck Anwendung von D-Asp (1 mM, 100 ms). C. Ganzzell NMDA Strom in der gleichen Zelle wie in BSC-A (1 mM, 100 ms).
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Discussion
Die Dissoziation hier beschriebenen Techniken ergeben sensorischen Neuronen Kulturen mit 50-100 isolierten Neuronen mit einer kleinen Anzahl von Gliazellen und anderen nicht identifizierten Zellen durchsetzt. Die wichtigsten Schritte in dem Protokoll sind die Zeit die Ganglien in Enzym Lösung bleiben, und schnippen, die Dissoziation der verdauten Zellhaufen auseinander zu brechen das Cluster in einzelne Zellen. Enzyme Verdauung (Schritt 1.8) muss bei der Temperatur zur Verfügung optimiert werden. Bei 23 ° C unter langsamem Schütteln, 13 h ausreichend für die Verdauung der BSC Cluster while15 hr ist optimal für PVC-Clustern. Low Zellausbeuten in der Kulturschale kann nicht ausreichend Zeit in Enzyms zurückzuführen ist, oder zu viel mechanische Zerstörung während entweder der Zelle Übertragungsschritt (1.11 und 1.12) oder während dem schlagenden Schritt (1.13). Nichtbeachtung der Zellen zu haften bis zur Kultur Substrat sowie kurze Überleben in Kultur ist in der Regel durch zu viel mechanische Störung. Kontamination der Kulturenren kann auch auftreten, und ist am besten, indem sichergestellt wird, dass die narkotisierten Tier gut gespült, dass die Dissektionsinstrumente sauber sind und dass die Ganglien des Interesses werden durch mehrere Spülungen in ASW + P / S. legte angesprochen Es kann notwendig sein, zu waschen und Alkohol-clean Instrumente zwischen verschiedenen Teilen der Dissektion Prozedur bzw. genügend Instrumente bereit, so daß saubere aus für jeden Schritt verwendet werden kann.
Aplysia neurobiologische Studien werden meist auf reduzierte Zubereitungen, die Nerven Verbindungen zwischen den Neuronen bzw. Nervenzellen und Muskeln 2, 18 erhalten durchgeführt. Diese Präparate erleichtern die Zuordnung der Steuerung von muskulären Prozesse auf bestimmte Neuronen und neuronalen Schaltkreise und ermöglichen auch Studien der Potenzierung und Erleichterung von sich wiederholenden Reflexe. Intact Vorbereitungen sind nicht auf bestimmte Arten von Voltage-Clamp-Protokolle und die Untersuchung der Wirkungen von Agonisten geeignet die schnell desensibilisieren ihre Rezeptoren.
Die langfristigen neuronalen Co-Kultur ist ein zusätzliches Instrument zur Potenzierung und Erleichterung unter sehr kontrollierten Bedingungen zu untersuchen. Langfristige Co-Kulturen eignen sich auch für biochemische Untersuchungen an einzelnen Neuronen. Der Erfolg der Co-Kultur-Zubereitung ist oft der Zusatz von bis zu 50% Aplysia Hämolymphe zu Kulturen 17 zurückgeführt. Doch der Erfolg dieses Ansatzes hängt oft von Charge zu Charge Variabilität dieser Hämolymphe.
Das dissoziierte Zellkulturen Vorbereitung hier beschriebenen erweitert die Nutzung Repertoire der Aplysia-Modell. Dissoziierte Zellkulturen sind nicht geeignet zur Ableitung neuronaler Schaltkreise oder studieren die intakte Synapsen als die oben genannten Methoden zu tun. Das dissoziierte Zellkulturen Vorbereitung hat seinen größten Nutzen bei der Bestätigung der Existenz von spezifischen ionischen Leitfähigkeiten und ihrer kinetischen und pharmakologischen Eigenschaften in einzelnen Zelle Voltage-Clamp-Experimente. SevEral einzigartige Ströme entdeckt worden, mit Einzelzellpräparationen, einschließlich einer exzitatorischen Kationenstrom in Bag-Zellen 19 und der D-Asp-Rezeptor-Strom in BSC Neuronen 4. Studies on Aplysia selten auf die Ionenströme der einzelnen Zellen, zum Teil wegen der oft unhandliche Größe solcher Zellen und die Existenz von zahlreichen anderen geeigneten Modell Zelltypen, die sich dafür eignen, gut zu patchen Clamp-Techniken konzentrieren. Als Ergebnis werden die Existenz bestimmter Ströme in Aplysia, wie die von alpha-Amino-3-Hydroxy-5-methyl-4-isoxazol-propionsäure (AMPA) aktiviert üblicherweise Block von mutmaßlichen AMPA-Rezeptor (R) abgeleitete -Verhaltensweisen von AMPAR Antagonisten, die auf die verringerte Nervenpräparat, anstatt direkt aufgezeichnet. So Überprüfung der Existenz von bestimmten Strömungen fehlt. Isolation von kultivierten glutamatergen Neuronen und Einzelzelle Spannungsklemme Methode bietet eine direkte Überprüfung der Existenzverschiedene Arten von L-GluR Kanäle in diesem Modell Organismus.
Eine weitere Verwendung von Aplysia Neuronen in einzelne Zelle Patch-Clamp-Experimente ist in Sezieren second messenger Kaskaden. Aplysia Neuronen sind besonders gut für Untersuchungen der second messenger induzierte Modulation geeignet, weil sie für längere Aufnahme stabil sind bei Raumtemperatur 3, 12, 20, 21 und sind robust genug, dass einzelne Zellen nach der Aufnahme gespeichert werden und aufgezeichnet von wieder nach 24 Stunden 5. Diese bukkalen und Pleura sensorischen Neuronen Cluster bequem ergeben ein Paar abgestimmt Kulturen von jedem Ganglion, so dass ein Gericht eine Kontroll-Kultur bezeichnet werden kann, während seine Gattin eine Behandlung erhält.
Ein zusätzlicher Vorteil dieser Zubereitung ist in Studien der morphologischen Zustand einzelner Neuronen. Zum Beispiel haben wir entdeckt, dass Zellkörper der Neuronen aus Aplysia alternden Tiere waren larger als die von jüngeren Tieren, aber nicht erarbeiten Zellfortsätze nach mehreren Tagen in Kultur 6. Diese isolierten Neuron Vorbereitungen erleichtern auch Studien mit Vitalfarbstoffen auf ein Niveau von intrazellulären Ca +2, pH, reaktive Sauerstoffspezies, Mitochondrienmembranpotential und andere physiologische Merkmale, die dann mit neurophysiologischen Eigenschaften einzelner Zellen verglichen werden können beurteilen. Während einige dieser Ansätze anwendbar in intakten oder Co-Kultur-Präparate sind, ist die Datenerhebung viel einfacher mit isolierten Neuronen in dieser einfachen Kultur-System. In der Zukunft hoffen wir, diese Zellen für einzelne Zelle molekulare Profilierung 13 verwenden.
Das dissoziierte kurzfristig Kultur bietet ideale Material für die Untersuchung grundlegender neurophysiologische Prozesse und kann eine besonders leistungsfähiges Werkzeug zu liefern, wenn in Verbindung mit Studien, die reduziert oder Co-Kultur-Zubereitungen verwendet. Das dissoziierteAplysia Neuron Kultur erweitert den Nutzen dieses ehrwürdigen Tiermodell, um neue und interessante Bereiche der Neurowissenschaften.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Gefördert durch NIH P40 OD010952 die Korein Foundation, einer von der Universität Miami Stipendium für SLC und ein Stipendium für Maytag ATK. Die Autoren danken den Mitarbeitern der nationalen Ressource für Aplysia sowie Lauren Simonitis und Hannah Peck, die Aufnahmen für eine Figur zur Verfügung gestellt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial seawater ASW | Sigma-Aldrich | assorted | (mM): 417 NaCl, 10 KCl, 10 CaCl2 (2 H2O), 5MgCl2 (6H2O), 15 HEPES-NaOH, pH 7.6 |
| Intracellular solution | Sigma | assorted | (mM): 450 KCl, 2.9 CaCl2 (2 H2O), 2.5 MgCl2 (6 H2O), 5 Na2ATP, 10 EGTA, and 40 HEPES-KOH, pH 7.4 |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| penicillin/streptomycin added to ASW at 1:100 | Lonzo Walkersville, Inc. | 17-603E | 5,000 Units/ml penicillin plus 5,000 mg/ml streptomycin |
| Neutral dispase II | Roche Diagnostics | 10165859001 | |
| hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H4272 | |
| collagenase type XI | Sigma-Aldrich | C9407 | |
| L-Glutamate (L-Glu) | Sigma-Aldrich | 49601-100G | |
| D-Aspartate (D-Asp) | Sigma-Aldrich | 11200-10G | |
| N-methyl-D-aspartate (NMDA) | Biomol | 100002-268 | |
| L-Asp | Sigma | A6683-25G | |
| alpha-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid (AMPA) | Sigma | A6816-5MG | |
| L-Glu R antagonists | various | various | |
| agar | |||
| kynurenate | Sigma-Aldrich | 61250 | |
| APV | Sigma-Aldrich | A5282 | |
| DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (NMDAR antagonist) | |||
| 2-propanol | VWRSP | BDH1133 | |
| Chloriding solution | Sigma | assorted | 25 g FeCl3 + 25 ml concentrated HCl + 50 ml H2O |
| Sylgard silicone 2-part polymer | World Precision Instruments (WPI) | SYL184 | Provides pin-out surface for small dissection dishes |
| 0-40x zoom magnification microscope for dissections | Wild | ||
| Techniquip 150 Watts Fiber Optic Illuminator | Microoptics of Florida | TQ FOI-150 | |
| RotoMix 50800 orbital mixer | |||
| Nikon Diaphot inverted phase-contrast microscope with 4x, 20x (optional) & 40x objectives | SR Research Ltd. | Eyelink II | |
| Tektronix digital oscilloscope | SR Research Ltd. | ||
| pClamp 10 data acquisition and analysis software | Molecular Devices | ||
| PC with Windows XP or higher operating system | PC Solutions | Thinkserver with solid state hard drives (80GB) and low noise monitors | |
| Flaming/Brown P87 micropipette puller | Sutter Instruments, Novato, CA | ||
| Axon Instruments Axopatch 200B clamp amplifier with a capacitance compensation range of 1-1000 pF; preamplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ||
| Axon instruments electrode holder assembly for Axopatch 200B preamplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | CV203BU | |
| Digidata 1200 A/D converter | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ||
| Picospritzer, powered by N2 adjustable for pressure and duration | Parker Hannifin, Cleveland, OH | ||
| TMC Micro-G Vibration isolation table | Ametek | ||
| Faraday cage | custom manufacture | ||
| Burleigh Piezoelectric Clamshell Micromanipulators | Burleigh Instruments; Thorlabs | presently PCS-5000; -6000 series + mounts | |
| Narishige M-152 manual manipulators (for perfusion system and picospritzer) | Narishige USA | ||
| Filament pipette glass,1.5 mm OD, 0.84 mm ID - | WPI | 1B150-3 | |
| 3 inch length | |||
| Ag/AgCl half cell | WPI | EP4 | |
| 15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon* Centrifuge Tubes | VWRSP | 21008-918 | |
| Angled Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| Dumostar Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| 35 mm falcon tissue culture dishes | VWRSP | 25382-064 | |
| falcon 150 x 25 mm tissue culture dishes; 1013 | VWRSP | 1013 | also can be made into small dissection dishes with sylgard |
| sylgard | WPI | SYL184 | |
| animal dissection tray | various | ||
| 15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon | VWRSP | 21008-918 | For 6-bore gravity-fed perfusion system |
| Aluminum clips with screw hole ends | hardware store | For perfusion system | |
| 23 gauge needles (manually file off points) | VWRSP | For perfusion system | |
| Polyethylene tubing 0.022"ID x 0.042"OD; 427411 | Becton-Dickinson | For perfusion system | |
| H-7 pipette stand/holder for microcap perfusion array | Narishige USA | For perfusion system | |
| one-way valves | For perfusion system | ||
| Drummond Microcaps 1 μl | VWRSP | For perfusion system | |
| 18 gauge needles for suction (filed off points) | |||
| Polyethylene tubing | Cole Parmer | 4.27436E+11 | |
| fine dissection pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| capillary tubes | Kimble 71900-100 | fire-polished and U-shaped in a Bunsen burner flame and filled with 3% agar in ECS | |
| modeling clay | craft store | ||
| dish holder for microscope stage with isolated ground bath | Custom manufacture | ||
| pasteur pipettes | VWRSP | 14672-412 | |
| pipette bulbs | VWRSP | 53283-911 | |
| acrodisk syringe filters | VWRSP | 28144-040 | |
| thick-walled 1.5 mm diameter borosilicate filament glass | WPI | 1B150F-3 | |
| High purity nitrogen cylinder and bifurcating regulator | |||
Tables 1-3. Lists of Reagents, Materials, and Equipment. |
|||
References
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