Summary
Descriviamo la dissezione del sistema nervoso della marina mare lepre
Abstract
La marina Aplysia californica mollusco gasteropode ha una storia venerabile come un modello di funzione del sistema nervoso, con particolare rilievo negli studi di apprendimento e memoria. Le preparazioni tipiche per questo tipo di studi sono quelli in cui la sensoriali e motoneuroni sono lasciati intatti in un animale minimamente sezionato, o di un elaborato tecnico neuronale co-coltura di sensoriale individuale e motoneuroni. Meno comune è l'isolato preparazione neuronale in cui piccoli gruppi di neuroni nominalmente omogenee sono dissociate in singole cellule in coltura a breve termine. Tali cellule isolate sono utili per la caratterizzazione biofisica di correnti ioniche con tecniche di patch clamp, e modulazione mirato di questi conduttanze. Un protocollo per la preparazione di tali colture è descritto. Il protocollo sfrutta le facilmente identificabili neuroni sensoriali glutammatergiche dei gangli pleurico e buccale, e descrive la loro dissociazione e la manutenzione minima in coltura per diversi giorni senza siero.
Introduction
Il mollusco opistobranch marino, Aplysia, è stato un modello neurobiologico utile per molti decenni. E 'meglio conosciuto come modello di assuefazione e di condizionamento classico 7, 8. Gli studi sull'apprendimento e la memoria in questo modello ha vinto il premio Nobel per la fisiologia o la medicina nel 2000 per Eric R. Kandel, in un premio che divideva con Arvid Carlsson e Paul Greengard 10. Gli studi che coinvolgono registrazioni elettriche da preparativi ridotti, in cui gli elementi del sistema nervoso di questo invertebrato sono sezionati dall'animale con nervi e muscoli che si trovino, hanno contribuito a chiarire i ruoli dei singoli neuroni in Aplysia. Identificazione dei meccanismi molecolari precisi che costituiscono l'apprendimento in Aplysia però, spesso utilizzato un'altra tecnica, a lungo termine co-colture di un neurone sensoriale e di un motoneurone, ottenuto uno per uno dai singoli animali donatori e ha permesso di formare una sinapsi nel piatto cultura 21 .
Noi e altri 1, 3, 6, 14, 15, 16, abbiamo sfruttato la facilità con cui identificare i neuroni possono essere mirati in questo modello, così come la loro resistenza in esperimenti a lungo termine per rendere le culture a breve termine dissociate di gruppi di neuroni nominalmente omogenee in cui studiarne correnti ioniche sotto voltage clamp nella configurazione di patch clamp. Molti neuroni Aplysia resistono a ripetuti cicli di patch di bloccaggio per consentire il tempo per le manipolazioni sperimentali di lunga durata. La tecnica è utile per i neuroni, come le cellule del sacchetto neurosecretory del ganglio addominale, ei neuroni sensoriali dei gangli pleurico e buccali cui dissociazione descriviamo qui, ma non per molto grandi neuroni> 60 micron di diametro, come L7 o R2 di il ganglio addominale. Noi non utilizziamo Aplysia siero nelle nostre culture, a differenza dei sensori-motoneurone co-culture descritte altrove. La maggior parte dei neuroni ottenuti con questa procedura sono senza processi per tegli prima 48 ore di cultura, facilitando intera registrazione tensione di cella, ma poi germogliare e elaborare assoni e di altri processi per circa 14 giorni prima di morire per mancanza di nutrienti e / o fattori di crescita.
Questa tecnica produce colture primarie di neuroni per 50-100 piatto da regioni fisiologicamente documentate dei gangli buccale e della pleura. Questo protocollo è utile per i ricercatori che studiano gli aspetti della singola fisiologia cellulare in esperimenti che richiedono numerosi sperimentale repliche per animale. Si produce una coppia di culture dovute alla separazione anatomica delle cellule bersaglio in hemiganglia destra e sinistra, permettendo studi che beneficio dal trattamento accoppiati e colture di controllo.
Il protocollo mira buccali S a grappolo (BSC) neuroni del ganglio buccale e pleuriche ventrocaudal (PVC) neuroni del ganglio pleurico. Queste cellule sono in una dimensione appropriata per intere registrazioni di tensione delle cellule e ROBUS visualizzazionet risposte glutamatergiche. La metodologia discusso è appropriato per la maggior gangli del sistema nervoso Aplysia.
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Protocol
1. Preparazione delle cellule
- Il giorno 1, pesare e anestetizzare animali.
- Pesare 30 g-1 kg di animale. Anestetizzare in 5-10 volumi di animali di acqua di mare: 01:01 MgCl isotonica. 6H 2 0 per 1 ora con aerazione ad esempio una pompa di aria dell'acquario elettrica con airstone allegata.
- Preparare forniture di dissezione.
- Assemblare vassoio dissezione pulita con perni diritti inox quali spine tessuto. Assemblare diverse piastre di Petri contenenti acqua di mare artificiale (ASW; vedi tabelle 1 e 3) + penicillina / streptomicina (P / S).
- Avere pronto un microscopio a bassa potenza. Avere gli strumenti di dissezione pulita pronta, come ad esempio il naso a coste e una pinza sottile chirurgici, e fine e grandi forbici chirurgiche. Spruzzare gli strumenti con il 70% di alcol isopropol prima dell'uso e lasciare asciugare.
- Posizione animale sul vassoio dissezione.
- Posizione animale lato ventrale verso il basso nel vassoio dissezione. Animale Pinattraverso bordi della parete del corpo e confini parapodial, ma evitare la coda e la testa, per esporre la superficie dorsale e il solco genitale
- Sciacquare la superficie dorsale in acqua fredda con esecuzione lenta. Applicare un leggero flusso di 70% di alcol isopropol da una bottiglia di compressione lungo la scanalatura genitale e sopra la parte superiore della testa.
- Fai l'incisione iniziale.
- Utilizzando un microscopio a bassa potenza (vedere Tabella 2) e riflessa per osservare il punto in cui la scanalatura genitale origina dal margine anteriore guscio, teso tenere con una pinza Poly-naso una piega di tessuto a sinistra di questa origine, mentre snipping un superficiale Hole il percorso attraverso il liscio, zona pianeggiante della parete del corpo appena a destra della scanalatura genitale con sottili forbici angolate.
- Emolinfa deve essere osservato per versare dal foro, talvolta portando con sé il ganglio addominale e stomaco.
- Espandere l'incisione.
- Utilizzare forbici grandi per espandere °incisione e anteriormente ad un punto tra le rhinophores, mentre si tira verso l'alto con la lama inferiore per evitare intaccare l'intestino. Gli organi interni saranno osservate per fuoriuscire l'incisione.
- Rimuovere i gangli.
- Riposizionare il vassoio e rimettere a fuoco il microscopio sulla regione della testa.
- Utilizzando pinze pulite e forbici sottili, togliere i gangli testa da troncare a un certo punto i nervi che costituiscono i gangli testa in un anello intorno all'esofago per rimuovere pleurico-pedale e cerebrale gangli come gruppo.
- Rimuovere il ganglio buccale che aderisce al lato ventrale dell'esofago.
- Rimuovere il ganglio addominale tagliando le 4 grandi connettivi nervosi che emettono da questo ganglio.
- Isolare gangli di interesse.
- Tagliare testa gangli a parte, lasciando una lunghezza dei connettivi collegati a ciascun ganglio di interesse che è pari ad almeno il diametro del ganglio, questo ritarderà enzima sopra-digestionedelle cellule di interesse nella fase successiva.
- Mettere ogni ganglio obiettivo attraverso 2 risciacqui di ASW + P / S, muovendosi tra risciacqui con pinzette pulite.
- Se il targeting delle cellule del PVC, lasciare il giusto hemiganglion pleurico collegato al diritto hemiganglion pedale, e allo stesso modo lasciare il hemiganglion pleurico sinistro attaccato al pedale hemiganglion sinistra.
- Scartare gangli indesiderati e il resto dell'animale secondo la prassi di ricerca accettato.
- Enzimaticamente digerire i gangli.
- Per ciascun ganglio, preparare 1 ml di soluzione enzimatica costituito 3,75 mg dispasi, 1 mg ialuronidasi e 0,3 g collagenasi tipo XI per ml di ASW + P / S in un tubo da 15 ml polipropilene.
- Luogo risciacquato gangli nella soluzione enzimatica e fissare il tappo. Posizionare il tubo su un lato su un agitatore rotante (vedi tabella 2) a bassa velocità per 13-5 ore durante la notte a circa 23 ° C (temperatura ambiente).
- Preparare ilpiatti della cultura.
- Prima di microdissezione (Day 2), preparare poli-D-lisina (PDL) rivestite piatti della cultura in una cappa di coltura di tessuti. Aggiungere 0,5 ml ~ PDL (0,2 mg / ml di acqua sterile) al centro di un piatto 35 millimetri a ~ 25 min.
- Sciacquare PDL 3x con acqua sterile. Lasciare asciugare. UV-sterilizzare le piastre.
- Giorno 2 Isolare i neuroni.
- Riempire il centro di 35 piatti mm che erano PDL-rivestito UV e sterilizzato con circa 0,5 ml di ASW + P / S per creare un'isola di supporto all'interno del piatto altrimenti asciutto. Questo può essere fatto in panchina, fuori della cappa coltura tissutale. Un piatto deve essere preparato per ogni gruppo di cellule provenienti da una hemiganglion.
- Avere pronto un diametro di 100 millimetri piatto dissezione fatta da Sylgard-rivestimento e guarire una mm superficie dissezione profonda 5, dotato di sottili perni dissezione di varie dimensioni da utilizzare come perni e sonde (cfr. tabella 3). Sciacquare questo piatto con il 70% di alcol isopropol, poi con ASW + P / S, e, infine, fill con ASW + P / S.
- Preparare microdissezione dei gangli digerito.
- Versare la soluzione enzimatica contenente il pleurico-pedale e buccale gangli digerito nel piatto dissezione.
- Porre la capsula sul palco del microscopio contro una superficie nera sotto luce riflessa.
- Utilizzando il tessuto connettivo allegata, definire con precisione ogni pleurico-pedale hemiganglion lato dorsale alto. I tessuti saranno morbidi e intollerante di stretching.
- Microdissect neuroni in PVC.
- Utilizzando due coppie di pinze sottili puliti, e in possesso di un perno di dissezione multa in un paio di pinze come sonda, isolare le cellule del PVC da un hemiganglion pleurico. Digestione enzimatica avrà rimosso o rotto a parte il tessuto connettivo che copre il cluster PVC, ma le cellule saranno aderire l'una all'altra.
- Usare la sonda di staccare queste cellule dal connettivo pedale-pleurica 18, poi lasciare cadere il cluster cella al fondo della dissezionepiatto.
- Trasferire i neuroni al piatto cultura.
- Trasferire il gruppo di cellule di un mm piatto preparato 35 cultura delicatamente succhiare il cluster nella punta di un po 'incendio lucidato pipetta Pasteur di vetro usa e getta, quindi l'erogazione lentamente nell'isola dei media in una capsula di Petri, facendo attenzione ad evitare l'introduzione di bolle d'aria nella pipetta. Ripetere l'estrazione del cluster PVC dell'altro hemiganglion e posto in una capsula di Petri separato.
- Microdissect e trasferire i neuroni BSC.
- Piedinatura del ganglio buccale lato ventrale, con cura per risparmiare le cellule di interesse. Ripetere il passo 1.12 con le 2 BSC gruppi di cellule del ganglio buccale 10.
- Isolamento di neuroni in PVC e BSC produrrà 4 capsule di Petri contenenti cluster di neuroni: 2 piatti contenenti cluster BSC e 2 piatti contenenti cluster PVC. Scartare il resto dei gangli e mettere da parte il piatto di 100 mm dissezione.
- Dissociate i gruppi di cellule.
- Posizionare un piatto di coltura contenente cellule sul palco del microscopio a bassa potenza e rimuovere il coperchio.
- Dissociare il cluster PVC delicatamente sfogliando il fondo del piatto cultura adiacente al cluster cella con un perno dissezione multa tenutasi a pinza. Sfogliando è scavare la punta del perno nella plastica del fondo del piatto come se cercasse di scavare una macchia di plastica. Quando l'attrito con la plastica rilascia il punto di perno, un'onda percussione viene prodotta attraverso il mezzo che si rompe il vicino ammasso di cellule.
- 5-10 colpi di frusta possono essere necessari fino a quasi dissociare completamente le cellule, ma è meglio lasciare piccoli gruppi di cellule, piuttosto che a sfogliare troppo timore le cellule distrutte dalla pura meccanica.
- Rimontare il coperchio e ripetere con altri piatti della cultura.
- Conservare le colture cellulari.
- Posizionare le piastre di coltura contenenti isole dei media nei loro centri di cellule dissociate inun grande contenitore che permette la circolazione dell'aria, come ad esempio una x 25 millimetri di plastica rotondo piatto 150 Petri, e collocare questo piatto in un incubatore a 17 ° C.
- Installare nella camera di una vaschetta aperta di acqua come fonte di umidità. Lasciar riposare durante la notte. Le cellule aderiscono al rivestimento poli-D-lisina nel centro del piatto.
- Piatti della cultura diluvio.
- Il giorno 3, inondare delicatamente i piatti con 2,5 ml di ASW + P / S. Esaminare e contare le cellule utilizzando una cultura microscopio cellula invertito. Conservare nel 17 ° C incubatore.
2. Elettrofisiologia
Il metodo è di connessione standard di serraggio che è stato descritto in numerosi testi (es. Sakmann e Neher, 1995) 16. Questo protocollo funziona su cellule ≤ 100 pF capacitanza, o cellule <60 micron di diametro nei giorni 3 e 4 del protocollo. Cellule senza processi sono ottimali per la registrazione. Il seguente considerat specialeapplicano gli ioni:
- Celle più grandi possono essere sistemati con l'impostazione di configurazione dell'amplificatore 200B Axopatch impostato a β = 0,1. Attivazione di grandissime correnti può indurre le cellule a sfuggire voltage clamp. Soluzioni ASW sostituita contenuto di sale (per esempio una frazione del NaCl sostituito con impermeabile cloruro N-metil-D-glucammina) possono essere utilizzate per ridurre intera ampiezza della corrente della cella.
- Fibre piene di pipette di patch borosilicato tirato su un estrattore pipetta e riempita a metà con soluzione intracellulare (ICS), composto da 450 mM KCl e altri sali (vedi Tabella 1) sono adatti, e devono avere la resistenza di circa 0,5-1 MOhm. Se è desiderato isolamento di correnti ioniche specifici, per esempio Na + correnti in assenza di correnti di K, K + in questa soluzione può essere sostituita con altri ioni come Cs +. Cl - sostituzione di ICS con un anione impermeant è anche giustificato se si desidera un ICS più naturale9.
- Le cellule sono robusti con> 1 hr-lunghe registrazioni possibili a temperatura ambiente. La registrazione è ottimale nei giorni 3 e 4 del protocollo, che corrispondono a 24-48 ore in cultura. Dopo 48 hr vi è difficoltà a formare guarnizioni gigaohm, forse a causa di elaborazione di un glicocalice sulla superficie cellulare, e problemi di spazio clamp causati dal processo escrescenza. Le cellule sono utili, tuttavia, per gli studi di clamp non di patch, come la tossicologia, che possono essere completati in <14 d.
- ASW ed altre soluzioni di essere dispensato dal dispositivo soluzione alimentato a gravità, così come la soluzione intracellulare, devono essere filtrati con una siringa montata 0,2 micron filtro Acrodisk (Tabella 3) per eliminare le particelle fini che interferiscono con la formazione sigillo gigaohm.
- Desensibilizzazione si verifica quando si utilizza agonisti come il D-aspartato (D-Asp), quindi ~ 1-2 minuti tra le applicazioni degli agonisti è raccomandato. Al contrario, il potenziamento è spesso osservato con una rapida applicazione ripetutazione di agonisti come L-glutammato (Glu-L).
- Agonisti correnti attivati come L-Glu possono essere studiate applicando agonisti con il picospritzer pipetta. Questa pipetta è tirato la stessa della pipetta di patch e contiene agonista in ASW. Quando la punta della pipetta questa è posizionato sotto il tubo di uscita del dispositivo soluzione alimentato a gravità, e con un angolo di 45 ° dal tubo di efflusso (Figura 2F), agonista verrà rapidamente lavato via dalla cella, e desensibilizzazione sarà minimizzata. La pipetta agonista dovrebbe creare un angolo di 90 ° o più rispetto alla pipetta di patch.
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Representative Results
Le posizioni dei neuroni sensoriali all'interno dei gangli che sono indirizzate in questo protocollo, i neuroni BSC e PVC sono mostrati in Figura 1. I neuroni BSC si trovano in 2 simmetriche grappoli ovale sul lato ventrale del ganglio buccale, la superficie che si affaccia dalla massa buccale nel ganglio intatto (Figura 1A). I neuroni formano PVC, cluster a forma di V bilaterali che avvolgono la superficie dorsale del ganglio pleurico verso l'asse centrale (Figura 1B). Questi neuroni sensoriali hanno il vantaggio di una posizione stereotipati all'interno dei gangli, sebbene il cluster destra o sinistra è mancante nei singoli animali in circa l'1% di occorrenze. Il BSC e PVC neurone cluster sono identificabili dal colore arancio scuro della membrana cellulare e relativamente piccole dimensioni rispetto alle celle vicine, come mostrato nella grande contorno cerchio di figura 1A.
Nella cultura, questineuroni sono spesso senza processi il giorno dopo la placcatura (Figura 2A) e sono ideali per le patch di bloccaggio quel giorno, e un giorno in più. A volte è possibile ottenere una adeguata morsetto spazio anche quando le cellule sembrano avere escrescenza processo (Figura 2F), suggerendo che non tutto germinazione che sembra emanare dal corpo cellulare è parte della cellula. Se la manipolazione dopo la digestione enzimatica è stato gentile, le cellule arrivano in coltura con alcuni processi intatti, e questi processi si sviluppano con il tempo (Figura 2B-2E). Tali cellule non sono adatti per patch di serraggio, ma è possibile la registrazione intracellulare.
Correnti di patch clamp cellule intere portate da tensione gated Na + e Ca 2 + sono prontamente rilevate dai neuroni in PVC e BSC in coltura a breve termine 6, ed entrambi i tipi di cellule mostrano una corrente di K misto. Neuroni BSC anche rispondere a acetilcolina, serotonina e NMDA 4 (Figura 3C) Con correnti eccitatorie, mentre sia BSC e neuroni PVC rispondono alla L-Glu-Asp e D 3 (Figure 3A e 3B) con correnti eccitatorie. Le caratteristiche farmacologiche di L-Glu-e correnti D-Asp-indotte questi neuroni sono stati descritti 4.
Figura 1. Microfotografie mostrano la posizione dei neuroni sensoriali glutammatergiche dei gangli buccale e della pleura (cerchi rossi). A. Le buccali S a grappolo (BSC) neuroni, identificabili dal loro colore arancio scuro (grande cerchio sul hemiganglion a sinistra) e la posizione corrispondente nel hemiganglion destra (cerchi piccoli). B. a forma di V, arancio pleurico ventrocaudal grappolo scuro (PVC) cellula del diritto hemiganglion pleurico (hemiganglion sinistra non mostrato).
Figura 2. Microfotografie dei neuroni sensoriali glutammatergiche nella cultura A. cellule dal PVC di cluster 24 ore dopo la placcatura in piatto di coltura che mostra due neuroni sensoriali e di altre cellule.; Altre cellule del PVC di culture separate a 24 ore vengono visualizzati come riquadri B, C.. Un BSC neurone in coltura a 24 ore e lo stesso neurone a 96 ore, rispettivamente. D, E. Un neurone PVC nella cultura a 24 ore e lo stesso neurone a 96 ore, rispettivamente. F. Un neurone in PVC a 48 ore in un esperimento patch clamp. La pipetta patch viene in contatto la cellula dal bordo destro, mentre il picospritzer pipetta è in basso. La grande ombra scura visibile a sinistra della cella è l'apertura della pipetta bagno fluente. Clicca qui per ingrandire la figura.
Figura 3. Correnti glutammatergiche a cellula intera registrazioni di patch clamp da neuroni BSC e PVC. A. Tutta la corrente in un BSC neurone delle cellule in risposta alla domanda di pressione di L-Glu (1 mm, 100 msec). B. Tutta la corrente di cella in un neurone in PVC risposta alla domanda di pressione di D-Asp (1 mM, 100 msec). C. cellula intera corrente NMDA nella stessa cella BSC come in A (1 mM, 100 msec).
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Discussion
Le tecniche di dissociazione descritti qui resa culture di neuroni sensoriali contenenti 50-100 neuroni isolati intervallati da un piccolo numero di cellule gliali e di altre cellule non identificati. Le fasi più critiche del protocollo sono il momento i gangli rimangono in soluzione enzimatica, e sfogliando, la dissociazione dei gruppi di cellule digerite a spezzare il gruppo in singole cellule. Digestione enzimatica (passo 1.8) deve essere ottimizzato alla temperatura disponibile. A 23 ° C con agitazione lenta, 13 ore è sufficiente per la digestione del BSC cluster while15 hr è ottimale per i cluster in PVC. Basse produzioni di cellule in colture possono essere attribuite a tempo insufficiente a enzima, o troppa rottura meccanica sia durante la fase di trasferimento di celle (1.11 e 1.12) o durante la fase sfogliando (1.13). Incapacità delle cellule di aderire fino al substrato della cultura, così come breve sopravvivenza nella cultura è di solito a causa di troppa rottura meccanica. Contaminazione del culture possono anche accadere, ed è meglio risolto assicurando che l'animale anestetizzato è ben sciacquato, che gli strumenti di dissezione sono pulite, e che i gangli di interesse vengono sottoposti a diversi lavaggi in ASW + P / S. Potrebbe essere necessario lavare e alcool-pulito strumenti tra le diverse parti della procedura dissezione, o hanno strumenti sufficienti pronta così che quelli puliti possono essere usati per ogni passaggio.
Aplysia studi neurobiologici sono più spesso condotti su preparati ridotte che conservano i collegamenti nervosi tra i neuroni o tra neuroni e muscoli 2, 18. Queste preparazioni facilitano l'assegnazione di controllo dei processi muscolari a specifici neuroni e circuiti neuronali e permettono anche studi sul potenziamento e la facilitazione dei riflessi ripetitivi. Preparazioni intatti non sono adatti a certi tipi di protocolli morsetto tensione e lo studio di effetti di agonisti che desensibilizzare rapidamente i loro recettori.
Il lungo periodo di co-coltura neuronale è un ulteriore strumento per studiare il potenziamento e la facilitazione in condizioni altamente controllate. A lungo termine si prestano co-colture anche per studi biochimici sui singoli neuroni. Successo della preparazione di co-cultura è spesso attribuita a l'aggiunta di fino al 50% Aplysia emolinfa di culture 17. Tuttavia, il successo di questo approccio dipende spesso variabilità da lotto a lotto di questa emolinfa.
La cella dissociata preparazione coltura descritto qui espande l'uso repertorio del modello Aplysia. Colture di cellule dissociate non sono adatti per dedurre circuiti neurali o studiare la sinapsi intatta come i metodi di cui sopra fare. La preparazione della coltura cellulare dissociato ha la sua massima utilità nel confermare l'esistenza di specifiche conduttanze ioniche e le loro proprietà cinetiche e farmacologiche in esperimenti di voltage clamp singola cella. Sevcorrenti unici rali sono stati scoperti utilizzando preparazioni di cellule singole, tra cui una corrente nelle celle borsa cazione eccitatorio 19 e il D-Asp attuale recettore in BSC neuroni 4. Studi su Aplysia raramente si concentrano sulle correnti ioniche di singole cellule, in parte a causa delle dimensioni spesso ingombrante di tali cellule e la presenza di numerosi altri tipi di cellule adatti modelli che si prestano bene per rattoppare le tecniche di clamp. Come risultato, l'esistenza di alcune correnti in Aplysia, come quelli attivati da acido alfa-amino-3-idrossi-5-metil-4-isossazolo-propionico (AMPA) sono solitamente dedotto dal blocco del recettore AMPA putativo (R) comportamenti legati da antagonisti Ampar applicate alla preparazione nervo ridotta, piuttosto che registrare direttamente. Tal modo di verificare l'esistenza di certe correnti è carente. Isolamento dei neuroni glutamatergici coltivate e singola tensione metodologia clamp cellulare fornisce una prova diretta per l'esistenza didifferenti tipi di canali L-GluR in questo organismo modello.
Un altro uso di neuroni Aplysia in esperimenti di patch clamp singola cella è nella dissezione seconde cascate messaggero. Neuroni Aplysia sono particolarmente adatti per gli studi di secondo messaggero modulazione indotta perché sono stabili per lunghi periodi di registrazione a temperatura ambiente 3, 12, 20, 21 , e sono sufficientemente robusto che le singole cellule possono essere salvati dopo la registrazione e registrati da nuovo dopo 24 ore 5. Questi cluster di neuroni sensoriali vestibolari e pleurico comodamente producono un paio di culture trovati da ogni ganglio, in modo che un piatto può essere designata una cultura di controllo, mentre il suo compagno riceve un trattamento.
Un ulteriore vantaggio di questa preparazione è in studi sullo stato morfologica dei singoli neuroni. Per esempio, abbiamo scoperto che i corpi cellulari dei neuroni Aplysia da animali senescenti erano larger di quelli provenienti da animali più giovani, ma non ha elaborato processi cellulari dopo diversi giorni di cultura 6. Queste preparazioni neuroni isolati anche facilitare studi utilizzando coloranti vitali per valutare i livelli intracellulari di Ca +2, pH, specie reattive dell'ossigeno, il potenziale di membrana mitocondriale e di altri tratti fisiologici che possono poi essere confrontati con le caratteristiche neurofisiologiche delle singole cellule. Mentre alcuni di questi approcci sono applicabili nelle preparazioni intatti o co-coltura, la raccolta dei dati è molto più semplice utilizzando neuroni isolati in questo sistema di coltura facile. In futuro speriamo di poter utilizzare queste cellule per singolo profilo molecolare delle cellule 13.
La cultura dissociata breve termine fornisce materiale ideale per indagare i processi neurofisiologici fondamentali, e può fornire uno strumento particolarmente potente se usato in combinazione con gli studi che coinvolgono ridotta o preparazioni di co-coltura. Il dissociatoAplysia neurone cultura estende l'utilità di questo modello animale venerato a nuove ed interessanti aree della neuroscienza.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Finanziato dal NIH P40 OD010952, la Fondazione Korein, una Università di Miami Fellowship a SLC e una borsa di studio per Maytag ATK. Gli autori ringraziano il personale delle Risorse Nazionale per l'Aplysia, così come Lauren Simonitis e Hannah Peck, che ha fornito al microscopio per una figura.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial seawater ASW | Sigma-Aldrich | assorted | (mM): 417 NaCl, 10 KCl, 10 CaCl2 (2 H2O), 5MgCl2 (6H2O), 15 HEPES-NaOH, pH 7.6 |
| Intracellular solution | Sigma | assorted | (mM): 450 KCl, 2.9 CaCl2 (2 H2O), 2.5 MgCl2 (6 H2O), 5 Na2ATP, 10 EGTA, and 40 HEPES-KOH, pH 7.4 |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| penicillin/streptomycin added to ASW at 1:100 | Lonzo Walkersville, Inc. | 17-603E | 5,000 Units/ml penicillin plus 5,000 mg/ml streptomycin |
| Neutral dispase II | Roche Diagnostics | 10165859001 | |
| hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H4272 | |
| collagenase type XI | Sigma-Aldrich | C9407 | |
| L-Glutamate (L-Glu) | Sigma-Aldrich | 49601-100G | |
| D-Aspartate (D-Asp) | Sigma-Aldrich | 11200-10G | |
| N-methyl-D-aspartate (NMDA) | Biomol | 100002-268 | |
| L-Asp | Sigma | A6683-25G | |
| alpha-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid (AMPA) | Sigma | A6816-5MG | |
| L-Glu R antagonists | various | various | |
| agar | |||
| kynurenate | Sigma-Aldrich | 61250 | |
| APV | Sigma-Aldrich | A5282 | |
| DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (NMDAR antagonist) | |||
| 2-propanol | VWRSP | BDH1133 | |
| Chloriding solution | Sigma | assorted | 25 g FeCl3 + 25 ml concentrated HCl + 50 ml H2O |
| Sylgard silicone 2-part polymer | World Precision Instruments (WPI) | SYL184 | Provides pin-out surface for small dissection dishes |
| 0-40x zoom magnification microscope for dissections | Wild | ||
| Techniquip 150 Watts Fiber Optic Illuminator | Microoptics of Florida | TQ FOI-150 | |
| RotoMix 50800 orbital mixer | |||
| Nikon Diaphot inverted phase-contrast microscope with 4x, 20x (optional) & 40x objectives | SR Research Ltd. | Eyelink II | |
| Tektronix digital oscilloscope | SR Research Ltd. | ||
| pClamp 10 data acquisition and analysis software | Molecular Devices | ||
| PC with Windows XP or higher operating system | PC Solutions | Thinkserver with solid state hard drives (80GB) and low noise monitors | |
| Flaming/Brown P87 micropipette puller | Sutter Instruments, Novato, CA | ||
| Axon Instruments Axopatch 200B clamp amplifier with a capacitance compensation range of 1-1000 pF; preamplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ||
| Axon instruments electrode holder assembly for Axopatch 200B preamplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | CV203BU | |
| Digidata 1200 A/D converter | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ||
| Picospritzer, powered by N2 adjustable for pressure and duration | Parker Hannifin, Cleveland, OH | ||
| TMC Micro-G Vibration isolation table | Ametek | ||
| Faraday cage | custom manufacture | ||
| Burleigh Piezoelectric Clamshell Micromanipulators | Burleigh Instruments; Thorlabs | presently PCS-5000; -6000 series + mounts | |
| Narishige M-152 manual manipulators (for perfusion system and picospritzer) | Narishige USA | ||
| Filament pipette glass,1.5 mm OD, 0.84 mm ID - | WPI | 1B150-3 | |
| 3 inch length | |||
| Ag/AgCl half cell | WPI | EP4 | |
| 15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon* Centrifuge Tubes | VWRSP | 21008-918 | |
| Angled Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| Dumostar Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| 35 mm falcon tissue culture dishes | VWRSP | 25382-064 | |
| falcon 150 x 25 mm tissue culture dishes; 1013 | VWRSP | 1013 | also can be made into small dissection dishes with sylgard |
| sylgard | WPI | SYL184 | |
| animal dissection tray | various | ||
| 15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon | VWRSP | 21008-918 | For 6-bore gravity-fed perfusion system |
| Aluminum clips with screw hole ends | hardware store | For perfusion system | |
| 23 gauge needles (manually file off points) | VWRSP | For perfusion system | |
| Polyethylene tubing 0.022"ID x 0.042"OD; 427411 | Becton-Dickinson | For perfusion system | |
| H-7 pipette stand/holder for microcap perfusion array | Narishige USA | For perfusion system | |
| one-way valves | For perfusion system | ||
| Drummond Microcaps 1 μl | VWRSP | For perfusion system | |
| 18 gauge needles for suction (filed off points) | |||
| Polyethylene tubing | Cole Parmer | 4.27436E+11 | |
| fine dissection pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| capillary tubes | Kimble 71900-100 | fire-polished and U-shaped in a Bunsen burner flame and filled with 3% agar in ECS | |
| modeling clay | craft store | ||
| dish holder for microscope stage with isolated ground bath | Custom manufacture | ||
| pasteur pipettes | VWRSP | 14672-412 | |
| pipette bulbs | VWRSP | 53283-911 | |
| acrodisk syringe filters | VWRSP | 28144-040 | |
| thick-walled 1.5 mm diameter borosilicate filament glass | WPI | 1B150F-3 | |
| High purity nitrogen cylinder and bifurcating regulator | |||
Tables 1-3. Lists of Reagents, Materials, and Equipment. |
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References
- Buttner, N., Siegelbaum, S. A. Antagonistic modulation of a hyperpolarization-activated Cl(-) current in Aplysia sensory neurons by SCP(B) and FMRFamide. J. Neurophysiol. 90 (2), 586-598 (2003).
- Byrne, J. H., Castellucci, V. F., Kandel, E. R. Contribution of individual mechanoreceptor sensory neurons to defensive gill-withdrawal reflex in Aplysia. J. Neurophysiol. 41 (2), 418-431 (1978).
- Carlson, S. L., Fieber, L. A. Physiological evidence that D-Aspartate activates a current distinct from ionotropic glutamate receptor currents in Aplysia californica. J. Neurophysiol. 106 (4), 1629-1636 (2011).
- Carlson, S. L., Kempsell, A. T., Fieber, L. A. Pharmacological evidence that D-Aspartate activates a current distinct from ionotropic glutamate receptor currents in Aplysia californica. Br. Behav. 2 (4), 391-401 (2012).
- Fieber, L. A. Characterization of Na+ and Ca2+ currents in bag cells of sexually immature Aplysia californica. J. Exp. Biol. 201 (5), 745-754 (1998).
- Fieber, L. .A., Carlson, S. L., Capo, T. R., Schmale, M. C. Changes in D-Aspartate ion currents in the Aplysia nervous system with aging. Br. Res. 1343, 28-36 (2010).
- Glansman, D. L. Habituation in Aplysia: The Cheshire Cat of neurobiology. Neurobiol. Learn. Mem. 92, 147-154 (2009).
- Hawkins, R. D., Abrams, T. W., Carew, T. J., Kandel, E. R. A Cellular Mechanism of Classical Conditioning in Aplysia: Activity-Dependent Amplification of Presynaptic Facilitation. Science, New. 219 (4583), 400-405 (1983).
- Ichinose, M., Sawada, M., Maeno, T., McAdoo, D. J. Effect of acetylcholine on ventrocaudal sensory neurons in the pleural ganglia of Aplysia. Cell Mol. Neurobiol. 9, 233-245 (1989).
- Kandel, E. R. Cellular basis of behavior. , W.H. Freeman. New York. (1976).
- Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialog between nerves and synapses. Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).
- Kupfermann, I., Castellucci, V., Pinsker, H., Kandel, E. Neuronal correlates of habituation and habituation of the gill-withdrawal reflex in Aplysia. Science. 167 (3926), 1743-1745 (1970).
- Magoski, N. S. Regulation of an Aplysia bag-cell neuron cation channel by closely associated protein kinase A and a protein phosphatase. J. Neurosci. 24 (30), 6833-6841 (2004).
- R, E. Neuronal transcriptome of Aplysia: neuronal compartments and circuitry. Cell. 127, 1453-1467 (2006).
- Nick, T. A., Kaczmarek, L. K., Carew, T. J. Ionic currents underlying developmental regulation of repetitive firing in Aplysia bag cell neurons. J. Neurosci. 16 (23), 7583-7598 (1996).
- Single-channel recording. Sakmann, B., Neher, E. , Plenum Press. NY. (1995).
- Tam, A. K., Geiger, J. E., Hung, A. Y., Groten, C. J., Magoski, N. S. Persistent Ca2+ current contributes to a prolonged depolarization in Aplysia bag cell neurons. J. Neurophysiol. 102 (6), 3753-3765 (2009).
- Schacher, S., Proshansky, E. Neurite regeneration by Aplysia neurons in dissociated cell culture: modulation by Aplysia hemolymph and the presence of the initial axonal segment. J. Neurosci. 3 (12), 2403-2413 (1983).
- Walters, E. T., Byrne, J. H., Carew, T. J., Kandel, E. R. Mechanoafferent neurons innervating tail of Aplysia. I. Response properties and synaptic connections. J. Neurophysiol. 50 (6), 1522-1542 (1983).
- Wilson, G. F., Richardson, F. C., Fisher, T. E., Olivera, B. M., Kaczmarek, L. K. Identification and characterization of a Ca(2+)-sensitive nonspecific cation channel underlying prolonged repetitive firing in Aplysia neurons. J. Neurosci. 16 (11), 3661-3671 (1996).
- White, B. H., Nick, T. A., Carew, T. J., Kaczmarek, L. K. Protein kinase C regulates a vesicular class of calcium channels in the bag cell neurons of Aplysia. J. Neurophysiol. 80 (5), 2514-2520 (1998).
- Wilson, G. F., Magoski, N. S., Kaczmarek, L. K. Modulation of a calcium-sensitive nonspecific cation channel by closely associated protein kinase and phosphatase activities. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95 (18), 10938-10943 (1998).
- Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures. J. Vis. Exp. (28), e1355 (2009).
