Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

סינתזה, משלוח נייד ו Published: September 10, 2013 doi: 10.3791/50545
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 3, 4, 2
1Institute for Complex Molecular Systems & Laboratory of Macromolecular and Organic Chemistry, Eindhoven University of Technology & NEST, Scuola Normale Superiore and Istituto Nanoscienze-CNR, 2NEST, Scuola Normale Superiore and Istituto Nanoscienze-CNR & IIT@NEST, Center for Nanotechnology Innovation, 3NEST, Scuola Normale Superiore and Istituto Nanoscienze-CNR, 4IIT@NEST, Center for Nanotechnology Innovation

Summary

חיישני הקרינה הם כלים רבי עוצמה בתחום מדעי חיים. כאן אנו מתארים מתודולוגיה לסנתז ולהשתמש בחיישני ניאון מבוסס dendrimer למדוד pH בתאים חיים וin vivo. הפיגום הדנדריטים משפר את תכונותיהם של צבעי ניאון מצומדות המובילים למאפייני חישה משופרים.

Abstract

הפיתוח של אינדיקטורים ניאון ייצג מהפכה למדעי חיים. מבחינה גנטית מקודד וfluorophores הסינתטי עם יכולות חישה אפשר להדמיה של מינים רלוונטיים מבחינה ביולוגית עם רזולוציה מרחבית ובזמן גבוה. צבעים סינטטיים הם של עניין מיוחד הודות לtunability הגבוה שלהם ואת מגוון הרחב של analytes למדידה. עם זאת, מולקולות אלה סובלים מספר מגבלות הקשורות להתנהגות מולקולה קטנה (מסיסות ירודה, קשיים במיקוד, לעתים קרובות אין הדמיה ratiometric מותרת). בעבודה זו אנו מציגים את הפיתוח של חיישנים מבוססי dendrimer ולהציג את הליך למדידת רמת חומציות במבחנה, בתאים חיים וin vivo. אנחנו בוחרים dendrimers כפלטפורמה אידיאלית עבור החיישנים שלנו עבור רבים תכונותיהם רצויות (monodispersity, תכונות מתכונן, multivalency) שגרמו להם פיגום בשימוש נרחב לכמה מכשירים ביו. נטיה של pH הניאוןאינדיקטורים לפיגום dendrimer הובילו לשיפור של הופעות החישה שלהם. בפרט תערוכת dendrimers הקטינה זליגת תא, מיקוד תאיים משופר ויאפשר מדידות ratiometric. חיישנים אלה רומן הועסקו בהצלחה למדידת רמת חומציות בתאים חי הלה ובחי במוח עכבר.

Introduction

השימוש במולקולות ניאון לתייג מולקולות ביולוגיות רלוונטיות ספציפיות השתנתה לחלוטין את הדרך בה אנו לומדים במערכות ביולוגיות. Widefield ומיקרוסקופיה confocal אפשרה להדמיה בזמן אמת ברזולוציה הגבוהה של תהליכים ביולוגיים וכיום הם בין הטכניקות הפופולריות ביותר ללמוד אירועים ביולוגיים במבחנה, בתאי in vivo. 1 שיפור רלוונטי היה מיוצג על ידי הפיתוח של אינדיקטורים הקרינה , צבעים כלומר הקרינה שתלויה בריכוזה של ישות מולקולרית ספציפית. מדדי ה-pH וסידן בפרט היו השפעה דרמטית על המחקר של פיזיולוגיה של תא עקב הרלוונטיות עצומות של H + ו Ca 2 + יונים בביולוגיה. 2,3

עם זאת, רוב צבעי החישה הנוכחיים כמה מגבלות פנימיות הקשורים להתנהגות המולקולה הקטנה שלהם, כגון: א) קשיים בtargeti subcellularng; ii) מסיסות עניות במים וכתוצאה מכך biocompatibility עניים;. וiii) דליפת תא ובכך חוסר היכולת הארוכה זמן לשגות הדמיה 4 יתר על כן, את האות של בדיקות רבות לא ניתן לתקן עבור התלות בריכוז הצבע (שאינה ההדמיה ratiometric) ולכן, מדידה מוחלטת בתאים או בvivo היא לא אפשרית.

לאחרונה תוארו המתודולוגיה פשוטה ויעילה כדי להתגבר על המגבלות האלה, המבוססות על נטיה של צבעי חישה על פיגום dendrimer. 5 Dendrimers הם פולימרים hyperbranched monodisperse עם מאפיינים מאוד מושך עבור יישומים ביולוגיים. 6 בפרט כמה ארכיטקטורות הדנדריטים פותחו ומשמשות לתרופה 7 ומסירת גן. 8 רק לאחרונה מספר קבוצות התחילו לחקור את הפוטנציאל של מולקולות אלה כפיגום למכשירי חישה. 9,10,11

אנחנו בעברתאר מסלול קל סינטטי כלפי functionalization של polyamidoamine שונה פיגומים (Pamam) המבוסס על אסטרים הופעלו-NHS. ניתן להשיג 12 Conjugates בשלב אחד בדרך של דיאליזה כטיהור בלבד. מעניין גישה זו יכולה בקלות להיות מיושמת על מגוון רחב של פיגומים הדנדריטים או פולימרים. 13,14

כדי להשיג dendrimers ההדמיה ratiometric היו עם שני סטים של צבעים שכותרתו כפולים: א) אינדיקטור pH (כלומר העמסה) וii) מחצית pH עצמאי ניאון (כלומר rhodamine). זה אפשר לנו לבצע הדמיה מדויקת של pH כיחס בין ההעמסה וrhodamine הוא רק תלוי בחומציות ולא יותר על הריכוז של החללית. גישה מעניינת נוספת לנושא זה מיוצגת על ידי השימוש בבדיקות המבוססים על חייו. 15 כחיים אינם תלויות בריכוז בדיקה מדידות אלה לא צריכים תיקון ratiometric. עם זאת, lifמדידות etime דורשות התקנת אינסטרומנטלי מסובכת יותר והרזולוציה של הזמן שלהם היא תת אופטימלית לתהליכים פיסיולוגיים במהירות, ובכך להגביל היישומים הפוטנציאליים שלהם.

על מנת לבצע הדמיה תאית, החללית צריכה להיות מועברת על פני קרום הפלזמה לתוך cytosol. כdendrimers לא קרום חדיר בשל הגודל וhydrophilicity, משלוח תאיים יכול להיות מושגת באמצעות electroporation. באמצעות טכניקה זו, בשימוש נרחב בביולוגיה לtransfection, מקרומולקולות שכותרתו יכולה להיות מועברות בצורה יעילה לתאים לבצע הדמיה באיכות גבוהה. יתר על כן, עם electroporation ניתן להימנע מסיבוכים הקשורים לאנדוציטוזה dendrimer כמקרומולקולות מועברות ישירות לציטופלסמה. מעניין אחרי dendrimers שונה electroporation תערוכות מגוירים מובחן בתוך התאים גם בהיעדרו של כל רצף מיקוד ספציפי. 5 passiv זהדואר מיקוד, רק בשל מאפייני physicochemical של dendrimer, ניתן לנצל כדי להשיג הדמיה pH אברון הספציפי.

הדמיה ratiometric יכולה להתבצע באמצעות מיקרוסקופיה confocal. ההעמסה וrhodamine, קוולנטית מצומדת לפיגום הדנדריטים, היו צילמו בנפרד ומפת יחס פיקסל אחר פיקסל נוצרה. כמה נהלים כדי לשלוט ברמת חומציות תוך תאית בתאים חיים באמצעות יונופורים דווחו. יונופורים הם מולקולות קטנות הידרופובי מסוגלים להעביר יונים על פני קרום הפלזמה; יונופורים עבור H + יון, כגון nigericin, זמינים וניתן להשתמש בו כדי לכייל את החיישנים מבוססי dendrimer 16 מדידות אלה חשפו תגובה ליניארי ל-pH באופן דומה למה שנצפה. במבחנה. על בסיס ה-pH תאית כיול ניתן היה למדוד באופן מדויק. מדידות אלה הראו כי חיישן מבוסס dendrimer יכול להיות כלי רב ערך במחקר H + homeostאס בתאים חיים ובתהליכים פתולוגיים שכרוך בתקלות ויסות רמת חומציות.

לאחרונה הוכיחו כי יכולים להיות מיושמים גם חיישני pH מבוסס dendrimer in vivo, ביצוע ההדמיה pH במוח של עכברים מורדמים. 17 בשל הסביבה המורכבת של רקמות חיות באיכות גבוהה בחישת vivo היא מאתגרת מבחינה טכנית. כאן אנו מראים תיאור מפורט של ההליך ניסיוני להדמית pH in vivo עם דגש של הסוגיות מכריעות לטפל לבצע הדמיה מדויקת של pH במוח. שני הפוטונים במיקרוסקופ כבר מועסק משתי סיבות עיקריות: א) השימוש באור אינפרא אדום מאפשר להתגבר על חוסר חדירה לרקמות של מיקרוסקופיה confocal הסטנדרטי; ii) את ספיגת שני פוטונים הרחב של העמסה וrhodamine מאפשרת העירור בו זמנית שלהם הימנעות סיבוכים הקשורים לשימוש בשני אורכי גל לעירור. מדידות pH במוח עכבר היוביצע בהצלחה החוצה; חיישנים בקלות להגיב להיפוקסיה לגרום לשינוי של ה-pH במרחב תאי במוח. מדידות אלו מראות כי אינדיקטורים המבוסס על dendrimer יכולים לשמש בהצלחה כדי להדגיש את השינוי פיסיולוגי ופתולוגיים של pH in vivo במודל חיה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. סינתזה של חיישנים

  1. בסעיף הבא שאנו מספקים להליך נטיה של מדדי ה-pH ל dendrimers Pamam. אותו הפרוטוקול יכול להיות מיושם עם שינויים מינימאליים לdendrimers אמין נושאות חלופיות. 5,17,13,14 dendrimers וצבעים ניתן להשיג בחנויות ניתן להשתמש ללא purifications נוספת.
  2. ממיסים את dendrimer בDMSO נטול מים (ריכוז סופי 50 מיקרומטר). הכן פתרונות מניות 10mm של ההעמסה-NHS וtetramethyl-rhodamine-NHS (ת.מ. ר) ב DMSO נטול מים.
  3. הוסף לפתרון dendrimer את הכמות הרצויה של העמסה וTMR. היחס טוחנת בתערובת ישקף את כמות הצבעים נטענים על dendrimer. בדרך כלל 1 מיליליטר של תמיסת dendrimer Pamam G4 בצינור microcentrifuge הוא הגיב עם 8 EQ (40 μl) של והעמסת ו8 EQ (40 μl) של TMR. מערבבים את הפתרון בטמפרטורת חדר למשך שעה 12.
  4. לדלל 1:10 עם מים deionized ולטעון את התגובהתערובת בשקית דיאליזה (MWCO = 10 KDA). Dialyze ל24 שעות נגד המים deionized החלפה בתדירות גבוהה המים במאגר.
  5. מעביר את הפתרון לבקבוקון ולהקפיא יבש ל24 שעות. יש לקבל אבקה סגולה. משקל שהושג מוצק ולהמס אותו במי milliQ בריכוז סופי של 10 מיקרומטר. Aliquot הפתרון ולאחסן ב -20 ° C.

2. במבחנה מדידות pH

  1. במבחנת הכיול להכין 500nm פתרון של dendrimer ב PBS (פוספט 2 מ"מ) בקובט קוורץ. השימוש בחיץ מאוד לדלל PBS (2 מ"מ), כדי למנוע שינויים פתאומיים של pH בטיטרציה מומלץ.
  2. מדוד את ספקטרום הפליטה של ​​והעמסת (exc 488 ננומטר) ות.מ. ר (exc 550 ננומטר) ולמטב את הגדרות אופטיות של fluorimeter כדי להשיג יחס אות לרעש טוב.
  3. בצע טיטרציה pH על ידי הוספת כמויות קטנות של 0.1 NaOH N ונ 'HCl 0.1 לאחר כל תוספת לנער את קובטלערבוב, חכה 1 דקות לאיזון ולמדוד את רמת החומציות באמצעות microelectrode-pH. ספקטרום פליטה של ​​והעמסת וTMR צריך להיות מוקלט על כל צעד ללא כל שינוי בהגדרות אופטיות.
  4. מגרש את עוצמת הקרינה לעומת pH לטיטרציה. אות rhodamine צריכה להיות מושפעת מרמת חומציות (<10%). האות והעמסת צריכה להיות עקומת sigmoidal וצריכה להיות מצוידת עם מודל יחיד מחייב עם pK = 6.4.

3. תא תרבות וElectroporation

  1. טפח את תאי הלה במדיום שונה Dulbecco הנשר (DMEM) בתוספת 10% בסרום שור העובר ו100 פניצילין U / ml, ו100 מ"ג / מיליליטר סטרפטומיצין (Invitrogen). שמור על תרבות תאים על 37 מעלות צלזיוס באווירת humidified 5% CO 2.
  2. עבור electroporation dendrimer, כאשר תאי מחוברות, הסר את המדיה ולשטוף תאים באמצעות DPBS (פוספט שנאגר מלוח של Dulbecco). הסר את DPBS ולהוסיף טריפסין-EDTA. לנטרל את Trypלחטוא על ידי הוספת סרום בינוני המכיל אך לא אנטיביוטיקה. צנטריפוגה ב900-1,200 סל"ד במשך 2 דקות בטמפרטורת חדר. הסר את המדיה ולשטוף את כדורים באמצעות DPBS.
  3. ספירת התאים ולקחת 4 * 10 6 תאים. צנטריפוגה ב1,200-1,500 סל"ד במשך 2 דקות בטמפרטורת חדר.
  4. Resuspend התא גלולה ב μl 200 של חיץ microporation (המסופק על ידי יצרן microporator) ולהעביר את תאים לצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר.
  5. הוספת תמיסה מימית dendrimer לתוך תאים מושעים. כמות dendrimer נדרש לדגימה היא תלויה בסוג Pamam (בדרך כלל 250 ננומטר עבור קטיוני ו2 מיקרומטר לdendrimers הניטרלי).
  6. הוסף חוצץ electroporation (המסופק על ידי יצרן microporator) בצינור microporation. פיפטה את התאים וdendrimers תערובות עם קצה electroporation של 100 μl בגודל נפח. הכנס את פיפטה microporator לתחנת פיפטה. הגדר את המצב הדופק לmicroporation: מתח דופק = 1,005 V; wid דופקה = 35 אלפיות שנייה; דופק מספר = 2.
  7. אחרי תאי העברת דופק לצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר ו צנטריפוגות תאים 5 דקות ב1,200 סל"ד כדי להסיר את עודף dendrimer במדיום. צלחת 10 μl של תאי electroporated על גבי זכוכית תחתונה מנות 35 מ"מ (GWSt-3522 WILLCO צלחת) עם מדיום חדש w / o אנטיביוטיקה.

4. חישה pH בתאים חי הלה

  1. תאי תמונה עם מיקרוסקופ 12 שעה confocal לאחר electroporation.
  2. ניתן להשתמש בו להגדיר מסנן סטנדרטי ולהעמסה וrhodamine. אם מסננים מתכונן הם סט זמין ערוץ ירוק 500-550 ננומטר ומסלול אדום מ580 ננומטר ל650 ננומטר. עירור ב 488nm הוא אופטימלי להעמסה תוך rhodamine יכולה להיות צילמה גם עם 543nm או קו הלייזר 561.
  3. דגש על הדגימה ולהתאים את כוח לייזר וגלאים לזכות למקסם את יחס אות לרעש. אם electroporation היה תאים מוצלחים צריכים להיות ניאון בהיר בשני הערוצים.לוקליזציה תלוי בגודל ואחראי על dendrimer בשימוש. לעתים קרובות כמה לוקליזציה lysosomal (שלפוחית ​​perinuclear קטנה) היא הווה בשל אנדוציטוזה או מידור. רעילות ומדידה אם לוקליזציה lysosomal הוא השולט, כלומר רוב הקרינה הוא מקומי בתוך שלפוחית ​​ואות עניות הוא ציינה בcytosol, מסמן צריכה להיות מושלכת. לרכוש ברצף שני ערוצים, אם יש צורך כמה תמונות לרכוש וממוצע התמונות כדי לשפר את איכות תמונה.
  4. לחומציות תא מהדק כיול באמצעות מאגרים עם יונופורים ב-pH שונה ולרכוש לפחות 20 תאים לכל pH כפי שתוארה לעיל. לתיאור מפורט של ההליך ואת ההרכב של המאגרים עיינו Bizzarri ועמיתים לעבודה. 16 אנו מציעים למדוד לפחות 5 נקודות מpH = 5.5 ל-pH = 7.5. pH מתחת ל -6 הם רעילים לתאים, אך נסבל לזמן קצר, אנו ממליצים לרכוש את התמונות מהר ככל האפשר. אם תאיםמראה סימנים של אפופטוזיס, לבטל את התאים ולהפעיל מחדש.
  5. השתמש ImageJ או תוכנה מקבילה לניתוח נתונים. ייבא את התמונות של הערוץ הירוק ואדום, לחסר רקע וליצור פיקסל על ידי הדמיה יחס פיקסל עם האפשרות "מחשבון תמונה".
  6. צייר אזור של עניין (ROI) בחירת התא הרצוי ולמדוד את היחס הירוק לאדום תוך תאיים. לנתח את כל התמונות שנרכשו ולאחר מכן לתכנן את היחס מול ה-pH. בטווח 5.5-7.5 המגמה צריכה להיות ליניארי. נכון ליניארי של הנקודות שהושגו ייתן את עקומת הכיול שישמש להמרת יחס ירוק לאדום לחומציות.
  7. כבקרה נוספת לרכוש כמה תאים שלא טופלו (אין יונופורים) ומנסה לחשב pH עם עקומת הכיול שהושגה. יש לקבל ערך בין 7.2 ו7.4.

5. בVivo לדוגמא הכנה

  1. ניסויים בוצעו על C57BL/6J (זכרים ונקבות) בין ד לאחר הלידהאיי 28 ו70. הרדים את העכבר עם זריקת intraperitoneal של Urethane (כלומר אתיל carbamate) (20% w / v בתמיסת מלח פיסיולוגי, 20 מ"ג / urethane ק"ג). בעלי חיים הוקרבו לאחר ניסוי עם מנת יתר של urethane ואחרי הזרקת intracardiac מאותו חומר ההרדמה.
  2. לבצע זריקה תוך שרירית של נתרן זרחה dexamethasone (2 מ"ג / קילוגרם משקל גוף) כדי להפחית את תגובת לחץ בקליפת המוח ובצקת מוחית במהלך הניתוח.
  3. לגלח את ראשו של בעל החיים ולהחיל 2.5% ג'ל לידוקאין לקרקפת.
  4. השתמש במספריים כדי לחתוך את קפל עור המכסה את הגולגולת של שני ההמיספרות
  5. שטוף את העצם החשוף עם מי מלח ובעדינות להסיר את קרום העצם באמצעות מלקחיים. זה יספק בסיס טוב יותר לדבק ומלט שיניים לדבוק בו.
  6. החל הודעה ראש פלדת מחוייט עם חדר הדמיה מרכזי ולהדביק אותו עם cyanoacrylate במטוס כ מקביל עם הגולגולת מעל האזור בקליפת המוח של interest ולתקן אותה במקום עם מלט לבן שיניים (Paladur).
  7. לתקן את הראש של העכבר על מנת לבצע את פתיחת גולגולת של 2-3 מ"מ בקוטר קדח מעל האזור של עניין.
  8. נסה למזער את החימום של קליפת המוח במהלך ניתוח, דמעות dural, או דימום.
  9. שמור את הקליפה superfused עם ACSF סטרילי (126 mM NaCl, 3 מ"מ KCl, 1.2 מ"מ KH 2 PO 4, 1.3 מ"מ MgSO 4, 26 מ"מ NaHCO 3, 2.4 מ"מ CaCl 2, 15 גלוקוז מ"מ, 1.2 HEPES מ"מ במזוקק H 2 O , PH = 7.4).

6. ההדמיה pH במוח העכבר

  1. במהלך הנשימה Animal Aid ניסוי מתן O אוויר מועשר-2. חמצן מועשר עד 80%. O 2 לחץ וזרימה חלקיים לעתים קרובות מותאם לקבלת סיוע נשימה נכונה. שמור על טמפרטורה קבועה בגוף על 37 מעלות צלזיוס בשמיכת חימום משוב מבוקרת.
  2. תקן את בעלי החיים באמצעות דואר הפלדה תחת המטרה של שתי תמונותהתקנת ההדמיה n.
  3. כדי להזריק את החיישן בקליפת המוח לטעון פיפטה זכוכית המכילה אלקטרודה AgCl (קוטר קצה 4 מ"מ) עם פתרון dendrimer (1 מיקרומטר). האלקטרודה תאפשר להקליט פוטנציאלים בתחום תאיים.
  4. עם התקנת microinjection להכניס את פיפטה בקליפת המוח בכ 150 עומק מיקרומטר. הזרק ל1-2 דקות בלחץ של 0.5 psi.
  5. לייעל את ההתקנה האופטית להדמיה. כוח הלייזר צריך להיות מותאם כדי למזער photobleaching וניזקים. בדרך כלל כוח הלייזר המועסק הוא בסביבות 20 mW ורווח PMT נשמרו קבועים ב667 V מאז הכיולים הקודמים הראו כי מתח זה נותן יחס S / N הטוב ביותר.
  6. הדמיה להלהיב את החיישן ב820 ננומטר ולזהות בו זמנית והעמסת וקרינת rhodamine דרך מסנני FITC וTRITC סטנדרטיים.
  7. לזמן מדידות נפתרו סדרת זמן לשגות לרכוש ב2 הרץ.
  8. לתיקון רקע לרכוש מסגרת כהה עם laseתריס r סגור כדי למדוד את הרעש התרמי הממוצע הנובע בPMTs והכן מתווסף בדרך כלל על ידי האלקטרוניקה.
  9. לניתוח נתונים לבצע את אותו ההליך שדווח בסעיף 4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 1 מציג ייצוג סכמטי של נטיה של חישת צבעים לפיגומים הדנדריטים שונים. ניתן להשיג אינדיקטורים וכתוצאה מכך צעד סינטטי קל אחד ממוצרים זמינים מסחרי. dendrimers אמין נושאות הם הגיבו בצבעים הופעלו-NHS בDMSO ומטוהר על ידי דיאליזה. נוהל כללי זו כבר שימש בהצלחה עבור תיוג של מספר dendrimers: i) dendrimer Pamam דור 2, 4 ו -6; 12 dendrimers pegylated Pamam 17 וכלאיים PEG-הדנדריטים 18. כdendrimers הברור להראות אינטראקציות שונות עם תאים ורקמות (לוקליזציה, רעיל, חדירות, דיפוזיה) את הבחירה של המבנה הדנדריטי קשורה מאוד ליישום הרצוי והדגימה של עניין.

החיישנים מורכבים משני סטים של צבעי ניאון: i) אינדיקטורים pH וii) moieties pH-רגיש פועל אזכור פנימי. Although מגוון רחב של אינדיקטורים והפניות זמינים, את התוצאות הטובות ביותר הושגו עם והעמסת וtetramethylrhodamine. היחס של שני הצבעים יכול להיות מכוון פשוט באמצעות שווה טוחנת שונה בתגובה. איור 2 מראה טיטרציה טיפוסית במבחנה של חיישן ה-pH. העמסה וrhodamine יכולים להיות נרגשת בנפרד ב488nm ו550nm, בהתאמה, המאפשרים לדבר צולבות מינימליות בין שני הערוצים. כפי שניתן לראות באופן ברור, והעמסת (איור 2 א) מראה התנהגות pH תלוי בזמן שאות (איור 2 א) rhodamine אינה משתנה באופן משמעותי בטווח pH הפיזיולוגי. לכן, היחס בין שני אותות אלה אינו תלוי בריכוז חיישן אלא רק על ה-pH. עצמאות ריכוז זה תהיה חשיבות רבה למדידות ביולוגיות כריכוז בדיקה תאית לא יכול להיות נשלט.

למדידות תאי חיים סופיתמשלוח acellular של החיישנים הדנדריטים מושגת באמצעות electroporation. טכניקה זו נעשתה שימוש נרחב בביולוגיה לtransfection-DNA ויכולה להיות מיושמת עם וריאציות מינימליות על הפרוטוקול של היצרן. באמצעות electroporation, מקרומולקולות יכולה להיות מועברת אל הציטופלסמה ישירות, להימנע מכל סיבוך הקשורים למערכת ועי של אנדוציטוזה. איור 3 א מציג תמונות confocal של תאי הלה electroporated עם חיישני dendrimer. איתות חזקה בשתי והעמסת (ירוק, משמאל) וrhodamine (אדום, באמצע) הוא ציין. שני אותות colocalize מושלם להדגים את שלמות מבנה החיישן. מפת ratiometric הוא שוחזר על ידי חלוקת שני תמונות פיקסל אחר פיקסל ומיוצג עם קנה המידה pseudocolor (איור 3 א, מימין). עם יונופורים מהדק-pH בוצע, על מנת לכייל את תגובת החיישן בתוך תאים. כיול עם יונופורים הוא פרוטוקול, seve מבוסס היטבפרוטוקולי RAL כבר תוארו בהרחבה וניתן להשתמש בם בלי שינויים. 19 מחוונים בקלות להגיב על pH עם שינוי של היחס הירוק לאדום, כפי שמוצגים באיור 3 ב. זה אפשר לנו להשיג עקומת כיול (איור 3c) למדידות pH מדויקות. המגמה ליניארי בכיול מדגימה את יכולתו של החיישן להגיב לpH ללא הפרעה כלשהי מהסביבה הסלולרית. עקומת הכיול נעשתה שימוש כדי לקבוע את ערך ה-pH של תאי חיים הלה להיות 7.4 ו4.8 לציטופלסמה וlysosomes, בהתאמה. תוצאות אלו הן בהסכם טוב עם הספרות.

לבסוף, אנו מראים כיצד יכולים להיות מועסקים חיישנים מבוססי dendrimer לin vivo הדמיה. ניתן להזריק Dendrimers בקלות דרך הרקמות עם הליך דומה מאוד למדדי סידן שימוש נרחב. 20 רגע ברקמה, אינדיקטורים מפוזר מאוד לאט, allowinהדמיה לטווח ארוך גרם לפני ניקוז רקמה שלם. תוצאות אופייניות מוצגות באיור 4. והעמסת (ירוק) וrhodamine אותות (אדום) התקבלו בו זמנית עם 820 עירור ננומטר ומפת היחס נבנתה על בסיס פיקסל אחר פיקסל, דומה לחיות מדידות תאים. יש לציין, אינדיקטורים למקם במרחב תאי; האזורים שאינם ניאון בתמונה זיהוי גופות סלולריות או כלי דם קטנים. על מנת לאמת את תגובת חיישן ה-pH, שהצענו את השימוש בhypercapnia. ואכן, פחמן דו חמצני ידוע כדי לשנות את שיווי המשקל של מאגרי קרבונט בדם וברקמות, וכתוצאה מהחמצה של הרקמות. 21 כפי שמוצגים באיור 4 ב, שאיפה של 30% CO 2 היא מספיק כדי לגרום לתגובה חזקה של חיישן זה הוא לחלוטין הפיך על מחדש אוורור של העכבר. תוצאות אלו מראות את הפוטנציאל של חיישנים מבוססי dendrimer כדי להדגיש פיסיולוגי ורשותשינויי thological של ה-pH בתאים חיים וin vivo.

איור 1
איור 1. סינתזה של חיישנים מבוססי dendrimer ייצוג סכמטי של חיישן ה-pH מבוסס dendrimer. אותו ההליך ניתן ליישם כמעט בכל dendrimer אמין נושאות (משמאל). המוצר הושג באמצעות תגובת נטיה אחת ואחרי דיאליזה. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.

איור 2
איור 2. טיטרציה pH במבחנה לחיישן מבוסס dendrimer. א) תגובה של העמסת אינדיקטור pH ו-B) iהתייחסות nternal, rhodamine, לא מראה שינוי לאורך טווח pH הפיזיולוגי.

איור 3
איור 3. נציג תוצאות של ההדמיה pH בתאים חי הלה. א) ההדמיה confocal של ערוץ והעמסת (משמאל), ערוץ rhodamine (באמצע) ומפת ratiometric pH (מימין). ב) כיול pH עם יונופורים. ג) מפות ratiometric נציג של תאים הידקו ב-pH שונה. אינדיקטורים פלורסנט dendrimer מבוסס לשכפל מאלברטאזי L, M BRONDI, Pavan GM, סאטו SS, et al (2011):... במבחנה וביישומי Vivo PLoS ONE 6 (12), e28450. doi: 10.1371/journal.pone.0028450

איור 4
איור 4. ההדמיה pH במוח של עכבר בהרדמה. א) ערוץ ירוק ואדום (בו זמנית נרגש ב820 ננומטר) ומפת ratiometric pH. ב) תגובה טיפוסית של החיישן לhypercapnia (30% CO 2). מעובד מתוך:. לשכפל מאלברטאזי L, M BRONDI, Pavan GM, סאטו SS, et al (2011) אינדיקטורים פלורסנט dendrimer מבוסס:.. במבחנה וביישומי Vivo PLoS ONE 6 (12), e28450. doi:. 10.1371/journal.pone.0028450 לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השלבים הקריטיים עבור הדמיה pH מוצלחת עם חיישנים מבוססי dendrimer הם: א) הבחירה של פיגום הדנדריטים הנכון ומספר אינדיקטורים מצומדת אליו וii) אופטימיזציה של פרוטוקול מסירה חיישן בתאים או בגוף חי.

ההליך הסינתטי הוא קל למדי וניתן ליישם כמעט על כל פולימר hyperbranched נושאות אמין. ניתן להשיג החיישנים מdendrimers זמין מסחרי וצבעים הופעלו-NHS בצעד אחד. אנו מאמינים כי הליך מודולרית וברור שזה יהיה מועיל עבור היישום נוסף של חיישנים כאלה עבור מגוון רחב של שאלות ביולוגיות. טיהור יכולה להיות מושגת בצורה יעילה על ידי דיאליזה כדי להסיר את צבעי unconjugated. הבחירה של הפיגום הדנדריטים היא קריטית ותלויה ביישום הספציפי הרצוי. dendrimers שונה הוכחו לי מגוירים מוזר בתוך תאים בשל אינטראקציות ספציפיות עם יםמבני ubcellular. dendrimers הניטרלי (למשל acetylated G4 Pamam) לא מראה שום אינטראקציה בתוך תאים ולהראות לוקליזציה מפוזרת. לכן הם מייצגים בחירה טובה עבור הדמיה כל התא. אדרבא מטען חשמלי חיובי dendrimers בני דורות שונים (מG2 לG6) אינטראקציות אלקטרוסטטיות תצוגה עם מטען שלילי ביומולקולות (כלומר RNA) וכתוצאה מכך הלוקליזציה תאית ספציפית. dendrimers קטיוני הם כך אידיאלי להדמית אברון הספציפי.

הבחירה של צבעי החישה היא קריטית. אינדיקטורים אחדים pH וצבעי pH-רגיש עם פליטת צבע שונה וזיקה H + (PK) הנן זמינים. ניסינו שילובי צבע שונים ואת התוצאות הטובות ביותר התקבלו עם העמסה וtetramethylrhodamine. הצמד הזה נותן מענה טוב לחומציות בטווח הפיזיולוגי (PK = 6.4) והוא תואם את הגדרות מסנן מיקרוסקופית נפוצות. לדרישות שונות, כמו מדידהים בטווח pH שונה, ייתכן שיידרש כמה אופטימיזציה. יש לציין, שלא כל האינדיקטורים לשמור על תכונותיהם (בהירות, PK) על נטיית dendrimer 5 התנהגות זו תלויה גם בצבע ומבני dendrimer;. לעומת זאת, היינו יכול לדווח על מספר אינדיקטורים שבו מאפייני photophysical האינדיקטורים אינם מושפעים באופן משמעותי. 17 אם זה המקרה אנו ממליצים להטות הצבעים באמצעות מקשר על מנת למזער אינטראקציות dendrimer צבען. כמה צבעים תגובתי הם זמינים מסחריים עם מפרידי אלקיל 22 או בlinkers PEG החלופית ניתן להשתמש. גם מספר אינדיקטורים וצבעי יחס אינדיקטורים להפניה על הפיגום הוא חשובים. היחס האידיאלי תלוי ברגישות הספקטרלית של ההתקנה מיקרוסקופית המשמשת ועל הדגימה הביולוגית של 5,17 ריבית. אם כי ייתכן שתהיה צורך בכמה בעיות, ההליך הסינתטי מאוד קל ומהיר יסייע לתהליך באופן משמעותי. לבסוףמידת functionalization של dendrimer, כלומר אחוז מקצה קבוצות של dendrimer שמצומדת לצבעים, יכולה להשפיע על הביצועים של המדדים. כדי למנוע כל בעיה מסיסות אנו מציעים functionalizing% על 10 -20% מקבוצות קצה dendrimer. במקרה של dendrimers pegylated עם זאת, בשל תרומת PEG למסיסות, ניתן להשיג functionalization מלא. זה יכול גם להגביל את הנוכחות בלתי רצויה של סריג ותופעות מרווה אחרות בין הצבעים מצומדות.

Dendrimers הוא לא תא חדיר, אבל משלוח תאיים יכול להיות המושג באמצעות electroporation. אנחנו עובדים בפרוטוקול יצרנית ה-DNA transfection לשורת התאים של עניין בלי שינויים נוספים. פרמטר מכריע הוא הריכוז של dendrimer במאגר electroporation; בפרט במקרה של אינדיקטורים עם בהירות או dendrimers כי בריכוזים גבוהים יכולה להיות רעיל לתאים עניים. conce נמוךntrations של dendrimer יגרום לאות עניות בתוך תאים תוך ריכוזים גבוהים יגרמו לרעילות ולגרום למוות של תאים. הריכוז האידיאלי תלוי בזוג dendrimer / המחוון, כמו גם על התקנת ההדמיה זמינה ואולי צריך קצת אופטימיזציה. אם electroporator אינו זמין במעבדה, microinjection יכול לייצג אלטרנטיבה חוקית. עם זאת, מדובר בטכניקת תא בודד ואהפוך את רכישת מספר משמעותי של תאים צילמו מייגע יותר.

הליך ההדמיה חיישנים הוא מאוד גמיש וניתן להתאים בקלות לכמה setups מיקרוסקופיה. אנחנו קודם לכן דיווחו על השימוש בחיישנים במערכת confocal עם מסננים מתכונן acusto אופטי 5,17 אבל מערכות סינון FITC / TRITC סטנדרטיות יכול לשמש גם. כאשר ריכוז תאיים אופטימלי מתקבל, ההדמיה pH היא פשוטה. אנו מציעים אופטימיזציה של עוצמת לייזר, חריר וגלאים להשיג על פני טווח גדול של תאיים חיישןריכוזים לפני הפעלת כיול pH עם יונופורים. אם אותה תוכנית ההתקנה מיקרוסקופיה משמשת באותם תנאי הכיול יוכל לשמש עבור כל הניסויים. כאן אנו מציעים הדמיה ratiometric כדי למנוע תלות ריכוז חיישן וחפצים. עוד מתודולוגיה מעניינת כדי להשיג את זה מיוצגת על ידי בדיקות המבוססים על חיים הראו כבאלגנטיות על ידי וינוגרדוב ועמיתים לעבודה 15 וגם יתרונות וחסרונות אפשרויות תצוגה. מדידות לכל החיים לא דורשות שום תיקון כפי שהם נהלי ריכוז עצמאי וכיול מהותי הם לעתים קרובות קלים יותר ויציבים יותר. יתר על כן, צבע אחד משמש הימנעות הסיבוכים והסטייה האפשרית הנגרמת על ידי ההדמיה ratiometric הירוקה לאדום. אולם רק כמה בדיקות לכל החיים יעילים זמינות בעוד מגוון רחב של בדיקות המבוססת על עוצמתם באופן מסחרי נגיש. הציוד הדרוש להדמית ratiometric הוא פשוט וסביר יותר שזמין כבמתקן מיקרוסקופית tandard. מדידות חיים מעבר לכך הן מיסודם איטיים ולא יכולות להיות מיושמות על פי תהליכים ביולוגיים מהירים. לכן הבחירה בין שתי הטכניקות הללו מאוד תלויה במכשור זמין ועל התהליך הביולוגי הספציפי של עניין.

למרות מושגית דומה, in vivo ההדמיה היא מאתגרת יותר מאשר בתרבית התאים. יחס אות לרעש היא מופחתת על ידי פיזור והאינטראקציות עם הרקמות יכולות להשפיע על התגובה של החיישן. יתר על כן, דיפוזיה דרך הרקמה וכך דליפה של המחוון מהאזור של עניין מייצגים סוגיה נוספת אינו נוכחת למדידות תאיים בתרבות. מסיבות אלה, הבחירה של המחוון היא קריטית. בעוד עבור מדידות תאיים רוב dendrimers עובדים מצוין (G4, G4-Ac, G6, כלאיים Pamam-PEG), לin vivo חישה אנו ממליצים על השימוש בdendrimers pegylated. 17 Indeed ארכיטקטורה זו היא יעילה במיוחד למטרה זו מכמה סיבות: א) PEG להגדיל את גודל dendrimer ומפחית את הזליגה שלו מהרקמות; ii) מקשר PEG ממזער את מרווה כתוצאה מצבען צבע ולצבוע-dendrimer אינטראקציות ו iii) PEG מגן צבעים מרקמת הימנעות אובדן התפקוד נצפה לעתים קרובות לאחר הזרקת רקמות של חיישנים. איכות חישת pH מאוד תלויה בזריקה המוצלחת של כמות מספקת של dendrimer ברקמות. כאשר זו מושגת הליך ההדמיה וניתוח נתונים דומים למה שכבר נמסר לתרבית התאים. זוהי הפגנה ברורה של יעילות חיישן in vivo והוא יכול לשמש כבקרה פנימית של פעילות מחוון לפני כל מדידה.

אנו מאמינים כי תוצאות אלו יחד עם הנהלים מפורטים שדווחו בעבודה זו תאפשר היישום של חיישנים מבוססי dendrimer כדי להדגיש את החינוך גופנישינויי iological ופתולוגיים של ה-pH בתאים חיים וin vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ברירת מחדל: יש לי מחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

דיונים מועילים עם Isja דה Feijter ומאט בייקר הם הודה בהכרת תודה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PAMAM G4 Sigma-Aldrich 412449
Carboxyfluorescein NHS ester Life technologies C-1311
TMR NHS ester Life technologies C-1171
DMSO Sigma-Aldrich D8418
Dyalsis bags Spectrum Labs 132117
WillCo Dishes WillCo Wells GWSt-3512
Urethane Sigma-Aldrich U2500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Giepmans, B. N. G., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The Fluorescent Toolbox for Assessing Protein Location and Function. Science. 312 (5771), 217-224 (2006).
  2. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. The Journal of biological chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
  3. Han, J., Burgess, K. Fluorescent indicators for intracellular pH. Chemical reviews. 110 (5), 2709-2728 (2010).
  4. Silver, R. A., Whitaker, M., Bolsover, S. R. Intracellular ion imaging using fluorescent dyes: artefacts and limits to resolution. Pflügers Archiv: European journal of physiology. 420 (5-6), 595-602 (1992).
  5. Albertazzi, L., Storti, B., Marchetti, L., Beltram, F. Delivery and Subcellular Targeting of Dendrimer-Based Fluorescent pH Sensors in Living Cells. Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18158-18167 (2010).
  6. Lee, C. C., MacKay, J. A., Fréchet, J. M. J., Szoka, F. C. Designing dendrimers for biological applications. Nature Biotechnology. 23 (12), 1517-1526 (2005).
  7. Lee, C. C., Gillies, E. R., et al. A single dose of doxorubicin-functionalized bow-tie dendrimer cures mice bearing C-26 colon carcinomas. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (45), 16649-16654 (2006).
  8. Caminade, A. -M., Turrin, C. -O., Majoral, J. -P. Dendrimers and DNA: combinations of two special topologies for nanomaterials and biology. Chemistry (Weinheim an der Bergstrasse, Germany). 14 (25), 7422-7432 (2008).
  9. Rakow, N. A., Suslick, K. S. A colorimetric sensor array for odour visualization. Nature. 406 (6797), 710-713 (2000).
  10. Armada, M. P. G., Losada, J., Zamora, M., Alonso, B., Cuadrado, I., Casado, C. M. Electrocatalytical properties of polymethylferrocenyl dendrimers and their applications in biosensing. Bioelectrochemistry (Amsterdam, Netherlands). 69 (1), 65-73 (2006).
  11. Finikova, O., Galkin, A., Rozhkov, V., Cordero, M., Hägerhäll, C., Vinogradov, S. Porphyrin and tetrabenzoporphyrin dendrimers: tunable membrane-impermeable fluorescent pH nanosensors. Journal of the American Chemical Society. 125 (16), 4882-4893 (2003).
  12. Albertazzi, L., Serresi, M., Albanese, A., Beltram, F. Dendrimer internalization and intracellular trafficking in living cells. Molecular pharmaceutics. 7 (3), 680-688 (2010).
  13. Albertazzi, L., Mickler, F. M., et al. Enhanced bioactivity of internally functionalized cationic dendrimers with PEG cores. Biomacromolecules. , (2012).
  14. Albertazzi, L., Fernandez-Villamarin, M., Riguera, R., Fernandez-Megia, E. Peripheral Functionalization of Dendrimers Regulates Internalization and Intracellular Trafficking in Living Cells. Bioconjugate chemistry. , (2012).
  15. Sakadzić, S., Roussakis, E., et al. Two-photon high-resolution measurement of partial pressure of oxygen in cerebral vasculature and tissue. Nature. 7 (9), 755-759 (2010).
  16. Bizzarri, R., Arcangeli, C., et al. Development of a novel GFP-based ratiometric excitation and emission pH indicator for intracellular studies. Biophysical journal. 90 (9), 3300-3314 (2006).
  17. Albertazzi, L., Brondi, M., et al. Dendrimer-based fluorescent indicators: in vitro and in vivo applications. PloS one. 6 (12), e28450 (2011).
  18. Amir, R. J., Albertazzi, L., Willis, J., Khan, A., Kang, T., Hawker, C. J. Multifunctional Trackable Dendritic Scaffolds and Delivery Agents. Angewandte Chemie International Edition. 50 (15), 3425-3429 (2011).
  19. Arosio, D., Ricci, F., Marchetti, L., Gualdani, R., Albertazzi, L., Beltram, F. Simultaneous intracellular chloride and pH measurements using a GFP-based sensor. Nature methods. 7 (7), 516-518 (2010).
  20. Brondi, M., Sato, S. S., Rossi, L. F., Ferrara, S., Ratto, G. M. Finding a Needle in a Haystack: Identification of EGFP Tagged Neurons during Calcium Imaging by Means of Two-Photon Spectral Separation. Frontiers in molecular neuroscience. 5, 96 (2012).
  21. Ziemann, A. E., Schnizler, M. K., et al. Seizure termination by acidosis depends on ASIC1a. Nature neuroscience. 11 (7), 816-822 (2008).
  22. Molecular Probes Handbook, A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. , 11th, (2010).

Tags

כימיה גיליון 79 טכניקות חקירה כימיה וחומרים (כללי) dendrimer הקרינה חיישנים pH משלוח confocal
סינתזה, משלוח נייד ו<em&gt; בvivo</em&gt; יישום של חיישני pH מבוססי dendrimer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Albertazzi, L., Storti, B., Brondi,… More

Albertazzi, L., Storti, B., Brondi, M., Sulis Sato, S., Michele Ratto, G., Signore, G., Beltram, F. Synthesis, Cellular Delivery and In vivo Application of Dendrimer-based pH Sensors. J. Vis. Exp. (79), e50545, doi:10.3791/50545 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter